糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (6): 876-882.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.010

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糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响

马浚宁1，2，高俊玮1，2，侯博儒1，任海军1，2，陈四化1，刘吉星1，严贵忠1

1兰州大学第二临床医院神经外科，甘肃省兰州市 730000；2兰州大学生命科学学院，甘肃省兰州市 730000

收稿日期:2015-01-09 出版日期:2015-02-05 发布日期:2015-02-05
通讯作者: 任海军，教授，硕士生导师，主任医师，兰州大学第二临床医院神经外科，甘肃省兰州市 730000；兰州大学生命科学学院，甘肃省兰州市 730000 并列通讯作者：高俊玮，博士，副主任医师，兰州大学第二临床医院神经外科，甘肃省兰州市 730000；兰州大学生命科学学院，甘肃省兰州市 730000
作者简介:马浚宁，男，1990年生，青海省西宁市人，回族，兰州大学第二临床医学院在读硕士，主要从事神经干细胞移植治疗神经系统疾病的研究。
基金资助:
甘肃省自然科学基金(1208RJZA184)

Effect of oxygen-glucose deprivation on the proliferation, differentiation and apoptosis of neural stem cells

Ma Jun-ning1, 2, Gao Jun-wei1, 2, Hou Bo-ru1, Ren Hai-jun1, 2, Chen Si-hua1, Liu Ji-xing1, Yan Gui-zhong1

1Department of Neurosurgery, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; 2Lanzhou University School of Life Sciences, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2015-01-09 Online:2015-02-05 Published:2015-02-05
Contact: Ren Hai-jun, Professor, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Neurosurgery, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Lanzhou University School of Life Sciences, Lanzhou 730000, Gansu Province, China Corresponding author: Gao Jun-wei, M.D., Associate chief physician, Department of Neurosurgery, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Lanzhou University School of Life Sciences, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Ma Jun-ning, Studying for master’s degree, Department of Neurosurgery, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Lanzhou University School of Life Sciences, Lanzhou 730000,Gansu Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：缺氧作为神经系统疾病发展过程中诸多病理因素中最常见的因素之一，对于内源性神经干细胞以及移植后外源性神经干细胞的存活、迁移、分化、凋亡发挥着诸多调控作用。
目的：系统观察糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响。
方法：从新生鼠嗅球分离培养出神经干细胞，建立糖氧剥夺模型，免疫荧光技术检测糖氧剥夺后神经干细胞分化能力，MTT法检测糖氧剥夺24，48 h后恢复正常条件培养对神经干细胞增殖能力的影响，Hochest33258荧光染色检测糖氧剥夺24，48 h后神经干细胞凋亡状况。
结果与结论：第4代神经干细胞CD133免疫荧光鉴定结果呈阳性表达，MTT细胞增殖能力检测结果示：糖氧剥夺组增殖能力明显低于常氧组(P < 0.05)，糖氧剥夺48 h组增殖能力低于糖氧剥夺24 h组(P < 0.05)。GFAP、β-Tubulin Ⅲ细胞免疫荧光染色结果示糖氧剥夺48 h后神经干细胞分化为星形胶质细胞、神经元总数明显低于常氧组(P < 0.05)。Hochest33258染色凋亡率检测结果示糖氧剥夺组细胞凋亡率明显高于常氧组(P < 0.01)，糖氧剥夺48 h组神经干细胞凋亡率显著高于糖氧剥夺24 h组(P < 0.01)。上述结果表明糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡造成不利影响，影响程度取决于缺氧浓度、缺氧时间及自身对于缺氧的耐受性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 神经干细胞, 糖氧剥夺, 嗅球, 增殖, 凋亡, 星形胶质细胞, 神经元, 甘肃省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hypoxia is one of the main pathological factors of nervous system diseases, which plays numerous regulatory roles in survival, migration, differentiation, apoptosis of endogenous neural stem cells and exogenous neural stem cells after transplantation.
OBJECTIVE: To systematically observe the effects of oxygen-glucose deprivation on the proliferation, differentiation and apoptosis of neural stem cells.
METHODS: Neural stem cells were isolated from the olfactory bulb of newborn Kunming mice, to establish oxygen-glucose deprivation models. Immunofluorescence technique was used to determine the differentiation ability of neural stem cells subject to oxygen-glucose deprivation, MTT method was used to measure the proliferative ability of neural stem cells under normoxic conditions after oxygen-glucose deprivation for 24 hours and 48 hours, and Hochest 33258 staining was performed to detect the apoptosis of neural stem cells after oxygen-glucose deprivation for 24 hours and 48 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: Passage 4 neural stem cells were positive for CD133. Compared with the normoxic group, MTT showed that the proliferation of neural stem cells was significantly lower in the oxygen-glucose deprivation group (P < 0.05), moreover, the proliferative ability of neural stem cells was lower in
the 48-hour oxygen-glucose deprivation group than the 24-hour oxygen-glucose deprivation group (P < 0.05). The number of GFAP and β-Tubulin III positive cells was significantly lower in the 48-hour oxygen-glucose deprivation group than the normoxic group (P < 0.05). Apoptotic rate was significantly increased after oxygen glucose deprivation for 48 hours as compared with oxygen-glucose deprivation for 24 hours (P < 0.01) and normoxic group (P < 0.01). These results indicate that oxygen-glucose deprivation have adverse effects on neural stem cell proliferation, differentiation and apoptosis, and its impact depends on the concentration and time of hypoxia as well as the ability of tolerance to hypoxia.

全文链接：

Key words: Anoxia, Neural Stem Cells, Olfactory Bulb, Apoptosis

中图分类号:

马浚宁，高俊玮，侯博儒，任海军，陈四化，刘吉星，严贵忠. 糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 876-882.

Ma Jun-ning,Gao Jun-wei, Hou Bo-ru, Ren Hai-jun, Chen Si-hua, Liu Ji-xing, Yan Gui-zhong. Effect of oxygen-glucose deprivation on the proliferation, differentiation and apoptosis of neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 876-882.

图/表（结果） 3

2.1 神经干细胞分离培养鉴定提取的原代神经干细胞在低倍视野下呈大量折光性好、透亮的单细胞以及少量未消化完全的细胞团和部分细胞碎片(图1A)。培养至第3天可见神经球形成，经半量换液继续培养至第7天，低倍镜下可见悬浮生长、桑葚状典型的神经球(图1B)。此时，提取的原代细胞中尚存有部分神经元、胶质细胞等杂质细胞，经无血清条件培养下继续培养传代，此类细胞会逐渐死亡，自然纯化筛选出实验所需的神经干细胞。

原代细胞传至第4代后，选取生长状态好的神经干细胞行其特异性标志物CD133细胞免疫荧光检测。落射式荧光显微镜下观察并采集图像，镜下可见CD133染色呈阳性(图1C)。Hochest 33258复染细胞核，细胞核呈椭圆形或圆形，结构明显(图1D)。经NIH ImageJ软件将CD133染色与Hochest 33258细胞核复染的图片叠加后，可见被染色细胞与被染色细胞核重叠(图1E)，证实被染色细胞为神经干细胞。

2.2 缺氧对神经干细胞分化能力的影响镜下观察常氧组神经干细胞贴壁状态良好，贴壁后的细胞向四周及邻近细胞延伸起多个突起，相互形成链接。缺氧组神经干细胞贴壁不完全，镜下可见大量细胞悬浮于培养孔内，仅有部分神经干细胞贴壁，且胞体变小，并向四周伸出突起的数目变少，突起变短变粗。

糖氧剥夺48 h后，缺氧组细胞更换为普通DMEM/F12培养基加体积分数为10%胎牛血清常氧环境下继续培养至第7天，分别行GFAP、β-Tubulin Ⅲ细胞免疫荧光染色，可见常氧组与缺氧组GFAP(图2A，2G)、β-Tubulin Ⅲ(图2D，2J) 染

色呈阳性表达。Hochest 33258复染细胞核后与GFAP(图2C，2I)、β-Tubulin Ⅲ(图2F，2L)阳性细胞重叠，进一步证实染色阳性细胞为星形胶质细胞与神经元。每组在3个圆形盖玻片上，随机取20个高倍视野，计算GFAP、β-Tubulin Ⅲ阳性细胞总数(图2G)。相同密度条件下接种的神经干细胞经糖氧剥夺48 h其分化为星形胶质细胞总数(133±20)较常氧组(217±15)下降(P < 0.05，n=3)，其分化为神经元总数(29.7± 7.5)也较常氧组(56.7±6.4)下降(P < 0.05，n=3)，见图3。

以上结果表明不论在常氧还是糖氧剥夺环境下，神经干细胞都可以定向分化为星形胶质细胞和神经元，其中主要以星形胶质细胞为主。糖氧剥夺明显影响神经干细胞分化后的星形胶质细胞和神经元的形态。糖氧剥夺时间越长，细胞或细胞集落贴壁越少，凋亡细胞越多，但糖氧剥夺对分化后形成的星形胶质细胞和神经元比例的影响很小。

2.3 缺氧对神经干细胞增殖能力的影响神经干细胞分别经24，48 h糖氧剥夺处理后，更换DMEM/F12完全培养基，接种96孔培养板内常氧条件下继续培养，分别于1，2，3，4，5，6，7 d行MTT细胞增殖能力检测绘制细胞生长曲线，实验重复3次。MTT结果显示常氧环境下神经干细胞接种后3 d内其增殖能力处于潜伏期，生长缓慢，第4天进入快速生长期，到第7天达顶峰。神经干细胞经糖氧剥夺处理24 h后，细胞增殖潜伏期延长，增殖能力下降，其快速生长期平坦。经糖氧剥夺处理48 h后其增殖能力下降尤为明显(P < 0.05)，细胞快速生长期消失。说明缺氧可以明显降低神经干细胞增殖能力，缺氧时间越长，神经干细胞增殖能力下降越明显，见图4。

2.4 缺氧对神经干细胞凋亡的影响将第5代神经干细胞接种于含有多聚赖氨酸包被的盖玻片的24孔培养板内缺氧环境下分别培养24，48 h后，行hochest33258染色，在荧光显微镜下观察细胞形态，并采集图像进行凋亡率统计。正常神经干细胞的细胞核经hochest3328染色后高倍镜下可见胞核饱满，圆润，颜色不透亮(图5A)。经糖氧剥夺处理后，细胞核形状不规则，皱缩，染色质凝集，甚至有部分发生断裂(图5B)。在每组3个圆形盖玻片上，随机取20个视野，计算细胞总数及凋亡细胞数(图5C)，神经干细胞经糖氧剥夺处理24 h后其凋亡率上升至(53.47±2.97)%，糖氧剥夺处理48 h后其凋亡率上升至(71.32±0.18)%。缺氧组的神经干细胞凋亡率显著高于常氧组(P < 0.01)，说明神经干细胞经糖氧剥夺处理后凋亡明显。糖氧剥夺48 h细胞凋亡率显著高于糖氧剥夺24 h(P < 0.01)，说明糖氧剥夺时间越长，神经干细胞凋亡率越高。

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引言

神经干细胞是指一组具有自我更新、自我复制以及定向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞潜能的细胞群[1]，主要存在于哺乳动物脑组织中的嗅球、海马齿状回、大脑皮质、室管膜上区、脊髓等中枢神经组织中[2-3]。神经干细胞因其再生能力及定向分化为神经细胞的能力，为中枢神经系统疾病的治疗开辟了新的研究领域，并已有研究表明神经干细胞移植对于脑损伤、脊髓损伤、脑卒中、帕金森病、阿尔茨海默症等神经系统疾病具有一定的治疗作用[3-7]。然而因病理条件下神经干细胞移植后存活率低，定向分化为具有生物学功能的神经元替代受损神经细胞的不可控性，其促进神经功能恢复能力有限，限制了神经干细胞的治疗作用[7-8]。
缺氧作为神经系统疾病发展过程中诸多病理因素中最常见的因素之一，对于内源性神经干细胞以及移植后外源性神经干细胞的存活、迁移、分化、凋亡发挥着诸多调控作用[9-12]。研究表明中枢神经系统缺氧损伤可以导致内源性神经干细胞的增殖，并向损伤部位迁移、分化成为子代神经细胞，从而整合到神经网络中，参与组织修复和功能重建[10，13]。亦有研究表明脑卒中后缺血再灌注诱发一系列独立的损伤性级联反应，氧含量的急剧变化，缺氧诱导因子以及活性氧自由基的释放都会导致神经细胞的损伤[14]。在缺血缺氧病理微环境下，神经干细胞移植后数天内，有30%-90%的移植细胞凋亡，并且增多的凋亡细胞碎片会进一步加重缺血缺氧后神经组织的负担[9]。本课题组从新生小鼠嗅球组织中提取出神经干细胞，在体外环境下建立神经干细胞糖氧剥夺模型，观察缺氧对神经干细胞增殖能力、分化及凋亡的影响，从而为后续神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病研究奠定体外细胞水平理论及实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：体外细胞培养实验。

时间及地点：于2014年8至11月在兰州大学生命科学学院实验室完成。

材料：

实验动物：新生1 d昆明小鼠3只，体质量1 g左右，雌雄不限，由兰州大学实验动物中心提供，实验过程严格遵守动物伦理学准则。

糖氧剥夺神经干细胞增殖、分化、凋亡实验所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
DMEM/F12基础培养基， DMEM/F12无糖培养基，B27	Gibco公司
胎牛血清	杭州四季青生物试剂公司
表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子	PeproTech公司
兔抗小鼠β-TubulinⅢ单克隆抗体、Hochest 33258原液	Sigma公司
小鼠抗BrdU单克隆抗体	abcam公司
兔抗小鼠GFAP单克隆抗体、兔抗小鼠CD133单克隆抗体	武汉博士德生物工程有限公司
FITC标记的山羊抗兔IgG、TRITC标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的山羊抗小鼠IgG	Earthox公司
CO₂细胞培养箱	AIRTECH公司
落射式荧光显微镜	OLYMPUS公司

实验方法：

神经干细胞的分离及原代培养：取新生 1 d昆明小鼠，置于体积分数为75%乙醇中浸泡。超净工作台内无菌断头取脑，在底部置有冰袋的培养皿内分离出嗅球组织，将分离好的组织分别转移至盛有4 ℃预冷的D-Hank’s缓冲液的培养皿中，剔除血管和脑膜后将不同组织剪碎，分别转移至盛有0.25%胰酶溶液的15 mL离心管中37 ℃酶解消化10-15 min，待酶解充分(组织呈絮状，出现拉丝现象)，1 500 r/min离心3 min，弃上清，加入脱氧核糖核酸酶Ⅰ工作液5 mL重悬细胞，1 mL滴定管吹打成单细胞悬液，400目滤网过滤，1 500 r/min离心3 min，弃上清，DMEM/F12基础培养基洗涤细胞1次，加入37 ℃预热、含1%B27、 20 μg/L表皮生长因子和10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12完全培养基1 mL，重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹接种于5 cm×5 cm的培养瓶中，37 ℃体积分数5% CO₂条件下培养，三四天后根据细胞生长状况半量离心换液。

神经干细胞的传代培养：神经干细胞培养至三四天后，可见神经球在培养基中呈悬浮生长，培养至六七天后观察神经球数目及大小，神经球直径至150 μm时应及时传代。

将细胞悬液收集至15 mL离心管中，以500 r/min离心三四分钟，小心弃去上清，向离心管内加入1 mL TRYPLE EXPRESS，吹打混匀后置于37 ℃水浴锅中消化15 min，500 r/min离心三四分钟，弃上清，加入新鲜37 ℃预热DMEM/F12完全培养基1 mL重悬，调整细胞密度后接种培养，3 d后半量换液，六七天时传代。

神经干细胞特异性标志物CD133免疫荧光鉴定：神经干细胞培养至第4代时，选取生长状态良好细胞，调整细胞浓度，接种于加有多聚赖氨酸包被的盖玻片的24孔培养板中，送回培养箱内孵育4 h，期间镜下观察细胞贴壁情况，待大部分细胞贴壁后，吸去培养基，用37 ℃预热的PBS置于摇床清洗3次，5 min/次。用4 ℃预冷的多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗涤3次，5 min/次。4 ℃预冷的0.3% TritonX-100处理细胞30 min，PBS洗涤3次，5 min/次。用体积分数为10%的山羊血清封闭，37 ℃温育30 min，弃山羊血清，兔抗小鼠CD133一抗(1∶200，用含有3%的BSA，0.2%Triton，1%NAN3的PBS稀释)37 ℃温育30 min 后，置于4 ℃恒温摇床过夜。次日取出培养板，回收一抗，PBS洗3次，5 min/次，避光加入FITC标记的山羊抗兔二抗(1∶200)在摇床上摇动促使其结合均匀，室温条件下孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次。Hoechst 33258复染细胞核。在载玻片上滴加甘油-PBS封固剂，然后取出有贴壁细胞的圆形盖玻片，倒扣在载玻片上封固。之后在荧光显微镜下观察拍照。染色和拍片过程中注意避光，防止二抗的荧光淬灭。

糖氧剥夺模型的建立：观察细胞状态，待24孔板中的细胞融合度达到80%左右时，即可用于实验处理。吸尽原有的DMEM/F12培养基，使用2 mL PBS清洗细胞表面，共清洗2次。清洗之后再加入无糖DMEM/F12培养基，培养基中不含血清，每孔500 μL。然后把培养板放入气盒中，通入成分为体积分数为95%N₂，体积分数为5%CO₂的厌氧气。通气时间为3 min。然后将气盒密封，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱中。根据需要，在缺氧条件下培养不同时间后，将其中的培养基更换为正常的含血清的DMEM/F12高糖培养基，放回到37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱继续培养。

糖氧剥夺处理后神经干细胞的诱导分化：将传至第5代的神经干细胞分为常氧组和缺氧组，经酶解消化后接种于含有多聚赖氨酸包被的载玻片的24孔培养板中。常氧组撤去培养基中表皮生长因子与碱性成纤维生长因子，加入体积分数为10%的胎牛血清诱导分化，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱培养。缺氧组细胞更换为含体积分数为10%胎牛血清的无糖DMEM/F12培养基，然后把培养板放入气盒中，通入成分为体积分数为95%N₂，体积分数为5%CO₂的厌氧气，通气时间为3 min。然后将气盒密封，在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养48 h，培养期间于显微镜下观察细胞生长状况，镜下观察缺氧组神经干细胞会破坏神经干细胞缺氧环境，为保证实验严格在缺氧条件下进行，在每次取出培养板后需继续将培养板放入气盒中重建缺氧环境，具体步骤同前。

神经干细胞分化能力的鉴定：将传至第5代的神经干细胞接种于含多聚赖氨酸包被载玻片的24孔培养板中，培养基更换为去除生长因子并加入体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，每隔3 d半量换液1次，期间倒置相差显微镜下观察神经干细胞生长、分化以及形态学变化，培养至第7天进行GFAP、β-Tubulin Ⅲ免疫荧光化学鉴定。吸去培养基，用37 ℃预热的PBS置于摇床清洗3次，5 min/次。用4 ℃预冷的0.3%TritonX-100处理细胞30 min，PBS 洗涤3次，5 min/次。用体积分数为10%的山羊血清封闭，37 ℃温育30 min，弃山羊血清。分别加入兔抗小鼠GFAP一抗(1∶200)、兔抗小鼠β-Tubulin Ⅲ(1︰200)37 ℃温育 30 min后，置于4 ℃恒温摇床过夜。次日取出培养板，回收一抗，PBS洗3次，5min/次，分别避光加入FITC、TRITC标记的山羊抗兔二抗(1︰200)在摇床上摇动促使其结合均匀，室温条件下孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次。Hoechst 33258复染细胞核。在载玻片上滴加甘油-PBS封固剂，然后取出有贴壁细胞的圆形盖玻片，倒扣在载玻片上封固。之后在荧光显微镜下观察拍照。

MTT法测定缺氧后神经干细胞活力：取缺氧处理24，48 h的神经干细胞，制成单细胞悬液，用DMEM/F12完全培养基以每孔1.0×10⁴个接种于96孔培养板内，每孔150 μL，定期观察细胞生长状况，分别于24，48，72，96，120，144，168 h测吸光度值。具体步骤如下：每孔加入MTT (5 g/L)20 μL，继续培养4 h，将孔内细胞离心收集，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，酶标仪于490 nm波长下自动测吸光度值。设正常对照，实验重复3次。

Hoechst 33258染色检测缺氧状态下神经干细胞的凋亡：将神经干细胞凋亡测试分为常氧组、缺氧24 h组、缺氧48 h组。纯化培养的神经干细胞经过糖氧剥夺处理后，使用Hoechst 33258进行染色。将24孔板内的DMEM/F12培养基吸尽，PBS冲洗3次，之后加入Hoechst 33258稀释液，每孔500 μL，染色时间为15 min，PBS冲洗3次，每次10 min。40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，PBS冲洗3次，每次10 min。甘油-PBS封固，荧光镜下进行观察拍照。

主要观察指标：①倒置荧光显微镜下观察神经干细胞生长状况。②细胞免疫荧光法鉴定神经干细胞以及糖氧剥夺后神经干细胞分化产物。③Hochest 33258染色观察糖氧剥夺后神经干细胞凋亡状况。

统计学分析：所得的实验数据使用SPSS 18.0进行分析，结果用x(_)±s表示。两组数据间的差异采用独立样本t 检验分析，3组以上数据间的差异采用one-way ANONVA单因素方差检验进行分析。P < 0.01为差异有非常显著性意义，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

存在于神经发生过程以及成年哺乳类动物中枢神经系统的神经干细胞是一种多能性细胞，具有自我更新，以及分化为神经元、星形胶质细胞细胞以及少突胶质细胞能力^[15]。从哺乳动物胚胎及脑组织中可以分离培养出神经干细胞，在体外无血清培养条件下并加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子，神经干细胞呈聚集式悬浮生长，形成典型的神经球形态^{[16- 17]}。神经干细胞表达其特异性标志物巢蛋白、CD133^[18-19]。本课题组从新生鼠嗅球提取出神经干细胞，经无血清条件下培养，传代纯化，扩增出供实验所需的神经干细胞，经特异性标志物CD133检测后，建立神经干细胞糖氧剥夺模型，系统观察了糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响。

神经发生过程中局部微环境中的氧浓度是影响神经干细胞增殖、分化的重要因素之一^[12]。中枢神经系统在正常生理条件下，其生理氧浓度波动范围在0.55%-8%^[20]，在神经干细胞聚集的室管膜下区和海马齿状回的氧体积分数为2.5%-3%^[12^，^21]。当缺血性脑卒中发生时，阻塞区域的血流量大幅度降低，血流无法通过梗死区域，导致局部氧浓度和葡萄糖等能量物质迅速、大量的降低，在很短的时间内形成梗死中心。在缺血中心外围区域尚存在有少量的血液灌注，这部分区域的功能可能发生可逆性修复，但也有可能随缺血缺氧程度的加深造成继发性损伤，扩大成为梗死中心的一部分，这部分区域被称为缺血半影区。在缺血中心和半影区的氧体积分数接近于0%，导致大量神经细胞因缺氧而变性死亡^[22-23]。

通过神经干细胞的定向分化能力，从而在体外培养出最佳功能状态的神经元是细胞替代疗法得以实施的基础，因此体外研究糖氧剥夺微环境对神经干细胞增殖、分化的影响是神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中研究的重要途径^[24]。研究表明相较于氧体积分数为4%和20%环境下，体积分数2%的氧明显促进神经干细胞的增殖，并且低氧浓度可以影响神经干细胞分化为神经元的表型，促使其从γ-氨基丁酸敏感的神经元分化为谷氨酸敏感的神经元^[25]。本课题组将简易气盒中通入成分为体积分数95%N₂，体积分数5%CO₂的厌氧气，通气时间为3 min，可以建立出局部0.5%氧浓度环境，实验结果表明糖氧剥夺的时间对于神经干细胞的增殖分化会造成不同程度的影响，神经干细胞经糖氧剥夺后复氧培养，其增殖能力明显下降，且下降程度与糖氧剥夺时间呈正相关，糖氧剥夺时间越长对神经干细胞的损伤越严重。然而Chen等^[11]研究报道缺氧12 h可以明显促进皮质来源的神经干细胞增殖。对于这一现象，作者认为神经干细胞对于缺氧时间及缺氧浓度存在耐受阈值区间，当缺氧浓度和缺氧时间在神经干细胞耐受阈值范围之内，缺氧对神经干细胞造成的损伤反而会促进其增殖，当缺氧浓度及缺氧时间超过神经干细胞对缺氧耐受阈值范围，则会抑制其增殖，诱导细胞凋亡。不同组织来源对于缺氧时间及缺氧浓度存在差异性，因此今后的研究有必要探讨不同组织来源的神经干细胞对于缺氧耐受性的影响，筛选出缺血缺氧环境下生存能力强的神经干细胞，从而为神经干细胞替代疗法提供生物学性能优良的种子细胞。

缺氧对于神经干细胞分化的影响，通过计数常氧与缺氧环境下诱导分化GFAP、β-Tubulin Ⅲ阳性细胞数发现，相同接种密度下，神经干细胞经糖氧剥夺后其分化为星形胶质细胞和神经元的数目明显下降，对于这一客观现象作者认为与糖氧剥夺对神经干细胞损伤作用所致的神经干细胞凋亡有关，损伤后的神经干细胞不易贴壁，大量细胞丢失所致。作者观察到经糖氧剥夺后神经干细胞贴壁过程缓慢，且贴壁不完全。课题组在前期的研究过程中发现常氧培养条件下神经干细胞诱导8-12 h后，绝大多数的神经干细胞附着于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，并向四周发起突起。在糖氧剥夺48 h后，任由大量神经干细胞悬浮于培养基中，且已贴壁的神经干细胞胞体变小，伸起的突起形态上变粗、变短，数量变少。

细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，是一个程序性进行的过程，受复杂而精确的细胞信号转导机制调控。细胞凋亡在生理状态下和病理状态下均可发生，它在机体的胚胎发育、维持内环境的稳定和疾病的发生等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡不同于细胞坏死，凋亡的细胞可以保持完整的膜结构和膜功能，同时还保持着细胞器结构的完整性，没有破坏溶酶体，但是细胞体会发生收缩，细胞间的链接消失，细胞核内染色质发生凝集。凋亡晚期的细胞会形成凋亡小体，最终被吞噬细胞所吞噬^[26]。目前为止，公认的凋亡信号传导途径有两种：外源性凋亡途径和内源性凋亡途径。外源性凋亡途径指由细胞表面死亡受体介导的凋亡途径，内源性凋亡途径主要包括线粒体凋亡途径和内质网凋亡途径。细胞凋亡过程中会发生复杂的生物学变化，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族成员(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)的激活发挥着至关重要的作用，该家族的蛋白酶又被称作细胞凋亡蛋白酶，在细胞凋亡过程中选择性的降解细胞内各种成分^[27-29]。本课题组研究发现，常氧培养条件下神经干细胞凋亡率为(10.94±0.62)%，糖氧剥夺24 h约半数(53.47±2.97)%神经干细胞发生凋亡，糖氧剥夺48 h有(71.32±0.18)%的神经干细胞发生凋亡，说明生理状态下的神经干细胞自身会发生程序性凋亡，糖氧剥夺条件会显著促进该凋亡进程，且缺氧浓度和缺氧时间与细胞凋亡率呈正相关。实验从新生鼠嗅球提取出神经干细胞，体外条件下建立糖氧剥夺模型，系统的观察了糖氧剥夺对嗅球来源神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响，并初步探讨了缺氧浓度及缺氧时间对神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响，提出了神经干细胞具有缺氧耐受性区间的概念，为今后神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中的实验研究建立了体外细胞水平的实验依据。

糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响

Effect of oxygen-glucose deprivation on the proliferation, differentiation and apoptosis of neural stem cells

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