人参皂苷对不同强度电离辐射损害人造血干细胞的缓解作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：国内外诸多学者和机构都在研究如何缓解辐射损害，寻找最合适的药物，而人参皂苷作为名贵中药人参的主要药理成分，具有明显的抗氧化作用。
目的：探讨人参总皂苷对不同强度电离辐射损害人造血干细胞的缓解作用及其作用机制。
方法：采集健康人脐血，分离培养得到CD34⁺造血干细胞，分为未处理组和人参皂苷预处理组，之后分别用1，2，5 Gy的X射线对细胞照射24 h。MTT检测细胞增殖活性，应用流式细胞仪测定各组内的活性氧水平，AV/PI双染检测各组细胞的凋亡率，最后用Western blot和Real-time PCR对各组细胞内caspase-3和Nrf-2水平进行定量分析。
结果与结论：治疗剂量的电离辐射可以诱导CD34⁺细胞活性下降，同时诱导其发生凋亡，而且细胞内的活性氧活性也呈现进行性升高，这种作用与电离辐射的剂量相关，用人参皂苷进行预处理后，上述作用可得到明显缓解。Western blot和PCR检测结果显示人参皂苷Rb3可以有效抑制由电离辐射引起的caspase-3表达活性增强，另外还可以促进Nrf-2在CD34⁺细胞内的表达。结果表明人参皂苷可以有效抑制电离辐射诱导CD34⁺造血干细胞的损伤，这种保护作用很可能与其抗凋亡和抑制氧化应激作用相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 造血干细胞, 人参皂苷, 电离辐射, 活性氧, Nrf-2, 陕西省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Many domestic and foreign scholars and institutions are studying how to relieve radiation damage and to find the most suitable drug, while ginsenosides as the main pharmacological ingredient of ginseng show significant antioxidant effect.
OBJECTIVE: To investigate the ease effect of ginsenosides on human hematopoietic stem cells under different intensities of ionizing radiations.
METHODS: The CD34⁺ hematopoietic stem cells were isolated from the healthy cord blood. Then the cells were divided into normal group and ginsenoside-pretreated group, respectively, exposed under 1, 2, 5 Gy of X-ray irradiations for 24 hours. Cell viability was detected in irradiated hematopoietic stem cells by MTT assay. Apoptosis was estimated using the following assays: Annexin-V assay, caspase-3 mRNA and protein levels. The generation of reactive oxygen species was evaluated, in the presence or absence of ginsenoside in liquid cultures of CD34⁺ human hematopoietic stem cells irradiated with 1-, 2- and 5-Gy X-rays, using a flow cytometry assay. The Nrf-2 mRNA and protein levels were also studied by western blot analysis and RT-PCR, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Ionizing radiation at the therapeutic dose could decrease the viability of CD34⁺ cells and induce the cell apoptosis, and meanwhile, the activity of intracellular reactive oxygen species also showed a progressive increase that was correlated with the dose of ionizing radiation. However, ginsenoside pretreatment could relieve these above-mentioned effects. Ginsenoside inhibited the increase in caspase-3 activity induced by ionizing radiation, and additionally, enhanced the mRNA and protein expressions of Nrf-2 in CD34⁺ cells. In conclusion, ginsenoside protects CD34⁺ hematopoietic stem cells from radiation effects, which is probably correlated with anti-apoptosis and anti-oxidant roles of ginsenosides.

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Key words: Hematopoietic Stem Cells, Ginsenosides, Radiation, Ionizing

中图分类号:

R394.2

黄颖，梁晓燕，李骋进，胡军，周理乾. 人参皂苷对不同强度电离辐射损害人造血干细胞的缓解作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 124-129.

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图/表（结果） 3

2.1 电离辐射诱导造血干细胞活性下降，发生凋亡以及诱导大量活性氧释放 首先对0，1，2，5 Gy辐射量下造血干细胞的细胞活性进行了测定，结果见图1A。结果显示，随着辐射剂量的增加，存活细胞百分比呈现出进行性下降的趋势，而且辐射组与未辐射组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。

选取AV/PI双染中AV⁺细胞作为凋亡细胞进行了计数，统计学分析见图1B，可见随着辐射剂量的增加，AV⁺的造血干细胞数显著增多，也表现为进行性的上升趋势。

之后，分别选取辐射后30 min，24 h两个时间点，对各实验组细胞内活性氧的含量进行了测定，由图1C可以看到，造血干细胞在受到辐射30 min后即可出现不同程度的活性氧释放，其中2 Gy和5 Gy组的释放量与0 Gy组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。而当造血干细胞经电离辐射诱导24 h后，细胞内活性氧释放量增多更明显，其中1 Gy组和2 Gy组与0 Gy组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。还需要注意的是，5 Gy组在24 h时间点检测到的活性氧释放量与0 Gy组差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 人参皂苷对电离辐射诱导造血干细胞出现的凋亡及活性氧释放有一定的缓解作用 选用了5 μmol/L的人参皂苷对经受电离辐射的造血干细胞进行了预处理后，发现电离辐射诱导造血干细胞出现的凋亡及活性氧释放有一定的缓解作用。

首先，图1A中MTT结果显示，人参皂苷预处理后，造血干细胞活性与未处理组相比明显增强(P < 0.05)；同时，AV/PI的结果(图1B)也表明，经人参皂苷预处理后AV⁺细胞百分比也明显减少(P < 0.05)；另外，活性氧检测结果显示(图1C，D)，5 μmol/L的人参皂苷预处理后，各辐射剂量组活性氧释放量差异均无显著性意义，但5.0 mol/L人参皂苷组与未处理组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)。这也表明了人参皂苷在一定程度上可以抑制电离辐射诱导的造血干细胞活性的下降、凋亡和活性氧的释放。

2.3 人参皂苷抑制Caspase-3表达，同时促进Nrf-2表达 为了对人参皂苷的这种作用机制进行进一步分析，分别对各组细胞内的Caspase-3和Nrf-2两种蛋白进行了Western blot测定(图2A)，结果显示，电离辐射可以促进造血干细胞内Caspase-3的表达，而这也正是其促进造血干细胞凋亡的原因，同时发现，当用5 μmol/L人参皂苷对造血干细胞进行预处理后，则可以部分抑制这种由电离辐射所诱导的Caspase-3的表达(图2B)，另外，对Nrf-2的测定结果显示，5 μmol/L人参皂苷预处理同时还可以促进各组造血干细胞内Nrf-2的表达(图2C)，这很可能与其保护作用相关。

进一步对Caspase-3和Nrf-2这两种蛋白进行了RT-PCR的定量测定，结果也与Western blot的检测结果一致(图3)。

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引言

材料方法

设计：单因素设计实验。

时间及地点：实验于2013年11月至2014年11月在陕西省人民医院中心实验室完成。

材料：脐血由陕西省人民医院检验科采集。供者为身体健康、发育良好的非高龄产妇，无遗传病史，无血液系统疾病，无寄生虫及地方病，HIV、肝炎、梅毒等检测均为阴性。

实验方法：

人造血干细胞的分离培养：脐血由陕西省人民医院检验科采集。每次实际采集脐血50-120 mL。采用磁珠细胞分选免疫磁性吸附柱分离装置，用CD34⁺细胞选择试剂盒按其说明进行CD34⁺细胞的分离与纯化，培养21 d。

造血干细胞电离辐射处理：细胞按照1×10³密度接种于96孔板，分为未处理组和人参皂苷组(5.0 μmol/L)，应用直线加速器给予X射线的照射，剂量率为2.60 Gy/min，照射时间分别为0，23，46，115 s，辐射剂量分别为0，1，2，5 Gy。然后加入新鲜的培养基，37 ℃下置入体积分数为5% CO₂培养箱内继续培养。

造血干细胞活性检测：细胞活性检测采用MTT法。按照操作说明书，首先将1 g/L的MTT加入各组细胞内，37 ℃下培养3 h。然后倒掉培养液，加入二甲基亚砜，上酶标仪(美国Bio-Tek公司)在550 nm波长下测定各组细胞的吸光度，最后结果以百分比表示。

活性氧水平测定：电离辐射作用6 h和24 h后，每个样本收集大约5×10⁵细胞，按照说明书，向各试验孔内添加50 μmol/L H2DCFDA，37 ℃条件下避光染色30 min，之后收集各孔内细胞，用PBS清洗后进行重悬，然后上流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，调整激发波长至490 nm，发射波长为527 nm，最后用CellQuest软件分析荧光相对强度。

AV/PI双染测定细胞凋亡率：分别设置空白对照组、AnnexinV-FITC单阳性组、PI单阳性对照组以便后期调零。首先用胰酶消化各实验组细胞，制备成单细胞悬液后，800 r/min离心5 min后弃去上清液，用PBS冲洗2次，1 000 r/min下再离心5 min；然后按照AnnexinV-FITC/PI试剂盒说明书加入200 µL结合缓冲液轻轻重悬细胞，加入10 µL PI溶液和5 µL AnnexinⅤ，混匀后冰浴避光下室温染色30 min；再向每管内补足AnnexinV-FITC/PI结合缓冲液至500 µL后上流式细胞仪(美国BD公司)检测。结果中AV^-PI^-为活细胞，AV⁺PI^-为早期凋亡细胞，AV^-PI⁺为晚期凋亡细胞或坏死细胞，AV⁺PI⁺为坏死细胞。

Western blot检测Caspase-3和Nrf-2蛋白的表达：将各组细胞按照1×10⁶密度接种于培养瓶内，按照每2×10⁶细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液提取细胞。取出所需测定的样品，沸水中煮5 min使蛋白变性，然后置入0.5 mL的离心管内，加入5×SDS的缓冲液，电泳槽内加入足够电泳液，40 V条件下进行电泳4.0-5.0 h。终止后取出胶块，由下向上依次按照纸、膜、胶、纸的顺序置入转膜装置内，120 V电压下持续30-60 min。完成后取出膜，标记，然后将膜用丽春红染色10 min，用清水冲洗掉染液，晾干备用，接下来进行免疫反应，封闭液置入平皿内，用TBS将膜浸透置入，室温下进行摇动封闭，持续1 h；选取一抗，用TBS按照1︰1 000将其稀释至1 mL后，于杂交袋内加入转有目的蛋白的膜面，置入冰箱内过夜后取出，再用TBS冲洗3次，每次10 min；将二抗用TBS按照1∶100稀释至1 mL，再次杂交袋内加入转有目的蛋白的膜面，置于室温下2 h后取出，TBS冲洗3次，每次10 min，然后参考试剂说明书用DAB显色法显影，将胶片拍照，用Image Pro Plus对结果进行统计学分析。

Real-time PCR检测caspase-3 mRNA和Nrf-2 mRNA的表达：根据 GENEBANK 中发表的基因序列，应用 Primer 5.0 软件设计引物，使用Golden 1^st cDNA Synthesis Kit试剂盒，各组样品的总RNA 均取1 μg，加5×Golden RT MasterMix 4 μL，加20×Oligo dT(15)& Random Primer 1 μL，加无RNA酶水稀释至 20 μL，轻轻混匀后稍离心，放在PCR仪上，设置30 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，反应产物立即置于冰上或-0 ℃保存备用。选择较适宜的模板浓度，使Ct值在15-30之间，调整不同硫酸黏菌素处理组样品模板浓度相近，便于后续试验的比较。所有样品在96孔板内均至少做3个重复孔。PCR扩增反应条件：预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 5 s，退火和延伸60 ℃ 31 s，40个循环；采用7300 system软件，应用相对定量??Ct法分析基因表达的相对差异。将PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值定义为阈值，设定阈值时所经历的循环数，而每个反应管内荧光信号到达阈值的PCR循环数为Ct值。该实验的Ct值、扩增曲线和熔解曲线由PCR仪自动给出。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

主要观察指标：存活细胞百分比，凋亡百分比，活性氧活性，caspase-3和Nrf-2的蛋白及mRNA表达。

统计学分析：为确保所有实验的可重复性，上述各实验均分别独立进行3次。实验所得的计量数据均采用x(_)±s来表示，使用统计分析中的Student’s t 检验对任意两组之间的均数资料进行比较，采用统计分析中的单因素方差分析one-way ANOVA进行多组之间的均数比较。实验所得的所有数据全部录入统计学软件SPSS 20.0，然后再进行进一步的处理和分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

众所周知，大量电离辐射会对人体造成一定的损害，其中造血组织对电离辐射非常敏感。据报道，1-7 Gy的电离辐射均会诱导造血干细胞发生不同程度的损伤^[12]。本课题中，选取临床上分次放疗的平均剂量1-5 Gy进行研究^[13]。而选取浓度为5.0 μmol/L的人参皂苷做为实验剂量，是因为之前的研究已经证实，人参皂苷在5.0 μmol/L时可以显著起到抗氧化作用^[14]。

细胞活性检测结果显示，受到电离辐射的CD34⁺细胞活性明显下降，而且这种下降趋势可以在一定程度上被人参皂苷所抑制。MTT的实验原理是通过测定线粒体膜上的琥珀酸脱氢酶的活性来测定细胞活性^[15]，从而推断，人参总皂苷的这种作用正是通过对线粒体产生保护作用实现的，而线粒体正是活性氧产生的主要场所^[16]。

通过实验进一步发现，治疗剂量的电离辐射在30 min后即可诱导CD34⁺细胞生成大量的活性氧，而且活性氧的水平与辐射剂量相关，证实此时细胞的氧化状态已经发生了变化。在细胞经过辐射继续培养24 h后，大量的细胞已经死亡，但是整体的活性氧水平仍然要明显高于对照组，作者推测可能是因为细胞在受到电离辐射刺激死亡后，残存的细胞为了避免发生凋亡会继续进行增殖，而且研究证实成熟的CD34⁺细胞在增殖过程中所产生的活性氧水平要远高于未成熟的CD34⁺细胞^[17]。但是实验还发现，5 Gy剂量电离辐射下，CD34⁺细胞的活性氧水平已经基本持平，这很可能是因为高剂量的电离辐射激活某种抗氧化机制，使得活性氧表达下降^[18]。但是当用人参总皂苷预处理CD34⁺细胞后，发现细胞的活性氧水平受到显著抑制，这种抑制在电离辐射量为2 Gy和5 Gy时最明显。活性氧水平的抑制也会进一步减缓细胞凋亡的发生。

实验结果显示，CD34⁺细胞在电离辐射下会发生凋亡，而当用人参皂苷预处理后，凋亡细胞数明显减少，证实人参皂苷也有抑制凋亡的作用，而这种作用也是通过其对细胞内线粒体的保护作用实现的。Caspase-3在细胞凋亡的信号转导通路中起着至关重要的作用，它是死亡受体介导的细胞凋亡途径中的关键启动子。Caspase-3的活性增强就意味着细胞即将向凋亡进展^[19]。通过对caspase-3进行定量测定后证实，电离辐射可以诱导造血干细胞内caspase-3的表达增强，而人参皂苷可以有效抑制caspase-3的表达，这很可能是人参皂苷抑制电离辐射诱导造血干细胞凋亡的一个作用机制。

Nrf-2是一种与氧化应激密切相关的转录因子，它可以直接激活细胞内含抗氧化基因的蛋白表达，从而起到对抗细胞氧化的作用^[20]。另外，大量的体内和体外研究也证实Nrf-2可以有效抑制各种病理状态下引起的线粒体功能改变^[21]。这也说明，Nrf-2的这种抗氧化作用与线粒体作用相关。而蛋白定量结果显示，在电离辐射的作用下，CD34⁺细胞内的Nrf-2蛋白随着时间延长呈现进行性下降趋势，而当用人参皂苷预处理后，Nrf-2蛋白呈现出高表达的趋势，可见，人参皂苷的抗氧化作用很可能与促进Nrf-2的表达相关。另外，目前的研究表明，人参皂苷含有Rb3、Rg1、Rf2、Rh2和Rd等多种活性成分^[22]，但激活Nrf-2的表达到底是哪种单体起作用，这还有待更进一步的研究。

结论：实验证实，治疗剂量的电离辐射也会导致造血干细胞内发生氧化微环境的改变，而人参皂苷可以通过抑制造血干细胞内活性氧的释放来改变细胞内的微环境，从而对电离辐射下的造血干细胞起到一定保护作用。而且这种保护作用很可能是一方面通过抑制造血干细胞内caspase-3的表达来抑制造血干细胞凋亡，另一方面，通过促进Nrf-2的表达来抑制活性氧的大量释放来实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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