聚乙二醇对利福平-聚乳酸-羟基乙酸聚合物缓释微球性能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.03.017

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (3): 421-426.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.03.017

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聚乙二醇对利福平-聚乳酸-羟基乙酸聚合物缓释微球性能的影响

杨宗强¹，何胤¹，施建党²

¹宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750004；²宁夏医科大学总医院脊柱骨科，宁夏回族自治区银川市 750004

出版日期:2015-01-15 发布日期:2015-01-15
通讯作者: 施建党，主任医师，博士，宁夏医科大学总医院脊柱骨科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:杨宗强，男，1988年生，甘肃省庆阳市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事脊柱结核研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81360275)；宁夏自然科学基金项目(NZ13131)

Polyethylene glycol effects on the performance of rifampicin-polylactic acid-glycolic acid polymer microspheres

Yang Zong-qiang¹, He Ying¹, Shi Jian-dang²

¹Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; ²Department of Spinal Orthopedics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Online:2015-01-15 Published:2015-01-15
Contact: Shi Jian-dang, M.D., Chief physician, Department of Spinal Orthopedics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Yang Zong-qiang, Studying for master’s degree, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360275; the Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region, No. NZ13131

摘要/Abstract

摘要：

背景：聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球具有良好的生物相容性，是优良的药物缓释载体，但缓释微球的突释问题严重影响了其临床应用。

目的：观察聚乙二醇对利福平-聚乳酸-羟基乙酸聚合物缓释微球特征、载药率、包封率、体外释放规律及突释的影响。

方法：以高分子材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载体，采用复乳化-溶剂挥发法制备聚乙二醇-利福平-聚乳酸-羟基乙酸聚合物微球(实验组)和利福平-聚乳酸-羟基乙酸聚合物微球(对照组)。扫描电子显微镜观察两组聚合物缓释微球特征，高效液相色谱法检测两组微球在不同时段模拟体液中的利福平药物浓度及累计释放量，计算两组微球的载药量、包封率。

结果与结论：与对照组比较，实验组微球表面光滑、粒径减小、分散良好，包封率和载药量明显提高。实验组微球3 h内药物释放量最大，1 d左右药物释放趋于平稳稳定状态，1 d药物累计释放量小于20%；对照组微球3 h内药物释放量最大，约为实验组的1.5倍，1 d左右药物释放也趋于平稳状态。表明聚乙二醇可改善利福平-聚乳酸-羟基乙酸聚合物缓释微球的成球率，减小其粒径，增加其载药量和包封率，控制其突释现象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 缓释材料, 聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球, 聚乙二醇, 利福平, 突释, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Polylactic acid as a carrier has good biocompatibility, but the burst release of microspheres seriously affects their clinical application.

OBJECTIVE: To investigate the effects of polyethylene glycol on rifampicin-polylactic acid-glycolic acid microspheres in terms of morphologies, drug loading, encapsulation efficiency, in vitro release and burst release.

METHODS: Polylactic acid-glycolic acid polymer was used as a carrier, and polyethylene glycol-rifampicin-polylactic acid-glycolic acid polymer microspheres (experimental group) and rifampicin-polylactic acid-glycolic acid polymer microspheres were prepared using W/O/W emulsifying-solvent evaporation technique. The characteristics of two kinds of microscopes were observed by scanning electron microscopy, drug concentration and cumulative release of rifampicin in the simulated body fluid were detected using high performance liquid chromatography during different periods, and drug loading as well as encapsulation efficiency was also determined in the two groups.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, in the experimental group, the microspheres were found smooth surface, even distribution, decreased particle size and good dispersion, and the drug loading and encapsulation efficiency were evidently higher. In the experimental group, the largest amount of drug release of the microspheres was within 3 hours, the drug release tended to be stable at 1 day, and the cumulative drug release was less than 20% in1 day. In the control group, the largest amount of drug release was within 3 hours, but the amount was about 1.5 times than that of the experimental group, the drug release also tended to stable at 1 day. The study has shown that polyethylene glycol can improve the pelletizing ratio and reduce the particle size of rifampicin-polylactic acid-glycolic acid microspheres, increase the drug loading and encapsulation efficiency of rifampicin, and reduce the burst release in the process of rifampicin release.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: Biocompatible Materials, Delayed-Action Preparations, Polyglactin 910

中图分类号:

R318

杨宗强，何胤，施建党. 聚乙二醇对利福平-聚乳酸-羟基乙酸聚合物缓释微球性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(3): 421-426.

Yang Zong-qiang, He Ying, Shi Jian-dang. Polyethylene glycol effects on the performance of rifampicin-polylactic acid-glycolic acid polymer microspheres[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(3): 421-426.

图/表（结果） 3

2.1 扫描电镜表征分析扫描电子显微镜下观察聚合物缓释微球形态，实验组聚合物缓释微球成球规整，大部分呈圆形，分布均匀，表面光滑分散性好且彼此不粘连，成球率高，平均粒径为(5.21±0.40) µm(图1A，B)；对照组聚合物缓释微球椭圆形，表面凹凸不平，分散性差，彼此微球间粘连，成球率低，平均粒径为(7.19±0.41) µm(图1C，D)。采用成组t 检验，两组平均粒径比较差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.2 利福平标准曲线回归方程与非载药PLGA聚合物缓释微球的色谱图 HPLC法测定已知浓度的标准品，记录各浓度的峰面积，所得其线性回归方程为：Y= 9×10-5X + 0.103 1(R²=0.999 9)，标准曲线见图2。

2.3 聚合物缓释微球外缓释药物释放度 HPLC法分别检测实验组和对照组聚合物缓释微球浸提液3 h、6 h、 12 h、24 h、48 h、3 d、6 d、9 d、12 d各时间利福平的峰面积，将峰面积代入标准曲线方程：Y=9×10-5X+ 0.103 1(R²=0.999 9)计算得出相应释放浓度(图3A)，在分别计算不同时间点利福平的累积释药量(图3B)。

利福平-PLGA聚合物缓释微球的体外缓释实验表明，实验组聚合物缓释微球3 h内药物释放量最大，1 d左右药物释放趋于平稳稳定状态，1 d药物累计释放量小于20%；对照组聚合物缓释微球3 h内药物释放量最大，约为实验组的1.5倍，1 d左右药物释放也趋于平稳稳定状态，1 d药物累计释放量达40%左右。

2.4 聚合物缓释微球的载药量和包封率测量载药量和包封率是评价聚合物缓释微球两个重要的指标，随着载药量的不断增加，不仅可以缩小聚合物缓释微球的体积，有效提高组织体内各级毛细血管对药物的摄取，而且载药率越高表示聚合物缓释微球的制备效果越好。

包封率是指被包封在微球制剂中的药物量和投入药物量之比率，包封率越高说明制备过程中丢失的药物就越少，因此药物的利用率也就增大。

通过上述方法测得实验组5批聚合物缓释微球的载药量为(13.33±0.10)%，包封率为(76.74±0.54)%；对照组5批聚合物缓释微球载药量为(11.54±0.15)%，包封率为(72.35±0.46)%。采用成组t 检验，两组的载药量与包封率比较差异有显著性意义(P < 0.01)。

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引言

脊柱结核是结核分枝杆菌肺部感染的肺外局部表现，因此在脊柱结核治疗过程中必须采取系统与局部兼顾的综合治疗。目前外科手术治疗是脊柱结核有力的辅助治疗方法，抗结核化疗是脊柱结核治愈的根本^[1]。常规抗结核治疗方法是口服与静脉给药，这种常规给药方式难以保证脊柱结核病灶局部达到足够的药物浓度，是脊柱结核治疗的难点之一^[2-5]，且持续较低的局部抗结核血药浓度可导致病程延长及耐药菌株的出现^[6]，也成为目前脊柱结核治疗急需解决的两大难题，因此，近年来对于兼具药物缓释与成骨性能的局部药物缓释系统(local drug delivery system，LDDS)研究受得了高度重视^[7]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是由美国食品药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)认证通过的生物可降解高分子聚合物，被广泛应用于药物、蛋白质及其他一些大分子载体材料的研发领域，其中缓释微球由于具有适宜的释药性能及相对简单的制备方式，是PLGA材料具有良好应用前景的一种载体形式，其还具有良好的生物相容性和生物降解性，降解终产物是对人体无损害的二氧化碳和水且降解速度缓慢，可长达2个月左右^[8-11]。

目前，PLGA是一种理想的微球骨架材料，也是现阶段研究的热点，在药物缓释微球制备特别是缓-控释剂型方面的相关研究中尤为热门^[10^，^12]。载药PLGA缓释微球主要适用于口服生物利用度低、需要长期使用及半衰期短的药物^[13]，如抗结核药物、抗癌药物、化疗药物等，其优点是所载药物随着PLGA在体内的缓慢降解以一定速率释放，维持病灶局部有效的血药浓度，减少给药次数；载药PLGA缓释微球可以用作注射、口服、呼吸道吸入、皮下埋植或关节腔内注射等其他方式局部给药，也可减少药物本身的不良反应及耐药性的产生，增加了患者的依从性，减少了用药的总剂量，提高了治疗效果。然而，各种PLGA缓释微球给药初期进入体内在短时间内会迅速大量地释放药物，这种现象被称为“突释现象”。突释有可能导致局部或全身血药浓度接近或超过中毒水平，产生明显不良反应，突释程度一般用24 h的药物累积释放量来衡量。因此，PLGA缓释微球的突释已成为目前所有研究者面临的急需解决的问题。

聚乙二醇是一种线形聚醚二醇，常被用作非离子亲水聚合物，具有极强的溶解性，能溶于大部分溶剂，而且它无毒性、无免疫原性和抗原性，并且其能改善材料的亲水性，起到稳定剂的作用^[3^，^14]。因此，本实验采用PLGA的可控性降解，通过水/油/水(W₁/O/W₂)复乳化溶剂挥发制备载利福平-PLGA聚合物缓释微球，并添加一定量的聚乙二醇，探讨聚乙二醇对利福平-PLGA聚合物缓释微球载药性能的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：实验于2014年6至11月在宁夏医科大学分析中心实验室完成。

材料：

实验方法：

实验分组及研究指标：实验分为实验组和对照组，实验组是在利福平-PLGA聚合缓释微球的制作过程中加入一定量的聚乙二醇，同样条件下制备5批；对照组是在利福平-PLGA聚合缓释微球的制作过程中未加聚乙二醇，同样条件下制备5批。通过聚合物缓释微球外观形态及粒径的测量、载药率及包封率测量、体外缓释药物浓度测定及其突释，观察聚乙二醇对利福平-PLGA聚合物缓释微球的影响。

聚乙二醇-利福平-PLGA聚合物缓释微球的制备：准确称量50 mg利福平原药和500 mg PLGA溶于10 mL二氯甲烷中，超声振荡使其均匀分散形成油相(O)，将上述油相缓慢注入预先配置好的2 mL 2%聚乙烯醇溶液(内水相 W₁)，高速搅拌乳化30 min，使其均匀分散形成初乳乳液；将上述初乳溶液以60滴/min滴入50 mL 2%聚乙烯醇溶液(外水相 W₂)，外水相(W₂)中聚乙二醇的浓度始终为0.14%，持续搅拌形成复乳；将复乳溶液持续搅拌过夜，使二氯甲烷完全挥发，达到固化微球的目的(以上操作均在避光、密封、冰浴的条件下完成)。充分离心沉降微球，再经超纯水反复冲洗离心3次，冻干干燥并放置-20 ℃条件下避光保存备用。

利福平-PLGA聚合物缓释微球的制备：微球制备方法参考聚乙二醇-利福平-PLGA聚合物缓释微球的制备，但外水相中不加入聚乙二醇。

扫描电子显微镜表征分析：分别将实验组和对照组制备的缓释微球分散体滴至铝片表面，烘干，喷金后置于扫描电镜观察聚合物缓释微球的形态特征，分别观察300粒微球，测量出各个微球的直径，计算求出其平均粒径。

利福平-PLGA聚合物缓释微球浸提液的制备：分别准确称取50 mg实验组和对照组聚合物缓释微球，将其置于透析袋中，加入PBS(pH=7.4)2.5 mL，将密闭好的透析袋放入5 mL PBS装置中，严格于3 h、6 h、12 h、24 h、 48 h、3 d、6 d、9 d、12 d各时间点取浸提液5 mL，每次取样后向原缓冲液中及时补加5 mL PBS。聚合物缓释微球浸提液用0.22 µm滤器过滤后避光保存，备高效液相色谱仪检测用。

检测内容：按规定时间点对两组利福平-PLGA聚合物缓释微球浸提液样本中利福平浓度进行检测，计算单位时间段内药物的累计释放度。

高效液相色谱仪对浸提液药物浓度检测条件：采用CN5，250 mm、4.6 mm色谱柱，流动相为0.01 mol/L庚烷磺酸钠(纯磷酸滴定pH至2.2)∶乙腈为45∶55，检测波长270 nm，柱温为30 ℃，进样体积为20 µL，流速为1 mL/min。

利福平标准曲线的建立及回归方程的计算：利用利福平标准品分别配置成5个质量浓度梯度的溶液：0.210，0.525，1.050，2.100，5.250 mg/L，将配置好的标准溶液用HPLC法依据先前设置的液相条件依次进样测定，记录峰面积。以峰面积(X)为横坐标，质量浓度(Y)为纵坐标作图，计算曲线回归方程。

利福平-PLGA聚合物缓释微球浓度、累计释放度的计算：利用HPLC在上述色谱条件下检测不同时间点两组聚合物缓释微球浸提液中利福平对应曲线峰面积(X)，代入曲线回归方程中计算缓释微球释药浓度，再通过公式计算出每次取样时间点的累计释放度：

X%=[(M₁+M₂+…+M_n)/M_总]×100%。

聚合物缓释微球的载药量和包封率测量：实验采用上述高效液相色谱条件下测定两组聚合物缓释微球包封率及载药量。精确分别称取20 mg两组聚合物缓释微球，以一定量的二氯甲烷使其完全溶解，甲醇定容至100 mL，超声后HPLC法测定药物含量并按如下公式计算载药量：

载药量=微球中含药量/载药PLGA微球总质量× 100%。

将两组制备的备用微球称量后，以一定量的二氯甲烷完全溶解，甲醇定容至100 mL，超声后HPLC法测定药物含量并按如下公式计算包封率：

包封率=微球中实际含药量/理论投药量×100%。

主要观察指标：两组缓释微球的特征、载药率、包封率、体外释放规律及缓释效果。

统计学分析：由并列第一作者采用SPSS 21.0统计软件处理分析，所得数据以x(_)±s表示，采用成组t 检验，P < 0.01表示有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

随着医学科学领域的不断发展，局部给药系统受到国内外研究者的重视，特别是控释-缓释微球。控释-缓释微球的材料必须需要具有以下几点特征：有良好的生物相容性；具有生物降解性；有良好的载药性及定向性、细胞渗透性^[15]。目前用于制备缓释微球的材料有天然衍生和人工合成的高分子材料，如壳聚糖、明胶、聚乳酸聚合物等。大量文献报道表明，聚乳酸具有良好的生物相容性及可降解性，无致癌致畸性，可以植入人体，其合成原料为可再生资源，已被广泛应用于药物缓释系统、骨折材料、手术缝合线等医用领域^[16-18]。 PLGA缓释微球是目前研究的热点，由于载药PLGA缓释微球初期有明显的突释，Hirota等^[19]制备载利福平-PLGA微球并在老鼠肺泡内检测其药物浓度，结果表明利福平- PLGA微球为达到预期的目标，主要原因是载药量、包封率低，药物代谢时间快，并且突释明显，所以很少直接将其应用于临床疾病治疗，也是目前研究者面临的困难，也是必须解决的问题。PLGA缓释微球产生突释的原因主要有以下几点：聚合物的性质，微球制备参数，PLGA微球体外释放时的影响，球制备方法等因素^[13^，^20]。

聚合物的组成及有机相浓度对缓释微球的形态、粒径影响较大。相关文献研究表明，随着共聚物中乙交酯比例的提高，聚合物微球粒径也随之增大；聚合物在溶解过程中其有机相浓度增大，聚合物微球粒径也随之变大^[21-23]。其主要原因是有机相浓度越大，聚合物微球发生碰撞的概率越高；同时，有机相浓度越大，意味着聚合物分子间相互作用越强，在水中分散效果越差，这两方面的作用使聚合物微球粒径变大。本实验在多次重复微球制作方法的过程中，采用不同的方式向外水相中滴加初乳滴，滴加初乳的方式严重影响聚合物的成率和粒径大小，但未见相关文献明确报道，只有小部分研究者在实验操作过程中采用透析袋分装加压的方式成球，成球率高，粒径分布均匀^[24]。Wu等^[25]在制备载左氧氟沙星-PLGA微球过程中在内水相中加入聚赖氨酸和透明质酸，研究结果显示明显改善了其载药率和包封率。在本实验中通过向外水相中加入一定量的聚乙二醇，使得聚合物缓释微球的表面形态光滑，粒径减小，分散良好。这是因为聚乙二醇具有良好的水溶性且具有稳定剂的作用。微球在复乳乳化成球过程中，覆盖在聚合物缓释微球表面，维持微球的表面形态，从而使微球表面光滑，聚乙二醇的空间位阻作用使得聚合物微球相互碰撞的概率减少，聚集的概率也相应减少，故粒径变小。

微球制备参数对微球形态、粒径、载药量及包封率有重要影响。本实验采用黄术等^[26]制备利福平-PLGA缓释微球的最佳工艺(PLGA浓度15%、PVA浓度2%、油/水比 1∶5)制备实验组和对照组聚合物缓释微球。谢鑫鑫等^[27]在制备载呋喃二烯的PLGA微球中加入聚乙二醇修饰载药微球，包封率为50%，载药量在10%左右，载药率包封率明显高于未见入聚乙二醇的载药PLGA微球。本实验中向外水相中加入一定量的聚乙二醇，对利福平有良好的包封效果，结果表明实验组聚合物利福平缓释微球的载药量和包封率明显较对照组高，此机制可能与Jeffery等^[28]报道蛋白质聚合物微球相同，即聚乙二醇的加入使外水相的黏度升高．使得微球表面稳定，利福平在聚合物乳化、稳定、固化成球的过程中不易大量丢失。

PLGA微球体外缓释时，一些释放条件如释放介质、释放温度、振摇幅度、取样时的离心速度及取样的频繁程度等都将影响微球的突释程度。本实验以PBS为释放介质，实验操作过程中实验组和对照组均为统一标准。从利福平-PLGA聚合物缓释微球的体外缓释实验表明，实验组聚合物缓释微球3 h内药物释放量最大，1 d左右药物释放趋于平稳稳定状态，1 d药物累计释放量小于20%；对照组聚合物缓释微球3 h内药物释放量最大，约为实验组的1.5倍，1 d左右药物释放也趋于平稳稳定状态，1 d药物累计释放量达40%左右，由此，可见加入聚乙二醇后可稳定聚合物缓释微球，减少利福平的突释，使得利福平-PLGA缓释微球平稳释放，从图3可以看出缓释微球于2 d左右趋近零级反应。

目前，对于制备聚乳酸缓释微球主要有乳化溶剂挥发法、相分离法、喷雾干燥法、超临界流体技术等，而复乳液中干燥法为最常用的微球制备方法^[29-30]。Hasan等^[31]也认为药物突释是目前PLGA应用的难点，所以对其制备方式进行研究，结果表明复乳化-溶剂挥发法制备PLGA微球能够缓解药物突释。本实验采用常用的复乳溶剂挥发技术制备利福平聚合物微球，该方法简便易操作且重复性好，药物的载药率和包封率较高。

综上所述，本实验在实验过程中外水相加入聚乙二醇，增加了外水相黏度，改善了材料的亲水性，稳定了微球的表面形态及与药物的相容性，进一步提高了利福平-PLGA的包封率、载药率，控制了其突释。本实验的利福平-PLGA缓释微球在体外缓释浓度均大于利福平10倍的最低抑菌MIC^[32]，为继续对载药微球研究解决突释问题奠定了基础，为脊柱结核病灶局部用药提高血药浓度提供一定的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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聚乙二醇对利福平-聚乳酸-羟基乙酸聚合物缓释微球性能的影响

Polyethylene glycol effects on the performance of rifampicin-polylactic acid-glycolic acid polymer microspheres

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