椎板切除模型大鼠局部应用绿原酸对硬膜外纤维化及硬脑膜粘连的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.009

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (5): 704-709.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.009

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椎板切除模型大鼠局部应用绿原酸对硬膜外纤维化及硬脑膜粘连的影响

王玉光¹，张超²，沈文³，郑晨¹，于鹏⁴，陆芸³

1天津医科大学，天津市 300070
2天津医科大学总医院，天津市 300070
3天津市泰达医院，天津市 300457
4文登市整骨医院，山东省文登市 264400

修回日期:2014-11-25 出版日期:2015-01-30 发布日期:2015-03-02
通讯作者: 陆芸，天津市泰达医院，天津市 300457
作者简介:王玉光，男，1988年生，黑龙江省漠河县人，蒙古族，天津医科大学在读硕士，主要从事骨外科研究。
基金资助:
天津市泰达医院资助项目(2011BHKL00312ZCZDSY02800)

Effects of topical application of chlorogenic acid on epidural fibrosis and dural adhesion in rat models of laminectomy

Wang Yu-guang¹, Zhang Chao², Shen Wen³, Zheng Chen¹, Yu Peng⁴, Lu Yun³

1Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
2General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
3Tianjin Taida Hospital, Tianjin 300457, China
4Wendeng Osteopath Hospital, Wendeng 264400, Shandong Province, China

Revised:2014-11-25 Online:2015-01-30 Published:2015-03-02
Contact: Lu Yun, Tianjin Taida Hospital, Tianjin 300457, China
About author:Wang Yu-guang, Studying for master’s degree, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by:
the Tianjin Taida Hospital Project, No. 2011BHKL00312ZCZDSY02800

摘要/Abstract

摘要：

背景：椎板切除减压能起到有效的脊髓神经减压作用，但该操作也会发生硬膜外纤维增生并突入椎管，致医源性椎管狭窄，发生持续或复发的腰腿疼痛。绿原酸是金银花的有效药理成分之一，主要有抗炎等作用。
目的：观察局部应用绿原酸对椎板切除模型大鼠硬膜外纤维化及硬脑膜粘连的影响。
方法：选用72只健康成年Wistar大白鼠，制备椎板切除模型，随机分成3组(n=24)。绿原酸组皮肤缝合前椎板切除区域给绿原酸溶液2 mL/只；生理盐水组给予等量的生理盐水；空白对照组术后不做任何处理。各组大鼠均于造模后4周被处死，进行实验评估，包括大体评价、组织学分析、羟脯氨酸含量测定及白细胞介素6、转化生长因子β1的表达情况。
结果与结论：3组大白鼠均进入结果分析，解剖并取样。绿原酸组硬膜外胶原纤维增生较少，外观较为正常；生理盐水组和空白对照组硬膜外胶原纤维明显增多，外观可见明显纤维瘢痕组织。组织学评价显示，绿原酸组的组织染色切片中成纤维细胞的密度明显比其他两组的成纤维细胞密度低。绿原酸组硬膜外纤维瘢痕的羟脯氨酸含量显著低于生理盐水组和空白对照组(P < 0.01)。通过RT-PCR方法测得绿原酸组白细胞介素6 和转化生长因子β1的表达低于另外两组。提示椎板切除模型大鼠局部应用绿原酸可以抑制成纤维细胞增殖，同时可以降低白细胞介素6 和转化生长因子β1的表达，防止硬膜外瘢痕粘连。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 脑及脊髓损伤模型, 硬膜外纤维化, 腰椎手术失败综合征, 椎板切除术, 绿原酸, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Laminectomy for decompression can effectively play an effect on spinal nerve decompression. However, this operation can induce epidural fibrosis and fibers broke into the spinal canal, result in iatrogenic spinal stenosis, persistent or recurrent leg pain. Chlorogenic acid is one of the effective pharmacological ingredient of honeysuckle, and has anti-inflammatory effects.
OBJECTIVE: To observe the effects of topical application of chlorogenic acid on epidural fibrosis and dural adhesion in rat models of laminectomy.
METHODS: A total of 72 healthy adult Wistar rats were selected to prepare models of laminectomy, and randomly assigned to three groups (n=24). In the chlorogenic acid group, rats were administered chlorogenic acid 2 mL/rat before skin suture in the laminectomy area. Rats in the physiological saline group were given an equal volume of physiological saline. Rats in the blank control group were not given any treatment. Rats in each group were sacrificed at 4 weeks after model establishment. The general assessment and histological analysis were conducted. Hydroxyproline contents, interleukin-6 levels, transforming growth factor-β1 expression were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: Rats in each group were involved in the final analysis, dissected and sampled. In the chlorogenic acid group, less epidural collagen fibers proliferated and the appearance of fibers was normal. In the physiological saline and blank control groups, many epidural collagen fibers proliferated, and their appearance showed obvious scar tissue. Histological evaluation exhibited that the density of fibroblasts was lower in the chlorogenic acid group than in other two groups. Hydroxyproline contents of epidural fibrous scar were significantly lower in the chlorogenic acid group than in the physiological saline and blank control group (P < 0.01). RT-PCR results demonstrated that interleukin-6 levels and transforming growth factor-β1 expression were lower in the chlorogenic acid group than in the other two groups. These data indicated that the topical application of chlorogenic acid in rat models of laminectomy could inhibit fibroblast proliferation, reduce interleukin 6 and transforming growth factor-β1 expression, and prevent epidural scar adhesion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Lumbar Vertebrae, Laminectomy, Chlorogenic Acid, Fibrosis

中图分类号:

R318

王玉光，张超，沈文，郑晨，于鹏，陆芸. 椎板切除模型大鼠局部应用绿原酸对硬膜外纤维化及硬脑膜粘连的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(5): 704-709.

Wang Yu-guang, Zhang Chao, Shen Wen, Zheng Chen, Yu Peng, Lu Yun. Effects of topical application of chlorogenic acid on epidural fibrosis and dural adhesion in rat models of laminectomy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(5): 704-709.

图/表（结果） 4

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引言

椎板切除减压是脊柱外科最常用的手术，是几乎所有脊柱后路手术都会应用的技术，能起到有效的脊髓神经减压作用。但该操作也会发生硬膜外纤维增生并突入椎管，致医源性椎管狭窄，发生持续或复发的腰腿疼痛，被称为腰部手术失败综合征^[1-2]。现在认为其发生的病因有硬膜外瘢痕的粘连、蛛网膜炎、椎管狭窄、椎间隙感染等，其中最根本的原因是硬膜外瘢痕粘连。硬膜外瘢痕粘连尽管可以通过手术切除松解，但粘连常在3-6个月后复发并再次引起症状，因此对于腰椎手术失败综合征的预防较治疗更为重。

关于术后硬膜外纤维化的病理生理机制尚无定论^[3]，但目前的主流观念是：纤维化形成是多因素和多方位作用的结果，既有血肿机化、纤维增生，也有炎症因子作用，硬膜外纤维化的形成是术后组织修复的一种正常生理过程，是不可避免的，也是不可逆转的。一旦形成，治疗效果较差，但可以通过某种手段抑制纤维细胞的增生，减少纤维粘连及改变其方向，因此对于硬膜外粘连预防重于治疗。

目前避免引起硬膜外纤维化的方式有多种，比如改进手术技术，术中微创理论^[4]。包括局部进行自体脂肪移植^[5-6]，应用明胶海绵替代自体脂肪移植，还有学者应用传统中药，如当归注射液等。尽管这些方法都有预防硬膜外纤维化的作用^[7]，但是无论哪种方法都没有取得医学界的广泛认可。

绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，其具有广泛生理活性和药理活性，如抗炎、抗菌、降压、增加白血球及兴奋中枢神经系统、抗肿瘤、降脂、清除自由基等多种药理作用，对消化系统、血液系统和生殖系统疾病均有显著疗效^[8-9]。因此，绿原酸在医药制剂上应用越来越广泛，是目前国际公认的“植物黄金”。绿原酸主要存在于杜仲、金银花、葵花籽粕、元宝枫等植物中，尤其是近几年研究发现，杜仲叶中含有较高的绿原酸，其含量为1%-5.5%。前期的实验研究发现许多具有抗炎、抗氧化的中药如当归等都具有抑制成纤维细胞增殖的作用^[10]，并且已有文献报道绿原酸具有抗肝脏纤维化的作用^[11-13]。

因此文章拟采用椎板切除模型大鼠对绿原酸抗纤维化的作用进行系统的深入研究，以期望将其开发成抗硬膜外纤维化的新药。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年1至7月在天津医科大学动物实验中心完成。

材料：

动物：选用成年健康Wistar大鼠72只，雌雄各半，由天津医科大学动物实验中心提供，许可证编号：SYXK(津)2014-0003。首先动物在20-25 ℃、明暗周期12 h、食物与水充足的实验室饲养1周，以适应实验环境。大鼠按随机数字表法分为3组，每组24只，雌雄各半：绿原酸组每只大鼠给予质量浓度为2.5 g/L的绿原酸溶液2 mL^[14]；生理盐水组给予等量的生理盐水；空白对照组在术后不做任何处理。

方法：

构建椎板切除模型大鼠的造模方法^[15]：无菌条件下，动物采用腹膜内麻醉，麻醉注射10%的水合氯醛(3 mL/kg)。术前对动物进行标号，采用俯卧位，对手术区域进行备皮，消毒。在L₁-L₂水平采用后入路^[16-17]，对L₁-L₂椎板进行完全切除，术中注意止血，严格保护硬脑膜及周围神经，绿原酸组皮肤缝合前椎板切除区域给绿原酸溶液2 mL/只；生理盐水组给予等量的生理盐水；空白对照组在术后不做任何处理。术后常规预防感染，以青霉素10×10⁴U/kg肌注，2次/d，连用3 d；常规饲料喂饲6周。

大体评价：动物造模后4周进行大体评估，所有大鼠随机选择，每组随机抽取6只。对动物进行麻醉，手术部位重新开放。硬膜外瘢痕粘连的大体评价基于双盲的视觉评分系统在双盲试验的基础上^[18]，评价人员对每只大鼠进行打分。0分：硬膜外瘢痕组织完全不附着于硬脑膜；1分：硬膜外瘢痕组织仅仅贴到硬脑膜，但容易解剖剔除；2分：硬膜外瘢痕组织粘连于硬脑膜，不容易解剖剔除；3分：硬膜外瘢痕组织牢固地附着在硬脑膜和无法解剖剔除^[19]。

组织学分析：所有动物在4周后被处死，每组随机抽取6只进行组织学分析，首先收集L₁-L₂硬膜外瘢痕组织,然后对组织用体积分数10%甲醛溶液进行固定、体积分数100%乙醇对组织进行脱水、切片、苏木精-伊红染色，最后在显微镜下观察成纤维细胞^[20]，并对镜下每400个视野内的成纤维细胞进行计数并评分。1分：镜下每400个视野成纤维细胞数小于100；2分：镜下每400个视野成纤维细胞数在100-200之间；3分：镜下每400个视野成纤维细胞数大于200^[21-22]。

羟脯氨酸含量的测定：人体蛋白质中以胶原蛋白含羟脯氨酸的量最多^[23]，而胶原蛋白是构成纤维结缔组织中胶原纤维的主要成分^[24]，因此可作为衡量纤维瘢痕生长情况的指标^[25]。造模后4周，同样每组随机抽取6只动物，收集L₁-L₂硬膜外瘢痕组织标本，经生理盐水清洗，酸水解法稀释处理后，在Bechman Du-7型紫外分光光度仪上比色检验样品中羟脯氨酸含量^[26]。

白细胞介素6和转化生长因子β1的表达情况：本实验采用RT-PCR扩增实验，采用RT-PCR试剂盒。造模后4周，从每组随机抽取6只大鼠，收集L₁-L₂硬膜外瘢痕组织标本，对组织进行研磨、裂解、匀浆，提取RNA, 然后应用反转录酶反转录合成cDNA第1链，最后对所需片段进行PCR扩增^[27-28]。转化生长因子β1和白细胞介素6引物如下：转化生长因子β1 (148 bp)，forward：5’-GCC CTG CCC CTA CAT TTG G-3’，reverse：5’-CTT GCG ACC CAC GTA GTA GAC GAT-3’；白细胞介素6(131 bp)，forward： 5’-ACC CCA ACT TCC AAT GCT CT 3’，reverse：5’-TGC CGA GTA GAC CTC ATA GTG ACC-3’；GAPDH(169 bp)， forward：5’-TCA CCA CCA TGG AGA AGG C-3’， reverse：5’-GCT AAG CAG TTG GTG GTG CA-3’。GAPDF用作内参。

主要观察指标：各组大鼠在造模后4周被处死，进行实验评估，包括大体评价、组织学分析、羟脯氨酸含量测定及白细胞介素6、转化生长因子β1的表达情况。

统计学分析：由作者采用SPSS 11.5软件进行数据处理，数据以x(_)±s表示，数据间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

炎症反应是活体组织对损伤因子所发生的防御反应^[29]，炎症增生是一种重要的病理变化，具有限制炎症的扩散和弥漫，使受损组织得以再生修复的作用。例如在炎症初期，增生的巨噬细胞具有吞噬病原体和清除组织崩解产物的作用^[30]；在炎症后期，增生的成纤维细胞和血管内皮细胞共同构成肉芽组织^[31]，有助于炎症局限化和最后形成瘢痕组织而修复。但过度的组织增生又对机体不利，例如肉芽组织过度增生，使原有的实质细胞遭受损害而影响器官功能。增生的细胞包括实质细胞和间质细胞，实质细胞的增生如慢性肝炎中的肝细胞增生；间质细胞的增生包括巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞^[32]，本课题中的硬膜外纤维化就属于间质细胞增生的一种。增生反应一般在炎症后期或慢性炎症时比较显著，而慢性炎症或炎症的后期，则增生性病变较突出。炎症发应、纤维化是硬膜外粘连病理特征，也是进一步向腰椎术后失败综合征发展的主要中间环节。目前研究认为纤维化是一个动态过程，可对病变进行干预。因此，控制炎症反应、纤维化的发展在临床上具有十分重要的意义。据报道炎性因子、羟脯氨酸、转化因子的含量与纤维化程度呈相关性，因此对于以上指标的抑制是非常重要的，特别是羟脯氨酸含量，羟脯氨酸亦是胶原蛋白的特有成分，纤维化的组织中羟脯氨酸的含量较正常组织中羟脯氨酸的含量高，测定组织的羟脯氨酸含量可反映组织纤维化程度。以上指标结合纤维化的直接证据-组织病理学观察，可较全面的评价组织纤维化的发生发展及治疗措施的作用。本实验表明，绿原酸可显著抑制炎性因子、羟脯氨酸、转化因子的升高，推测其炎症的作用，主要是通过抗炎和消除自由基而发挥作用^[33]。相关文献报道，首先，绿原酸有较强的抗菌消炎作用，桃叶珊瑚苷及其多聚体有明显的抑菌作用，桃叶珊瑚苷元对革兰氏阴性、阳性菌都有抑制作用。桃叶珊瑚苷有抑菌、利尿作用，并能促进伤口愈合；桃叶珊瑚苷与葡萄糖苷一起预培养后还会产生明显的抗病毒作用。其次，绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、丁香酸、丁基羟基茴香醚和生育酚。绿原酸之所以有抗氧化作用，是因为它含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性^[34]，从而保护组织免受氧化作用的损害，防止蛋白质等物质合成代谢发生障碍，从而阻止生物膜脂质过氧化实现的，抑制胶原纤维的增生及胶原纤维合成沉淀。

目前报道的预防硬膜外粘连既有药物，也用通过用药预防。材料绝大部分是利用其物理阻隔作用，防止纤维组织向椎管方向生长，但往往并不能减少纤维组织形成的量及后期塑形。其主要对后方来源的纤维组织效果较好，对源自前方的纤维粘连所起的作用十分有限，而药物能在体内扩散，达到更广泛的效果，如类固醇激素、非类固醇抗炎药、丝裂霉素等等^[35-36]。但通过全身或局部用药却有争议，有报道认为类固醇激素只能延缓纤维瘢痕组织的生成，并不能完全阻止其形成纤维粘连，非类固醇抗炎药只要通过抑制环氧化酶路径减少前列腺素的合成，限制炎性反应，从而减少成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白，促进成纤维细胞降解。但药物又缺乏物理阻隔的作用，因此有报道可以将预防粘连药物植入具有可降解特性的生物活性材料内^[37]，形成药物缓释复合物，这样早期利用材料进行阻隔，后期随着材料的降解，药物逐渐被缓释出来，发挥抗粘连的作用。本研究中绿原酸是一种中药提取物，其异构体异绿原酸和新绿原酸也存在于双子叶植物的果实、叶及其他组织中，为植物代谢的重要因素，具有广泛生理活性和药理活性，对透明酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制，对自由基的清抗脂质过氧化抗诱变及心血管扩冠、降脂有特殊功效，兼有抗菌，抗炎、保肝利胆作用^[38]。它通过下调炎性因子白细胞介素6和转化生长因子β1的表达，以及抑制胶原蛋白的生成来发挥抗纤维化的作用，但其抗纤维化的其他机制尚不明确，比如可以提出假设：绿原酸是否通过阻断核因子κB通路来达到抑制作用^[39-40]，这些都有待进一步研究。综上所述，绿原酸具有良好的抗纤维化的作用，纤维化是硬膜外粘连的病理基础，因此本实验将为其进一步开发提供科学依据，有望将其开发成为抗硬膜外纤维化新药。

结论：实验从不同水平对标本进行观察评估，于造模后4周同时进行椎板切除模型大鼠大体评价、组织学分析、羟脯氨酸含量测定以及炎症因子白细胞介素6、转化生长因子β1表达水平的定量分析，保证了实验结果的客观性。实验证明绿原酸具有抗炎、抑制成纤维细胞增殖等功效，局部应用可以抑制椎板切除模型大鼠硬膜外纤维化及硬脑膜的粘连。

椎板切除模型大鼠局部应用绿原酸对硬膜外纤维化及硬脑膜粘连的影响

Effects of topical application of chlorogenic acid on epidural fibrosis and dural adhesion in rat models of laminectomy

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