骨关节炎患者骨髓间充质干细胞的功能状态与病情进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1495-1500.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.004

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骨关节炎患者骨髓间充质干细胞的功能状态与病情进展

王治洲¹，徐超¹，韩亚军¹，帖小佳²，郭洪亮¹，伊力哈木•托合提¹，王军锋³，闫斌¹，毕晓娟⁴，关振鹏⁵

¹新疆医科大学第二附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830063；²保定市第二中心医院，河北省保定市 072750；³北京大学国际医院，北京市 102206；⁴新疆医科大学第一附属医院干细胞室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；⁵北京大学人民医院，北京市 100044

出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
通讯作者: 关振鹏，主任医师，教授，北京大学人民医院，北京市 100044
作者简介:王治洲，男，1989年生，新疆维吾尔自治区石河子市人，回族，新疆医科大学在读硕士，主要从事骨创伤、运动医学方面的研究。
基金资助:
自治区科技支疆项目计划(引导性)项目(200991265)：骨关节炎患者的间充质干细胞功能状态与病情进展的相关性研究

Functional status of bone marrow mesenchymal stem cells from osteoarthritis patients and disease development

Wang Zhi-zhou¹, Xu Chao¹, Han Ya-jun¹, Tie Xiao-jia², Guo Hong-liang¹, Yilihamu Tuoheti¹, Wang Jun-feng³, Yan Bin¹, Bi Xiao-juan⁴, Guan Zhen-peng⁵

¹Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830060, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Baoding No. 2 Central Hospital, Baoding 072750, Hebei Province, China; ³Peking University International Hospital, Beijing 102206, China; ⁴Division of Stem Cells, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ⁵Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China

Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
Contact: Guan Zhen-peng, Chief physician, Professor, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China
About author:Wang Zhi-zhou, Studying for master’s degree, Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830060, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Scientific Support Plan of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 200991265

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞对骨和软骨在细胞水平的发育和再生至关重要，其数量缺失和功能受损被广泛认为是骨关节炎病因之一。

目的：探讨骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情进展的关系。

方法：2013年7月至2014年10月间收集3组病例，每组10例，分别为对照组、轻度骨关节炎患者组、重度骨关节炎患者组。获取3组患者股骨或胫骨骨髓5 mL分离培养骨髓间充质干细胞，培养至3代时采用CCK-8法检测各组患者骨髓间充质干细胞的增殖能力，成软骨诱导14 d后行甲苯胺蓝染色鉴定，Real time PCR法检测对照组诱导后软骨细胞特征基因Aggrecan、Col2A1的表达。

结果与结论：骨髓间充质干细胞体外培养后贴壁生长，胞浆含有较大的颗粒，核卵圆形，细胞呈多角形、梭形，有多个大小不一的突起，细胞分裂相多见。对照组增殖能力最强，重度骨关节炎患者组增殖能力最弱，但均在培养1周后进入平台期。成软骨诱导14 d后细胞呈多角形、类圆形改变，紫红色异染颗粒分布于胞浆外围。对照组诱导后软骨细胞特征基因Aggrecan、Col2A1有高表达趋势。结果表明骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情严重程度成负相关，其功能状态影响骨关节炎患者的病情进展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨关节炎, 骨髓间充质干细胞, 体外培养, 软骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are crucial for bone and cartilage development and regeneration at a cellular level. Insufficient quantity and functional impairment of bone marrow mesenchymal stem cells is widely considered to be one of osteoarthritis causes.

OBJECTIVE: To explore the relationship between the functional status of bone marrow mesenchymal stem cells and disease progression in osteoarthritis patients.

METHODS: Thirty patients with osteoarthritis were enrolled from July 2013 to October 2014, and divided into control, mild osteoarthritis, and severe osteoarthritis groups, with 10 cases in each group. 5 mL bone marrow from the femur or tibia was extracted from each patient to isolate and culture bone marrow mesenchymal stem cells. Proliferation ability of cells at passage 3 was detected using cell counting kit-8; toluidine blue staining was performed at 14 days after chondrogenic induction; real-time PCR was used to detect the mRNA expression of Aggrecan and Col2A1 in the control group after chondrogenic induction.

RESULTS AND CONCLUSION: After in vitro culture, bone marrow mesenchymal stem cells grew adherently in polygonal and fusiform shape with multiple processes at uniform size. The cytoplasm contained larger particles and the nuclei were ovoid. Most of cells were in cell division phase. The proliferation ability was strongest in the control group and weakest in the severe osteoarthritis group. Cells from the three groups were all at plateau phase after 1 week culture. At 14 days after chondrogenic induction, the cells were polygonal and quasi-circular, and purple metachromatic granules distributed outside of the cytoplasm. The expression of Aggrecan and Col2A1 in the control group displayed an overexpression trend. These findings indicate that the functional status of bone marrow mesenchymal stem cells from osteoarthritis patients is negatively correlated with the severity of disease, which can influence the disease progression in osteoarthritis patients.

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Key words: Osteoarthritis, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Chondrocytes

中图分类号:

R394.2

王治洲，徐超，韩亚军，帖小佳，郭洪亮，伊力哈木•托合提，王军锋，闫斌，毕晓娟，关振鹏. 骨关节炎患者骨髓间充质干细胞的功能状态与病情进展[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1495-1500.

Wang Zhi-zhou, Xu Chao, Han Ya-jun, Tie Xiao-jia, Guo Hong-liang, Yilihamu Tuoheti, Wang Jun-feng, Yan Bin, Bi Xiao-juan, Guan Zhen-peng. Functional status of bone marrow mesenchymal stem cells from osteoarthritis patients and disease development[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1495-1500.

图/表（结果） 5

2.1 镜下观察骨髓间充质干细胞形态原代骨髓间充质干细胞贴壁生长缓慢，镜下成圆球形，24-48 h贴壁细胞逐渐增多，细胞贴壁后逐渐出现梭形、纺锤形，形成集落生长区。12-14 d后基本铺满10 mm培养皿。传代后细胞贴壁较快，24 h后大部分细胞已贴壁，逐渐出现梭形形态，排列更为整齐，增殖速度明显加快，2-8 d细胞可融合达90%以上，可再行传代，见图1。3组骨髓间充质干细胞形态学上无明显区别。

2.2 CCK-8法检测各组细胞增殖情况各组细胞培养至3代后行CCK-8法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力，细胞生长2 d内处于潜伏期，3-5 d进入对数增长期，6 d后进入平台期，细胞铺满孔底，可见对照组吸光能力最强，重度骨关节炎患者组吸光能力最弱，见图2，故推测出对照组骨髓间充质干细胞浓度最大，重度骨关节炎患者组骨髓间充质干细胞浓度最低。

2.3 骨髓间充质干细胞软骨诱导后镜下观察结果诱导24 h后镜下观察骨髓间充质干细胞呈典型长梭形，排列较规则，与诱导前相比，局部形成较多似漩涡状排列区。3 d后可见由长梭形逐渐变为类圆形或多角形，长梭形细胞突起逐渐变短、消失，核浆比例明显减小，排列较前紊乱。14 d后细胞形态无明显变化趋势，见图3。

2.4 骨髓间充质干细胞诱导前后甲苯胺蓝染色镜下观察结果诱导至第6天部分细胞形态呈多角形、类圆形、三角形改变，部分仍保持长梭形。诱导至10天时细胞大部分呈多角形、类圆形、三角形改变，夹杂少许短梭形细胞。诱导14 d，细胞以多角形为主，但也可见夹杂少许短梭形细胞。此时可见散在的紫红色异染颗粒分布于胞浆外围，提示分泌基质中含有大量的糖胺聚糖；而诱导前骨髓间充质干细胞未着色，见图4。

2.5 采用RT-PCR预实验检测对照组诱导前后基因表达情况软骨诱导后较诱导前软骨特征基因(Aggrecan、Col2A1)均有高表达趋势，其中诱导后Aggrecan基因相对表达量约1.25，高于诱导前约1.10，诱导后Col2A1基因相对表达量约1.3，高于诱导前约1.00，见图5。但由于目前检测仅为预实验，无法比较3组患者诱导后基因表达差距，结果有待进一步研究。

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引言

骨关节炎是导致老年人丧失生活自理能力的主要病因之一，当前60岁以上人口的十分之一受到骨性关节炎困扰，其80%患者有一定程度的自主活动受限，25%患者生活不能自理，仅在美国骨关节炎每年造成直接经济费用约600亿美元^[1]。随着人口老龄化时代的开始，它带给社会越来越沉重的生活负担、医疗负担及劳动力损失^[2]。预计到2020年，骨关节炎患者总数会是目前的3倍，相关经济费用更加惊人。虽然近年来进行了大量的科研，但是有关它的病因、发病机制和治疗手段还是不完全清楚^[3]。研究表明骨髓间充质干细胞的功能受损可能是骨关节炎的一种病因^[4]，同时基于骨髓间充质干细胞的细胞疗法也是促进骨关节再生的有效手段^[5]。

骨髓间充质干细胞的缺失和功能受损被广泛认为是骨关节炎病因之一，包括：①骨髓间充质干细胞的数量和活性都随着年龄的增长而减少^[6-8]。②分化能力下降^[4]。③免疫调节功能失常。④干细胞失去对周围调节信号的反应能力。⑤干细胞的微生态环境受到干扰进而引发了功能失调^[9]。这一切也可能是骨关节炎的继发改变，或是长期服用非类固醇抗炎药的结果。虽然已有关于干细胞微环境的体内研究报道，但多局限于低等动物^[10]。

本研究拟探讨骨关节炎患者骨髓间充质干细胞的功能状态与疾病发生、进展的关系，为进一步理解骨关节炎发病机制，建立早期干预和细胞治疗手段，从而提高此病的临床治疗效果提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察和基因表达测定。

时间及地点：于2013年7月至2014年10月在新疆医科大学第二附属医院骨科及新疆医科大学第一附属医院干细胞室和分子生物室完成。

对象：2013年7月至2014年10月在新疆医科大学第二附属医院进行手术治疗患者30例。

对照组：选取关节镜下进行膝关节交叉韧带重建患者10例，经X射线和关节镜检查排除骨关节炎病变。分别在股骨和胫骨钻骨性隧道时冲洗收集骨髓，提取骨髓间充质干细胞，不会对患者造成额外伤害。

轻度骨关节炎组：轻度骨关节炎患者10例(Dougados关节镜法软骨受损程度分级为Ⅰ级^[11])，在陈旧性半月板损伤切除或关节镜下实施软骨下钻孔和微骨折术时，吸取保存少量的骨髓。

重度骨关节炎组：重度骨关节炎患者10例，在膝关节置换时提取骨髓。

骨性关节炎诊断标准：通过X射线测量骨的变化间接反映软骨丢失，其主要观察指标为关节间隙的宽度^[1]。按Kellgren-Lawrence分期，将骨性关节炎分为5级：0级：正常；Ⅰ级：关节间隙可疑变窄，可能有骨赘；Ⅱ级：有明显骨赘，关节间隙可疑变窄；Ⅲ级：中等量骨赘，关节间隙变窄较明显，有硬化性改变；Ⅳ级：大量骨赘，关节间隙明显变窄，严重硬化性病变及明显畸形。将Ⅰ级与Ⅱ级视为轻度骨性关节炎，Ⅲ级与Ⅳ级视为重度骨性关节炎。

所有患者均签署患者知情同意书，详细记录病情。干预及治疗方案获新疆医科大学第二附属医院伦理委员会批准。

方法：

骨髓间充质干细胞的获取及培养：抽取3组患者股骨或胫骨骨髓5 mL，储存于肝素抗凝管内，于冰桶内4 ℃条件下转移至实验室。将骨髓液用3 mL一次性灭菌吸管移入15 mL离心管并加入5 mL PBS，1 500 r/min×5 min离心后，可见底层细胞沉积，仔细用吸管吸取并去除上清液，底层再加PBS离心1遍，弃上清，加入LG-DMEM培养液2 mL(含体积分数为10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)，吹打均匀后移入100 mm培养皿，并在培养皿内加入10 mL LG-DMEM培养液，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度的CO₂孵箱静置培养，48 h后轻摇培养皿并换液(吸出部分悬浮的红细胞)，以后每三四天换液1次(经2次换液后红细胞被吸净，可见皿底的梭形细胞)。

骨髓间充质干细胞传代：待贴壁的细胞长满70%-80%后(10-14 d)用0.25%胰酶1 mL消化，使贴壁细胞消化松解、变圆，然后加入4 mL原液终止消化， 1 500 r/min离心，吸弃上清，再加入1 mL LG-DMEM培养液吹打。细胞吹打均匀后用微量移液器取20 μL于干净塑料纸上并稀释成浓度为原来的1/4，吹打均匀后吸取约15 μL于载玻片上，放于显微镜下计数，最后以6×10⁷ L^-¹细胞浓度接种到100 mm培养皿中，传至第3代细胞进行实验。

细胞数(个/mL)=(四个大格的总数/4)×10⁴×稀释倍数。

CCK-8法检测各组患者骨髓间充质干细胞的增殖能力： ①在96孔板中四周一圈孔(共计36孔)加入PBS，中央60孔加入100 μL第3代细胞悬液[密度(1.0-2.0)× 10³/孔]。将培养板在培养箱预培养24 h(37 ℃，体积分数为5% CO₂)。②向其中5孔加入10 μL CCK-8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响吸光度值的读数)，将培养板在培养箱内孵育1-4 h。③用酶标仪测定 450 nm处的吸光度值，以后重复连测12 d。④记录增殖曲线。

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化： ①选取第2代骨髓间充质干细胞，消化后以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于100 mm培养皿内，细胞贴壁后更换培养液。②待细胞生长至80%融合，加入成软骨诱导液[HG-DMEM培养液+体积分数为10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素+10 μg/L转化生长因子β1+10^-⁷ mol/L地塞米松+ 50 mg/L维生素C+1% ITS-A(含胰岛素6.25 mg/L+转铁蛋白6.25 mg/L +亚硒酸5.35 mg/L)]。③置于37 ℃、体积分数为5% CO₂饱和湿度的孵箱内培养，每三四天换液1次，培养14 d后进行甲苯胺蓝染色。④甲苯胺蓝染色：软骨细胞爬片48 h，PBS冲洗，体积分数为4%中性甲醛固定30 min，1%甲苯胺蓝染色30 min，迅速用无水乙醇漂洗1次，空气干燥，镜下观察可见软骨细胞内呈紫红色异染颗粒，细胞周围有少量异染颗粒出现。

RT-PCR检测Aggrecan、Col2A1基因的表达： Trizol法提取骨髓间充质干细胞总RNA：①取出3组样本，加入1 mL Trizol ，用移液枪吸打混匀后移入1.5 mL离心管中，室温放置5 min。②加入200 μL氯仿，颠倒混匀，室温静置5 min。③4 ℃，12 000 r/min离心15 min。④取上清至另一新的1.5 mL 离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃静置30 min。⑤4 ℃，12 000 r/min 离心15 min，弃上清；加入1 mL 体积分数为75%乙醇(用DEPC水配制)清洗RNA沉淀，混匀。⑥4 ℃，12 000 r/min离心3 min，弃上清保留沉淀，室温干燥2.0-3.0 min。⑦RNase-free H₂O溶解RNA；核酸蛋白定量仪检测RNA浓度、A₂₆₀/A₂₈₀，电泳检测RNA完整性。

反转录反应：反转录反应体系19 μL，包括总RNA (1-5) µg/Conc、5×Frist-Strand Buffer 4 μL、dNTP混合物 1 μL、RNase free H₂O 1 μL、反转录引物1 μL，DTT 2 μL、加Water至19 μL。反应条件：37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，-20 ℃保存cDNA。

实时荧光定量PCR反应：荧光定量PCR反应体系 20 μL，包括2×SYBR Green I Master mix 10 μL、正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、反转录产物1 μL。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min 40个循环。

主要观察指标： ①倒置显微镜下骨髓间充质干细胞形态改变。②骨髓间充质干细胞增殖曲线。③骨髓间充质干细胞成软骨诱导结果。④骨髓间充质干细胞中Aggrecan、Col2A1基因表达情况。

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讨论

正常关节表面由软骨覆盖，它既协助相对关节面滑动，又传导力量减轻震荡。软骨由软骨细胞组成，表层软骨细胞体积较小，形状扁平，中层软骨细胞呈圆形，深层细胞呈椭圆形。在软骨的不同层中，细胞外基质层胶原纤维以不同方式排列，来满足软骨的功能要求。在浅表层，胶原纤维紧密排列并平行于关节面，在中间层，胶原纤维松散且无序排，在深层，胶原纤维较致密地垂直于关节面排列^[12]。

多数骨关节炎的发生都没有一个明确的病因，故称之为原发性骨关节炎。少数情况下它是由于创伤、遗传因素、炎症反应、发育缺陷、代谢或神经异常引起，称之为继发性骨性关节炎。遗传、年龄、肥胖、女性、骨密度过高、关节松弛，即过量的关节负荷都是原发性骨关节炎的危险因素^[1]。骨关节炎通常被认为是异常的力学和生物因素干扰破坏了关节软骨和软骨下骨组织的结构和再生平衡引起的。它表现为细胞及细胞外基质的形态学、生物化学、分子结构和生物力学的改变，以及继发的关节软骨软化、纤维化、溃疡、关节面缺失、关节下骨组织的硬化、象牙化改变、骨刺和骨囊肿的形成。临床症状表现为关节疼痛、压痛、活动受限、捻发音、关节积液、不同程度的炎症反应，但少见全身反应。

目前，就骨关节炎和骨髓间充质干细胞关系研究较多，例如：研究显示年龄增长和女性性别导致骨髓间充质干细胞中成骨细胞前体细胞数量减少^[4]；也有研究显示骨髓间充质干细胞中的总收获量和成骨细胞前体细胞数量不与年龄相关^[13-14]。有报道显示骨关节炎患者的骨髓间充质干细胞的增殖能力和软骨分化能力降低^[6]；也有报道指出骨髓间充质干细胞的软骨分化能力不随年龄而改变，同时不同病因导致的骨关节炎无明显不同^[13]。

以上结果的不一致性可以部分归咎于研究方法和干细胞所处解剖部位的不同^[15]，但更加强调了进一步研究的重要性。另一方面，当前所有有关干细胞与骨性关节炎的科研都没有将患者的病情严重程度、进展状况与骨髓基质干细胞的功能状态联系起来，故难以准确评价干细胞在疾病发展中的作用。

而本实验按不同病情进行分组，通过间充质干细胞的体外培养形态、软骨诱导结果无法区分3组有明显差异，但CCK-8增殖曲线明显表现出组间差异，可见对照组的增殖能力明显高于其余两组，考虑骨关节炎患者骨髓间充质干细胞的增殖能力明显减弱，所以作者推测骨髓间充质干细胞的增殖能力是造成其病情发展的一个重要因素，通过RT-PCR检测软骨特征基因(Aggrecan、Col2A1)在对照组患者诱导前后的表达情况，可见其在诱导后有明显增高趋势，为进一步实验提供有力的理论基础。由于本实验样本数量有限，无法对年龄、性别等方面进行排除，这些因素可能会影响到骨髓间充质干细胞增殖及基因的表达情况，另外实验仅通过Kellgren-Lawrence分期对骨关节炎严重情况进行分组，还需要进一步完善相关研究。

目前本实验仅仅完成了课题部分工作，对于骨髓间充质干细胞的体外培养、软骨诱导及CCK-8增长曲线有了较全面的了解和掌握，但对于RT-PCR基因检测方面还只是初步认识，需要进一步研究，完善组间相关基因表达检测，从而更好的将患者的病情严重程度、进展状况与骨髓基质干细胞的功能状态联系起来，提出更有意义的结论。

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