新等位基因HLA-A*24:233与HLA-A*26:89的分析确认

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.023

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (6): 950-954.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.023

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新等位基因HLA-A24:233与HLA-A26:89的分析确认

刘晓华，迟晓云，焦淑贤

青岛市中心血站输血研究所，山东省青岛市　266071

收稿日期:2015-01-15 出版日期:2015-02-05 发布日期:2015-02-05
通讯作者: 焦淑贤，硕士，主任医师，青岛市中心血站输血研究所，山东省青岛市 266071
作者简介:刘晓华，女，1976年生，山东省潍坊市人，汉族，2003年青岛大学医院毕业，硕士，主管技师，主要从事血型、HLA与免疫遗传研究。
基金资助:
青岛市市南区科技发展计划资助项目(2009-5-21-GG)；青岛市科技发展计划基金资助项目(10-3-3-1-9nsh)

Identification of novel HLA alleles: HLA-A24:233 and HLA-A26:89

Liu Xiao-hua, Chi Xiao-yun, Jiao Shu-xian

The Institute of Blood Transfusion, Qingdao Blood Center, Qingdao 266071, Shandong Province, China

Received:2015-01-15 Online:2015-02-05 Published:2015-02-05
Contact: Jiao Shu-xian, Master, Chief physician, the Institute of Blood Transfusion, Qingdao Blood Center, Qingdao 266071, Shandong Province, China
About author:Liu Xiao-hua, Master, Technician in charge, the Institute of Blood Transfusion, Qingdao Blood Center, Qingdao 266071, Shandong Province, China
Supported by:
the Scientific Development Plan of Shinan District of Qingdao City, No. 2009-5-21-GG; the Science and Technology Development Plan of Qingdao City, No. 10-3-3-1-9nsh

摘要/Abstract

摘要：

背景：分子生物学新技术的发展和大量应用加快了中国发现HLA 新等位基因的步伐。新等位基因的发现不仅给HLA家族增加了新成员，同时也为研究民族或地区的优势基因或消失基因(不适合客观环境的基因)找到了突破点。
目的：确认2个新的HLA等位基因，并分析其核苷酸序列。
方法：应用PCR-SBT、GSSP测序基因分型技术对两份中华骨髓库供者样本进行HLA高分辨分型，发现2个样本HLA-A位点均为异常基因，与已知同源性最高的等位基因型进行序列比对，分析核苷酸序列的差异。
结果与结论：2个样本HLA-A位点与目前已知的相应HLA-A等位基因序列均不一致，样本1与其同源性最高的A*24:02:01的差异表现在第3外显子区域中的第360位碱基由G > C，导致第96位密码子由谷氨酰胺变为组氨酸，样本2与其同源性最高的A*26:01:01比较差异表现在第2外显子区域中第97位碱基由T>C，导致编码的第9位密码子由酪氨酸变为组氨酸。结果表明两个样本为HLA-A位点的新等位基因，已提交GenBank进行注册，并已被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*24:233与HLA-A*26:89。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 新等位基因, HLA, HLA-A*24:233, HLA-A*26:89, 组序列特异性引物

Abstract:

BACKGROUND: The discovery of novel HLA alleles is accelerated by development of molecular biology and applications of numerous new technologies. These new findings not only rich HLA family, but also find a breakthrough point for the study of genetic superiority or disappearance of national gene．
OBJECTIVE: To identify two novel HLA-A alleles and to analysis their nucleotide sequences.
METHODS: The two samples from two volunteers of Chinese Marrow Donor Program were detected using PCR-SBT and GSSP methods. The HLA-A locus in the two samples were both abnormal genes, and the nucleotide sequence differences were analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The sequences of the samples were different from all alleles in the HLA databases. Sample 1 was found to be different from the closet matching allele A*24:02:01 in one nucleotide substitutions, 360 G > C in exon 3, resulting in amino acid changed from glutamine to histidine at codon 96; and sample 2 differed from A*26:01:01 in one nucleotide substitution, 97 T > C in exon 2, resulting in amino acid changed from tyrosine to histidine at codon 9. The novel alleles were identified and assigned the name HLA-A*24:233 and HLA-A*26:89 officially by the WHO Nomenclature Committee.

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Key words: HLA Antigens, Alleles, DNA Primers

中图分类号:

R394.2

刘晓华，迟晓云，焦淑贤. 新等位基因HLA-A*24:233与HLA-A*26:89的分析确认[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 950-954.

Liu Xiao-hua, Chi Xiao-yun, Jiao Shu-xian. Identification of novel HLA alleles: HLA-A*24:233 and HLA-A*26:89[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 950-954.

图/表（结果） 3

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引言

人类白细胞抗原(HLA)是由人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)编码的抗原，是人类基因组中主要的免疫相关基因家族，它不仅作为细胞呈递抗原的T淋巴细胞表面的受体参与免疫反应，而且在同种异体组织器官移植及移植物的急性排斥反应中起重要作用。因此，HLA配型对于器官移植是非常重要的，尤其对于骨髓移植，可靠的HLA基因分型是关系到骨髓移植成败的重要因素。另外HLA基因分型对HLA与疾病相关性研究、群体遗传学研究以及法医学研究等方面也具备重要的应用价值。

人类白细胞抗原(HLA)作为临床移植配型的基础，具有高度的遗传多态性。常规HLA分型检测试剂大部分是根据已知的Ⅰ类抗原基因外显子2、3，Ⅱ类抗原基因外显子2的序列差异设计探针，来区分不同的等位基因。当目的片段为未知的序列时，现有的探针无法识别该序列，而对于新的等位基因序列则只能采用DNA测序的方法。DNA 测序分型采用设计的引物扩增Ⅰ类抗原基因外显子2、3和4，Ⅱ类抗原基因外显子2，对扩增得到的目的片段进行测序，用测序分型软件进行分析判定结果。随着分子生物学技术的迅猛发展，尤其是测序分型技术在国内造血干细胞捐献者资料库的广泛应用，使各实验室人员在了解最真实可靠的DNA序列信息的基础上，能较全面描述HLA基因的复杂性和多样性，同时也为实验室工作人员在HLA新等位基因的发现和鉴定方面提供了强大的技术平台^[1] (http://www. ebi.ac.uk/imgt/hla/)。这些新的等位基因产生诱因千变万化，在诱发因素消除之后这些突变是否持续存在，尚需进一步观察^[2]。通常，只要一个核苷酸改变即可产生一个新的基因序列，即一个新的等位基因，新的等位基因产生新的氨基酸与否要看是否导致氨基酸编码改变，即使是出现新的编码，是否出现新的血清学可识别的抗原，需用血清学方法进一步检测确认。

近几年来，随着HLA测序分型技术在国内造血干细胞捐献者资料库的广泛应用，HLA新等位基因不断被发现。截止到2014年4月共发现了2 735个HLA-A等位基因 (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)^[3-4]。本实验室在对中华骨髓库山东分库供者样本做HLA分型时，发现了2个可能的新等位基因，并经DNA测序证实，于2013年4月被WHO HLA因子命名委员会分别正式命名为HLA-A*24:233 和 HLA-A*26:89，现报道如下。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年7月在青岛市中心血站输血研究所组织配型实验室完成。

对象：发现新等位基因样本源自中华骨髓库供者一，女, 山东青岛籍人，35岁；供者二，女，山东烟台籍人，48岁。参与实验的个体自愿参加，对实验过程完全知情同意，在充分了解本研究的前提下签署“志愿者捐献同意书”。

方法：

血液采集和基因组DNA提取：采集外周静脉血5 mL (EDTA抗凝)，低速(2 000 r/min)离心5 min，取白膜层。采用盐析法提取血液标本全基因组DNA，具体操作步骤参照全血DNA提取试剂盒(Invitrogen DNA Isolation Kit，LOT 035)说明书，-20 ℃保存。

HLA基因分型：用PCR-SBT基因分型试剂盒(上海Invitrogen公司)对HLA-A, B第2-4外显子，DRB1第2外显子进行常规测序分型，操作步骤严格按试剂说明书进行，测序仪为3100Avant Genetic Analyzer(美国，AB公司)，采用自动分析软件SBT uTYPE分型软件判读结果。

GSSP测序：用GSSP(上海Invitrogen公司)对原扩增产物进行再次测序反应，GSSP引物仅特异性与新等位基因序列结合从而得到新等位基因的单链序列。

单链测序：用不同的SSP引物扩增可疑位点，对扩增产物进行电泳，杂合样本会产生两个阳性孔，即得到两个独立的等位基因单链位点全长扩增产物，挑选阳性孔的扩增产物进行测序反应进一步确认新等位基因第2，3，4外显子的序列。单链测序试剂由台湾TBG公司惠赠HLAssure^TM SE SBT Kit，Lot：AB11061K。

主要观察指标：中华骨髓库该供者HLA基因的高分辨分型。

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讨论

HLA基因复合体位于人的第6对染色体的短臂上，全长4 000 kb，约占人类基因组的0.1%。HLA是人类基因组中多态性最高的基因座区域^[3]，自1958年发现人类第1个白细胞抗原HLA-Mac(HLA-A2)^[4]至2014年4月，仅HLA-Ⅰ类等位基因就发现了8 445个(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/) ^[4-11]，其中共有372个HLA-A*24等位基因(A*24:02:01-A*24:281)和139个HLA-A*26等位基因(A*26:01:01-A*26:102)已经被确认。

HLA具有明显的种族性和区域特异性，同一基因型在不同种族和区域分布频率不同。HLA-A*2402是东亚群体中最常见的等位基因之一，尤其在日本(基因频率58.1%)及中国(基因频率32.9%)群体中常见^[12-13]，HLA-A*2402在汉族人中的频率达16.43%，为汉族人第二常见的等位基因型，另外A*24:03，A*24:04，A*24:08 在山东汉族人群中的频率分别为0.058%，0.058%，0.058%。HLA-A*26 在北方汉人中频率为3.42%，HLA-A*2601也是汉族人中常见的基因型之一，基因频率为1.95%^[12-13]。HLA-A*26:02 在山东汉族中频率为0.058%^[4]。

HLA的多态性是由碱基的变化所形成。碱基变化是人体对外适应的一种调节方式，碱基变化最终导致氨基酸的变化，如果发生在抗原肽结合区有可能对功能和抗原有所影响。中国发现的新等位基因中绝大多数为碱基突变，且有氨基酸改变，但绝大部分均无蛋白表达，即使有蛋白表达的也是突变在非编码区，由于氨基酸改变没有发生在重大位置上，所以整体上看对表达和功能的影响较小^[14-18]。

应用SBT常规进行本实验样本的第2，3，4外显子测序时发现其序列与现有数据库中所有数据均不能完全匹配，进一步分析发现样本1第3外显子区域中的第360位碱基由G>C，导致第96位密码子由谷氨酰胺变为组氨酸，样本2第2外显子区域中第97位碱基由T>C，导致编码的第9位密码子由酪氨酸变为组氨酸。Bjorkman等^[19-20]的研究认为HLA-Ⅰ类分子的α1，α2结构域上的5，7，9，22，24，26，57-59，61-77，80-84，95，97，99，114，116，143，145-147，149-152，154-159，161-163，165-167，169和171位点上的氨基酸残基，是直接或间接的抗原识别位点，如果这些位置上的氨基酸残基发生性质改变，会不同程度影响对外源抗原的结合和细胞毒性T淋巴细胞的识别。可能导致抗原构象发生新的变化，引起移植排斥反应。而样本2碱基的改变就位于第9位氨基酸残基。HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)现有的数据显示HLA-A位点第9位氨基酸多态性共有5种，其中1 328个等位基因编码苯丙氨酸，531个等位基因编码酪氨酸，561个等位基因编码丝氨酸，313个等位基因编码苏氨酸，仅有本实验发现的新等位基因A*26:89与2009年发现的A*11:47编码组氨酸，与其余等位基因都不同。根据上述理论推论本实验样本2可能会产生新的抗原构象，这有待于在今后的研究工作中加以确认。第96位氨基酸多态性共有6种，但是与第9位氨基酸多态性特点不同，大部分的HLA-A等位基因都编码谷氨酰胺，只有本实验发现的新等位基因A*24:233及2010年发现的A*01:63编码组氨酸，与其余等位基因均不相同。

HLA新等位基因的发现为HLA基因群组添加了具有种族遗传特异性的新成员^[21-23]，扩大了HLA基因系统的遗传多样性。对正常人群HLA基因多态性的研究，能为不同人群的起源、分化和系统分类提供依据，具有较高的遗传学价值，而且还可以为研究HLA与疾病相关性、亲子鉴定、个体识别以及群体遗传学等提供必需的基本数据。

新等位基因HLA-A24:233与HLA-A26:89的分析确认

Identification of novel HLA alleles: HLA-A24:233 and HLA-A26:89

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