人诱导性多潜能干细胞系的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.009

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (6): 868-875.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.009

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人诱导性多潜能干细胞系的建立

师迎旭1，韩艳秋1，谢印良2，杜华2

1内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050；2内蒙古医科大学基础医学院病理解剖教研室，内蒙古自治区呼和浩特市 010050

收稿日期:2014-11-11 出版日期:2015-02-05 发布日期:2015-02-05
通讯作者: 杜华，讲师，内蒙古医科大学基础医学院病理解剖教研室，内蒙古自治区呼和浩特市 010050
作者简介:师迎旭，男，1978年生，内蒙古自治区呼和浩特人，汉族，博士，助理研究员，主要从事细胞生物学研究。

Establishment of human induced pluripotent stem cell lines

Shi Ying-xu1, Han Yan-qiu1, Xie Yin-liang2, Du Hua2

1Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Department of Pathological Anatomy, School of Basic Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2014-11-11 Online:2015-02-05 Published:2015-02-05
Contact: Du Hua, Lecturer, Department of Pathological Anatomy, School of Basic Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Shi Ying-xu, M.D., Assistant researcher, Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：诱导性多潜能干细胞与肿瘤干细胞的发生过程极其相似，而且具有的干细胞特性极其接近人胚胎干细胞。因此，研究诱导性多潜能干细胞有利于人们进一步认识并了解人类发育以及肿瘤的发生过程。
目的：掌握建立人诱导性多潜能干细胞系的技术，以便为特异性疾病细胞的重编程建立技术平台，从而利用重编程技术研究疾病的发病机制。
方法：将含有Oct4、Sox2、Klf-4和c-Myc 4个转录因子的反转录病毒感染人皮肤成纤维细胞(HS27细胞)，在人胚胎干细胞培养条件下诱导产生人胚胎干细胞样的克隆。挑取并进一步扩增，通过克隆形态、碱性磷酸酶活性、免疫荧光检测是否有人胚胎干细胞标记物Oct4、Sox2、c-Myc、Klf-4的表达，悬滴法检测HS27细胞来源的克隆形成畸胎瘤的能力和验证向3个胚层的分化能力。
结果与结论：经病毒感染诱导产生的胚胎干细胞样克隆呈绿色荧光蛋白阴性，克隆在细胞形态方面与人胚胎干细胞克隆相似，进一步扩增经碱性磷酸酶检测克隆呈阳性，免疫荧光检测克隆表达Oct4、Sox2、c-Myc、Klf-4，并且HS27细胞来源的克隆注入免疫缺陷小鼠体内可以形成畸胎瘤并经苏木精-伊红染色显示具有向三胚层分化能力。实验成功构建了人诱导性多潜能干细胞系，为下一步开展疾病细胞特异性重编程研究奠定了良好的实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 人诱导性多潜能干细胞, 人胚胎干细胞, 畸胎瘤, 三胚层分化, Oct4, Sox2, c-Myc, Klf-4

Abstract:

BACKGROUND: Induced pluripotent stem cells have a generating process similar to cancer stem cells and possess stem cell characteristics extremely close to human embryonic stem cells. Therefore, studies on induced pluripotent stem cells are in favor of an increased awareness and understanding of human development and tumor occurrence.
OBJECTIVE: To master the technology of establishing induced pluripotent stem cell lines in order to build the technology platform for reprogramming specific disease cells, thus to explore the pathogenesis of the disease using reprogramming technology.
METHODS: Retroviruses containing Oct4, Sox2, Klf-4, and c-Myc4 transcription factors were used to transfect human skin fibroblasts (HS27 cells), and then the cells were induced to differentiate to human embryonic stem cell-like clones in the human embryonic stem cell culture conditions. The cells were picked and further amplified. After observation of clone morphology and alkaline phosphatase activity test, immunofluorescence detection was used to detect whether human embryonic stem cell markers Oct4, Sox2, c-Myc, Klf-4 expressed, the pendant-drop method was used to detect the ability of HS27-derived clones to form teratomas and verify the differentiation into three germ layers.
RESULTS AND CONCLUSION: After viral infection, embryonic stem cell-like clones formed and were negative for green fluorescent proteins. These clones were similar to human embryonic stem cell clones in cell morphology. After further amplification, they were positive for alkaline phosphatase. Immunofluorescence results showed that the clones expressed Oct4, Sox2, c-Myc, Klf-4, and HS27 cells-derived clones injected into immunodeficient mice could form teratomas and had the ability to differentiate into the three germ layers under hematoxylin-eosin staining. In this experiment, induced pluripotent stem cell lines were successfully constructed, laying a good experimental foundation for disease-specific cell reprogramming research.

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Key words: Induced Pluripotent Stem Cells, Embryonic Stem Cells, Teratoma

中图分类号:

R394.2

师迎旭，韩艳秋，谢印良，杜华. 人诱导性多潜能干细胞系的建立[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 868-875.

Shi Ying-xu, Han Yan-qiu, Xie Yin-liang, Du Hua. Establishment of human induced pluripotent stem cell lines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 868-875.

图/表（结果） 4

2.1 反转录病毒生产与滴度测定结果携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 基因的反转录病毒载体与病毒包装质粒共转染293T细胞，48 h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，表明转染成功(图1)；收集病毒上清经过滤浓缩后进行滴度测定，病毒滴度值都在1×10⁶ U/mL以上(结果未显示)。

2.2 HS27细胞在体外诱导为诱导性多潜能干细胞及功能鉴定 HS27细胞在体外重编程为诱导性多潜能干细胞，显微镜下观察可见HS27细胞逐渐转变并出现人胚胎干细胞样的克隆形态。经含有携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因包装的反转录病毒感染HS27细胞，在病毒感染第7，8天可见到HS27细胞形态由长梭形渐变为圆形并出现聚集现象，在病毒感染第14天可见人胚胎干细胞样克隆出现，第20天左右挑取的克隆中具有典型的人胚胎干细胞克隆。挑取的人胚胎干细胞样克隆经传代培养后，可见有多个克隆的细胞仍能够保持未分化状态，选取两三株疑似克隆进行鉴定，其他克隆冻存备用。疑似克隆经AP染色后呈阳性，克隆为紫红色，而饲养层细胞不着色，这一结果表明疑似克隆具有较高的碱性磷酸酶活性(图2)，其命名为诱导性多潜能干细胞1。

诱导性多潜能干细胞1在体外可长期传代培养，仍具有典型的人胚胎干细胞克隆样形态。当HS27细胞在体外重编程为人胚胎干细胞样克隆后，克隆所具有的绿色荧光逐渐减弱，预示当HS27细胞被重编程转化为诱导性多潜能干细胞后，有部分增强型绿色荧光蛋白基因沉默(图3)。

免疫细胞化学检测显示，诱导性多潜能干细胞1能够表达人胚胎干细胞所特有的全能性的标志基因(即Oct4、SSAE-4、TRA-1-60、TRA-1-81)(图4-7)，而不表达SSAE-1。

诱导性多潜能干细胞1具有在体外分化形成囊性拟胚体的能力(图8)。并且HS27细胞来源的克隆注入免疫缺陷小鼠体内可以形成畸胎瘤并经苏木精-伊红染色显示具有向三胚层分化能力(图9)。

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引言

诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的出现是干细胞生物学领域中的一个重要里程碑。在2006年日本科学家Shinya Yamanaka第一次利用病毒载体将4个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)转导整合入分化的体细胞的染色体中，诱使处于终末分化阶段的体细胞经重编程后转变为类似胚胎干细胞的一种细胞类型^[1]——诱导性多潜能干细胞。从这一技术面世以来，对于诱导性多潜能干细胞的研究和关注度急剧增长，诱导性多潜能干细胞的建立已从最初的小鼠、大鼠、猕猴、猪发展到一些大动物甚至人的体细胞中并获成功^[2-6]，同时诱导技术与手段也发生了巨大的革新，除病毒载体外，非整合病毒、质粒、蛋白、mRNA以及细胞分子抑制剂甚至维生素C都能够促进并诱发产生诱导性多潜能干细胞^[7-10]。

诱导性多潜能干细胞这一技术提供了许多巨大的潜在应用价值以及研究优势，例如将此技术运用于病患或者疾病特异的多能性干细胞，用于研究肿瘤疾病以及恶性细胞的发病机制，以及进一步的个性化诊断；专注于诱导性多潜能干细胞诱导的功能细胞研究还有望用于临床治疗相关疾病，针对不同的病患进行针对性的治疗，这样的操作一方面可以避免移植过程中的免疫排斥问题，另一方面也绕开了人类胚胎干细胞研究所带来的伦理问题，此外更具有针对性，最终可达到个体化治疗的目的。

诱导性多潜能干细胞可以从不可逆的终末分化细胞转变为具有永生化、无限分化能力的类胚胎干细胞^[11]。这一特点，与肿瘤细胞的发生过程极其相似，因此通过诱导性多潜能干细胞的研究，可以为肿瘤基础研究和临床诊断与治疗提供新的解决途径。首先，诱导性多潜能干细胞技术可以将不“正常”的体细胞通过重编程转化为人胚胎干细胞样的人诱导性多潜能干细胞，这一过程可以“完全”模拟肿瘤细胞的发展过程^[12]。其次，使用病患的诱导性多潜能干细胞作为研究的初始细胞，可以针对性的研究特定肿瘤细胞中的基因、蛋白质和其他细胞因子调控细胞谱系分化的分子机制及异同。这一实验技术为研究人肿瘤细胞重编程提供理想而强大的体外研究体系与平台，有助于揭示肿瘤发生及肿瘤细胞重编程机制等以及个体化诊断的可能性。再次，有研究报道将肿瘤细胞注入囊胚中或将癌细胞的基因注入卵母细胞中，并不会生成一个患有癌症的有机体，这说明肿瘤细胞是能够通过重编程过程而被修复的^[13-14]。肿瘤细胞在体外被重编程转化为诱导性多潜能干细胞或其他类型正常细胞，通过系统分析不同病患的诱导性多潜能干细胞的功能，如凋亡机制，可以作为临床肿瘤个体化治疗的一个新的思路与发展方向。为了最终对病患进行个体化的诊治，需要构建肿瘤细胞重编程诱导性多潜能干细胞技术平台，首先必须掌握将人的正常体细胞重编程的诱导性多潜能干细胞技术，为此课题组开展了这方面的研究工作。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2013年4月至2014年5月在内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心完成。

材料：

实验动物：ICR小鼠、SCID小鼠各5只，SPF级，6-8周龄，体质量15-18 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

人诱导性多潜能干细胞系建立实验所用主要试剂：
试剂	来源
高糖DMEM、DMEM/F12、Knock-out DMEM、血清替代物、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、青霉素-链霉素、胰蛋白酶、胶原酶Ⅳ、Opti-MEM Medium	Invitrogen 公司
胎牛血清	PAA 公司
碱性成纤维细胞生长因子	PeproTech 公司
转染用Lipofectamine 2000	Invitrogen公司
碱性磷酸酶染色试剂盒	Milipore 公司
anti-Oct4 抗体	Abcam公司
anti-SSAE-4、anti-TRA-1-60、anti-TRA-1-81 抗体	Invitrogen 公司
二抗Alexa Fluor R 555 goat anti-rabbit IgG、Alexa Fluor R 555 goat anti-mouse IgG、Alexa Fluor R 555 goat anti-mouse IgM	Invitrogen公司

载体和细胞：携带有Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 的反转录病毒载体及包装质粒VSVG和pKat由内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心保存。人胚肾上皮细胞株293T细胞、人成纤维细胞(HS27)与人胚胎干细胞系H1细胞由内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心细胞库提供。

实验方法：

小鼠胚胎成纤维细胞分离培养：引颈或麻醉处死受孕12.5-13.5 d的ICR小鼠，放进体积分数为75%乙醇浸泡 5 min进行体表消毒，然后转移到超净台内，放置在100 mm培养皿里，腹部向上，剪开腹部表皮(注意避免支原体污染)，剪开腹部，用无菌镊子挑出小鼠子宫，这时可看到念珠串样的小鼠胚胎，将小鼠子宫转移到一只新的100 mm培养皿里，用眼科剪剪开子宫壁，将每一个小鼠胚胎从子宫剥离出来，并用PBS洗涤后转移到另一只新的盛有PBS的100 mm培养皿里；用眼科剪和眼科镊剪开包膜，这时可看到一个个桑椹大小的小鼠胚胎；PBS洗涤3次后，用眼科镊将每一个胚胎的头部和内脏组织去除；将去除头部和内脏组织的胚胎组织转移到50 mL离心管中，PBS洗涤1次，离心收集胚胎组织；胰蛋白酶消化组织，37 ℃消化10-15 min。消化细胞期间不断用1 mL枪头吹打细胞消化液，使得组织消化完全；待到无组织碎片，细胞消化液均匀浑浊时，加入2倍于消化液体积以上的含体积分数为10%胎牛血清的小鼠胚胎成纤维细胞培养液，终止胰酶作用；立即将细胞悬液转移到T75细胞培养瓶中，37 ℃体积分数为5%CO₂条件下贴壁培养小鼠胚胎成纤维细胞，标记为P0代(大约每3个胚胎培养在1个T75细胞培养瓶)。P0代的小鼠胚胎成纤维细胞生长到90%-95%融合时，用吸管吸出培养液，然后用PBS洗涤细胞2次，加入1.0-2.0 mL 0.25%胰蛋白酶37 ℃ 3-5 min消化细胞。显微镜下观察，待贴壁细胞脱落，细胞变圆变亮后，加入含体积分数为10%胎牛血清的培养基终止胰蛋白酶作用；然后，迅速将细胞吹散，将细胞悬液转入50 mL离心管1 000 r/min离心5 min收集细胞；弃去上清，小鼠胚胎成纤维细胞培养基重悬细胞。依据细胞多少1∶3或1∶4传代扩增培养细胞。P1或P2代的细胞生长至90%-95%融合时，冻存备用。

丝裂霉素处理小鼠胚胎成纤维细胞：P2代小鼠胚胎成纤维细胞生长到90%融合率时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞传代。待贴壁的细胞变圆且将要脱离培养瓶表面时，用含体积分数为10%胎牛血清的小鼠胚胎成纤维细胞培养基终止胰酶消化作用；用5 mL或10 mL吸管柔和吹打细胞使其变成单细胞悬液，然后收集细胞悬液到50 mL离心管中 1 000 r/min离心5 min收集细胞；弃去上清，重新加入小鼠胚胎成纤维细胞培养基重悬细胞成单细胞悬液，按1∶3或1∶4传代；状态良好的P3代小鼠胚胎成纤维细胞生长到细胞层达到85%-90%融合率时，向培养基中加入丝裂霉素C至终质量浓度1 mg/L，然后将细胞放入37℃细胞培养箱中继续培养12 h；12 h后，吸出含有丝裂霉素C的培养基，PBS洗涤细胞3次，用0.25%胰酶消化处理细胞，待贴壁的细胞变圆且将要脱离培养瓶表面时，用含体积分数为10%胎牛血清的小鼠胚胎成纤维细胞培养基终止胰酶消化作用；用5 mL或10 mL吸管轻轻吹打细胞使其变成单细胞悬液，然后将细胞悬液转入50 mL离心管中1 000 r/min离心 5 min收集细胞；将离心收集的细胞用小鼠胚胎成纤维细胞冻存液重悬并计数，调整细胞浓度至1.1×10⁹ L^-¹，1 mL/管分装到细胞冻存管中冻存备用。

人皮肤成纤维细胞HS27培养：复苏的人皮肤成纤维细胞HS27培养在含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中；依据细胞的生长密度每两三天更换一次新鲜培养液；待细胞生长到90%融合时，用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)消化细胞(如果细胞的密度较大则有可能会引起细胞衰老)；按(0.8-1.0)×10³/cm²的密度传代扩增，冻存备用。

携带Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4 基因的反转录病毒的包装及其滴度的测定：采用Qiagen质粒大提试剂盒提取质粒，然后依照脂质体Lipofectamine 2000的操作流程将携带Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4 基因的质粒通过瞬时转染的方法介导入293T细胞以生产反转录病毒，反转录病毒包装详细步骤参见文献[15-17]和Lipofectamine 2000操作手册。分别于48 h与72 h收集病毒，病毒上清液用Millipore公司的0.45 μL滤膜过滤，然后通过病毒浓缩柱浓缩病毒。反转录病毒滴度测定：分别用0.1，1，10 μL病毒浓缩液感染15×10⁴ 293T细胞，48 h后40 g/L多聚甲醛固定，采用流式细胞仪计数绿色荧光蛋白阳性细胞和总细胞数，将其代入公式：病毒滴度(U/mL)= 绿色荧光蛋白阳性细胞数/总细胞数/病毒体积。

病毒感染及疑似人胚胎干细胞克隆的挑取：用携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 基因的反转录病毒感染HS27细胞并诱导其为诱导性多潜能干细胞，实验过程中需加入终质量浓度为6 μg/L的polybrene以提高感染效率，在病毒感染24 h后消化HS27细胞然后种植于饲养层细胞上，48 h后更换HS27细胞培养基为人胚胎干细胞培养基培养，第10天换为人胚胎干细胞条件培养基培养，第20天左右开始挑取克隆，将1个克隆平均分入2个96孔细胞培养板中，其中1个96孔板用来做AP染色，选取AP(+)且具有典型的人胚胎干细胞克隆形态的克隆进行后续扩大培养，并对其从如下方面进行鉴定：克隆形态、生长特性、多潜能标志基因表达和畸胎瘤形成及分化等。

人诱导性多潜能干细胞系鉴定：

AP染色：吸出6孔板中细胞培养液，用PBST润洗2次；加入2 mL固定液室温固定1.0-2.0 min(不要固定超过 2 min，过度固定会使得碱性磷酸酶失活)；吸出固定液，用PBST洗涤细胞2次(避免细胞培养孔干燥)；准备碱性磷酸酶试剂：将试剂盒里的A液和B液1∶1在15 mL离心管中混合均匀(AP染液每次在使用之前提前4 min配置；每个孔的细胞准备1 mL的AP染液)，吸出PBST后加入新鲜配置的AP染液1 mL。在室温下避光反应10-20 min (密切观察细胞颜色的变换，当细胞颜色变亮时终止AP反应，避免非特异性染色反应)吸出AP染色液，利用PBS洗涤细胞2次以终止AP染色反应；可观察到未分化的人胚胎干细胞变红或紫色，分化的细胞无色。

免疫细胞化学检测人诱导性多潜能干细胞上全能性标志基因表达：将源于HS27细胞的人诱导性多潜能干细胞种植于24孔板中培养三四天；首先吸出培养基，然后利用PBS洗涤3次(液体沿着培养板壁加入每个细胞孔中，避免将细胞吹脱落)；利用4%PFA室温固定细胞15-20 min；吸出固定液，用PBS轻轻洗涤已固定的细胞3次；每孔加入0.5 mL的封闭液封闭非特异抗体的结合位点，室温静置1 h；根据抗体说明的要求，利用封闭液稀释一抗；吸出封闭液，向每个孔中加入200 μL稀释的抗体，4 ℃保存过夜；一抗孵育过夜后，每孔加入0.5 mL PBS轻轻洗涤3次，每次 5-10 min(如果一抗是荧光标记的抗体，洗涤后可以显微镜下直接观察；如若是非荧光标记的抗体，还要继续加入相应荧光标记的二抗)；根据说明书用封闭液稀释相应的二抗，每孔加入200 μL稀释的二抗室温避光孵育1 h；轻轻地用PBS洗3次，每次0.5 mL 5-10 min；如果要观察细胞核，可向细胞孔内加入终质量浓度2 mg/L的DAPI染液，室温避光放置5-10 min；吸出染液，加入适当体积的PBS即可在普通荧光显微镜下观察染色的荧光结果。通过实验结果检测分析构建的人诱导性多潜能干细胞上人胚胎干细胞标志性基因(如Oct4、SSAE-4、TRA-1-60、TRA-1-81)表达情况。

体外检测源于HS27细胞的诱导性多潜能干细胞的分化能力：生长旺盛的人诱导性多潜能干细胞经Accutase (Stemgent)消化成单细胞并去除小鼠胚胎成纤维细胞，制成单细胞悬液；单细胞悬液计数并调整细胞浓度为4× 10⁷ L^-¹。然后将细胞悬液转移到试剂槽内混合均匀，利用排枪将混合均匀的细胞悬液滴加到培养皿的上盖上，形成一个个独立的液滴，翻转培养皿盖子，将液滴移入细胞培养箱中培养2 d，液滴中的细胞在自然重力的作用下聚集在一起形成拟胚体，观察并记录其分化现象。

畸胎瘤形成实验：选取经过核型鉴定为正常染色体的诱导性多潜能干细胞，通过传代进行扩增。扩增至1个 100 mm培养皿。按常规方法消化离心；加入7 mL ESM重悬后，加入一个100 mm培养皿中，放入细胞培养箱中 45 min-1 h后，吸取上清放入15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min。弃掉上清，加入5 mL PBS重悬细胞后， 1 000 r/min离心5 min。加入适量PBS重悬细胞后，吸取 1 µL细胞稀释计数。调整细胞终浓度至5×10⁹ L^-1。吸取 300 μL细胞悬液至EP管中。用1 mL注射器吸取200 μL细胞悬液，注射到裸鼠皮下。1个月左右可见SCID小鼠皮下形成畸胎瘤。剥离小鼠肿瘤组织，用体积分数为10%的甲醛溶液固定过夜。石蜡包埋，然后进行苏木精-伊红染色，经正置显微镜下观察结果，并进行拍照。

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讨论

人胚胎干细胞是研究正常人类发育的首选细胞，但因为伦理问题利用人胚胎干细胞进行研究受到了具有极大的局限性。而利用特定的转录因子可将分化的体细胞重编程为诱导性多能干细胞^[18-21]，避免了干细胞研究领域的伦理道德和免疫排斥问题。体外研究也证实，诱导性多能干细胞在特定的条件下可定向诱导分化出多种成熟细胞。因此，诱导性多能干细胞在临床应用、生殖发育和理论研究等方面都极具应用价值。

近来，肿瘤研究发现肿瘤干细胞是导致肿瘤发生发展的一个重要因素，因此诊断、治疗肿瘤的一个重要的关键点就是对肿瘤干细胞的识别与鉴定，然而目前仍不能高纯度地、高效地对肿瘤干细胞进行长期培养以及体外扩增，极大的阻碍了对肿瘤干细胞生物学机制的剖析，延缓了对于肿瘤干细胞的认知、诊断、治疗等研究发展，因此如何利用诱导性多能干细胞技术将分化的肿瘤细胞重编程为肿瘤干细胞，将会给肿瘤研究带来新的契机。

研究肿瘤细胞重编程的传统方法有：①利用胚胎干细胞生长环境。②利用胚胎微环境^[22-23]。③囊胚腔注射^[23]。诱导性多潜能干细胞技术的面世为研究肿瘤疾病以及恶性细胞的发病机制，以及进一步的个性化诊疗提供了一种新的思路和手段^[24-27]。利用基因表达技术将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4导入细胞内，最终诱导细胞自身的内源基因表达即可将靶细胞重编程为多能干细胞。

目前的研究表明诱导性多潜能干细胞技术具有巨大的潜在应用价值，2009年7月Hochedlinger课题组通过转导Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4进入小鼠黑色素瘤细胞后将其重编程为诱导性多潜能干细胞，这提示诱导性多潜能干细胞技术为在体外研究肿瘤细胞重编程提供了重要的技术平台，为阐明肿瘤发病机制及肿瘤的个体化诊疗等方面提供一种新思路。此外，对于诱导性多潜能干细胞的研究还可以避免人类胚胎干细胞研究所带来的伦理问题。但是人类诱导多能干细胞的研究还处于起步阶段，所采用的供体细胞还仅仅局限在人包皮成纤维细胞，表皮细胞，毛囊细胞等少数细胞类型，仍具有一定的局限性。更为重要的是，这些细胞被重编程为诱导性多潜能干细胞所需要的时间比较长(3-5周)，效率很低，这显著增加了此过程中目的细胞发生变异的风险。了解并掌握疾病特异性诱导性多潜能干细胞是如何向相应疾病中的功能细胞定向诱导分化的技术方法，有助于揭示肿瘤发生及肿瘤细胞重编程的机制。以此为模型系统的研究恶性疾病的发生、发病机制，分析不同病患的诱导性多潜能干细胞的功能，如凋亡机制、耐药机制、分化机制、侵袭机制等，可以引领临床肿瘤的个体化治疗进入一个全新的发展方向。此外利用这些疾病模型，对现有药物做出个体化的评估，以便发现新的治疗靶点和筛选新的药物，为了最终实验对于病患进行个体化诊治提供可能性。

综上所述，利用携带4种基因的反转录病毒感染HS27细胞20 d后，可以观察到有人胚胎干细胞样克隆出现，表明HS27细胞经过病毒转导的基因被整合到染色体中并成功诱使细胞被重编程；挑取疑似克隆后，进行AP染色和形态学观察，进一步实验结果提示HS27细胞来源的诱导性多潜能干细胞能够在体外长期传代培养，且可维持人胚胎干细胞的生物学特性。总之，实验成功建立了人诱导性多潜能干细胞系，这为下一步构建人肿瘤细胞重编程的技术平台奠定了扎实的实验基础，为肿瘤病患个体化诊治提供了实验模型。

人诱导性多潜能干细胞系的建立

Establishment of human induced pluripotent stem cell lines

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