芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.018

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (1): 101-107.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.018

• 干细胞与中医药 stem cells and traditional Chinese medicine • 上一篇下一篇

芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响

晁二涛¹，白海²，王存邦²，葸瑞²，欧剑锋²，赵强²

1甘肃中医学院，甘肃省兰州市 730050
2解放军兰州军区兰州总医院全军血液病中心，甘肃省兰州市 730050

修回日期:2014-11-19 出版日期:2015-01-01 发布日期:2015-01-01
通讯作者: 白海，博士，主任医师，教授，解放军兰州军区兰州总医院全军血液病中心，甘肃省兰州市 730050
作者简介:晁二涛，男，1987年生，河南省获嘉县人，汉族，甘肃中医学院在读硕士，主要从事干细胞基础研究。
基金资助:
甘肃省科技重大专项(1102FKDA005)

Effects of paeoniflorin on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

Chao Er-tao¹, Bai Hai², Wang Cun-bang², Xi Rui², Ou Jian-feng², Zhao Qiang²

1Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
2Hematology Center, General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Revised:2014-11-19 Online:2015-01-01 Published:2015-01-01
Contact: Bai Hai, M.D., Chief physician, Professor, Hematology Center, General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Chao Er-tao, Studying for master’s degree, Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
Supported by:
the Major Science and Technology Project of Gansu Province, No. 1102FKDA005

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究显示芍药苷具有补血及治疗自身免疫性疾病的功效，骨髓间充质干细胞对机体的造血及免疫功能也起着重要的作用，但芍药苷对骨髓间充质干细胞的增殖及细胞因子的分泌和表达有何影响报道较少。
目的：探讨芍药苷对人骨髓间充质干细胞增殖及白细胞介素6表达的影响。
方法：采用密度梯度离心法和贴壁培养法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，用流式细胞术和成脂及成骨诱导法鉴定人骨髓间充质干细胞生物学特性，MTT法检测不同浓度芍药苷对人骨髓间充质干细胞增殖的影响，ELISA 法测定芍药苷干预人骨髓间充质干细胞后培养上清液中白细胞介素6的分泌水平，RT-PCR 检测芍药苷干预后白细胞介素6 mRNA的表达情况。
结果与结论：成功分离出骨髓间充质干细胞，具有成骨、成脂分化潜能。与对照组相比，芍药苷浓度为2 μmol/L和10 μmol/L可明显促进骨髓间充质干细胞增殖。10 μmol/L芍药苷干预骨髓间充质干细胞后，G₀/G₁期细胞比例显著降低，S期细胞比例显著升高。10 μmol/L芍药苷干预组骨髓间充质干细胞白细胞介素6的分泌和mRNA表达均显著高于对照组(P < 0.01)。由此得出，一定浓度的芍药苷可促进骨髓间充质干细胞增殖，并提高骨髓间充质干细胞分泌白细胞介素6水平和基因表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 芍药苷, 骨髓间充质干细胞, 细胞增殖, 白细胞介素6

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that paeoniflorin functions as replenishing blood and treatment of autoimmune diseases, and bone marrow mesenchymal stem cells also play an important role in the body’s blood and immune function. However, paeoniflorin effects on bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and cytokine secretion and expression are rarely reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of paeoniflorin on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and the expression of interleukin-6.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells were separated and cultured in vitro by density gradient centrifugation combined with attachment method. The biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells were identified by flow cytometry and osteogenic/adipogenic induction. The proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells under different concentrations of paeoniflorin was detected by MTT method. The mRNA expression and secretion of interleukin-6 in the supernatant of bone marrow mesenchymal stem cells were detected by RT-PCR and ELISA, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated successfully and had osteogenic and adipogenic differentiation potential. Compared with the control group, 2 μmol/L and 10 μmol/L paeoniflorin significantly promoted the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. 10 μmol/L paeoniflorin could significantly decrease the proportion of bone marrow mesenchymal stem cells in G0/G1 phase and increase this proportion in S phase. Compared with the control group, the experimental group could significantly increase the secretion and mRNA expression of interleukin-6 (P < 0.01). It is concluded that paeoniflorin at certain concentrations can obviously promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells, and increase the expression and secretion of interleukin-6.

全文链接：

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Interleukin-6

中图分类号:

R394.2

晁二涛，白海，王存邦，葸瑞，欧剑锋，赵强. 芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 101-107.

Chao Er-tao, Bai Hai, Wang Cun-bang, Xi Rui, Ou Jian-feng, Zhao Qiang. Effects of paeoniflorin on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(1): 101-107.

图/表（结果） 7

2.1 骨髓间充质干细胞的形态学观察 将采用密度梯度离心法分离获得的细胞接种于培养皿中，倒置相差显微镜下观察可见：细胞形态均一，呈多角形或圆形。培养24 h后细胞开始贴壁，两三天后贴壁细胞逐渐增多，形态呈梭形或多角形；第5-7天可见贴壁的细胞呈集落状、漩涡状方式生长，形态呈纺锤状、成纤维细胞样；第12-14天细胞紧密排列，覆盖培养皿底部80%-90%，见图1A。传代后细胞生长迅速，5-7 d可达90%融合，细胞形态均匀，呈长梭形，排列规则，见图1B，C。

2.2 骨髓间充质干细胞表型鉴定 用流式细胞仪检测细胞免疫表型显示，细胞高表达CD29，CD44和CD105，阳性率分别达到99.68%，99.23%和98.96%。低表达CD34，CD45和HLA-DR，阳性率分别为1.68%，0.76%和0.97%，见图2。

2.3 成骨成脂诱导分化 骨髓间充质干细胞具有成骨分化潜能，在成骨诱导液中培养骨髓间充质干细胞，随着培养时间的延长，细胞形态逐渐变为短梭形、多边形，持续诱导28 d后行茜素红染色，可见红色矿化的钙结节形成。成脂诱导21 d后行油红O染色，细胞胞浆内出现大量的脂质颗粒。

2.4 芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响 MTT检测结果表明，芍药苷与骨髓间充质干细胞共培养后，骨髓间充质干细胞的吸光度值增加明显，2 μmol/L和10 μmol/L浓度的实验组与对照组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)，2 μmol/L和10 μmol/L两个浓度间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，0.4，50，250 μmol/L浓度对骨髓间充质干细胞促增殖作用不明显(P > 0.05)。10 μmol/L芍药苷培养24，48，72 h后，各个时间段增殖率相比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)。由此说明，芍药苷对骨髓间充质干细胞的促增殖作用呈时间依赖性但无剂量依赖性，达到一定的药物浓度后骨髓间充质干细胞增殖率不再增加，见表1。

2.5 芍药苷对骨髓间充质干细胞细胞周期的影响 经流式细胞仪检测显示，对照组骨髓间充质干细胞G₀/G₁期比例明显高于S期和G₂/M期，G₀/G₁期比例在85%以上，与其生物学特性相符。与对照组相比，2 μmol/L和10 μmol/L芍药苷组细胞G₀/G₁期比例显著降低，S期和G₂/M期比例显著升高(P < 0.05)，10 μmol/L芍药苷对骨髓间充质干细胞细胞周期的影响最为显著(P < 0.05)，见表2，图3。

2.6 芍药苷干预后骨髓间充质干细胞分泌白细胞介素6水平 ELISA法测定培养上清液中白细胞介素6水平，结果显示10 μmol/L芍药苷组骨髓间充质干细胞白细胞介素6的分泌量明显高于对照组(P < 0.05)，见图4。

2.7 芍药苷干预骨髓间充质干细胞后白细胞介素6基因的表达 RT-PCR法检测结果显示，经2，10 μmol/L芍药苷诱导后骨髓间充质干细胞中白细胞介素6 mRNA表达明显高于对照组(P < 0.01)，见图5。由此证明芍药苷可促使骨髓间充质干细胞高表达白细胞介素6基因，并明显提升白细胞介素6的分泌水平。

参考文献

[1] Gordon MY, Goldman JM, Gordon-Smith EC.Spatial and functional relationships between human hemopoietic and marrow stromal cells in vitro.Int J Cell Cloning. 1983;1(6): 429-439.
[2] Gordon MY, Kearney L, Hibbin JA.Effects of human marrow stromal cells on proliferation by human granulocytic (GM-CFC), erythroid (BFU-E) and mixed (Mix-CFC) colony-forming cells.Br J Haematol. 1983;53(2):317-325.
[3] Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B,et al.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells.Lancet. 2004;363 (9419):1439-1441.
[4] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S,et al.Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium.Nature. 2001;410(6829): 701-705.
[5] Toma C, Pittenger MF, Cahill KS,et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart.Circulation. 2002;105(1):93-98.
[6] Yoon YS, Wecker A, Heyd L,et al.Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction.J Clin Invest. 2005; 115(2):326-338.
[7] Catenacci DV, Schiller GJ.Myelodysplasic syndromes: a comprehensive review.Blood Rev. 2005;19(6):301-319.
[8] Garayoa M, Garcia JL, Santamaria C,et al.Mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients display distinct genomic profile as compared with those from normal donors. Leukemia. 2009;23(8):1515-1527.
[9] Semple JW, Milev Y, Cosgrave D,et al.Differences in serum cytokine levels in acute and chronic autoimmune thrombocytopenic purpura: relationship to platelet phenotype and antiplatelet T-cell reactivity.Blood. 1996;87(10):4245-4254.
[10] 郭平,宋卓彦,王升启. 芍药苷对辐射致血虚小鼠骨髓蛋白质表达的影响[J].中药药理与临床,2007,23(4):17-19.
[11] 高月,马增春,谭洪玲,等.四物汤及其提取物对辐射致血虚证小鼠造血作用的研究[J].天津中医药,2003,20(6):47-51.
[12] 郭平,郭霞. 芍药苷对辐射致血虚证小鼠骨髓细胞白介素及其受体基因表达的作用[J].中药药理与临床, 2009,25(5): 25-27.
[13] Carrancio S, Blanco B, Romo C,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells for improving hematopoietic function: an in vitro and in vivo model. Part 2: Effect on bone marrow microenvironment.PLoS One. 2011;6(10):e26241.
[14] Casiraghi F, Azzollini N, Cassis P,et al.Pretransplant infusion of mesenchymal stem cells prolongs the survival of a semiallogeneic heart transplant through the generation of regulatory T cells.J Immunol. 2008;181(6):3933-3946.
[15] Krampera M, Glennie S, Dyson J,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 2003;101(9):3722-3729.
[16] Benvenuto F, Ferrari S, Gerdoni E,et al.Human mesenchymal stem cells promote survival of T cells in a quiescent state. Stem Cells. 2007;25(7):1753-1760.
[17] Li H, Guo Z, Jiang X,et al.Mesenchymal stem cells alter migratory property of T and dendritic cells to delay the development of murine lethal acute graft-versus-host disease. Stem Cells. 2008;26(10):2531-2541.
[18] Selmani Z, Naji A, Zidi I,et al.Human leukocyte antigen-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T cells.Stem Cells. 2008;26(1):212-222.
[19] Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E,et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions.Blood. 2006;107(1):367-372.
[20] Tabera S, Pérez-Simón JA, Díez-Campelo M,et al.The effect of mesenchymal stem cells on the viability, proliferation and differentiation of B-lymphocytes.Haematologica. 2008;93(9): 1301-1309.
[21] Asari S, Itakura S, Ferreri K,et al.Mesenchymal stem cells suppress B-cell terminal differentiation.Exp Hematol. 2009; 37(5):604-615.
[22] Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E,et al.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions.Blood. 2006;107(1):367-372.
[23] Spaggiari GM, Capobianco A, Becchetti S,et al.Mesenchymal stem cell-natural killer cell interactions: evidence that activated NK cells are capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit IL-2-induced NK-cell proliferation.Blood. 2006;107(4):1484-1490.
[24] Spaggiari GM, Capobianco A, Abdelrazik H, et al. Mesenchymal stem cells inhibit natural killer-cell proliferation, cytotoxicity, and cytokine production: role of indoleamine 2,3-dioxygenase and prostaglandin E2.Blood. 2008;111(3): 1327-1333.
[25] Jiang XX, Zhang Y, Liu B,et al.Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells.Blood. 2005;105(10):4120-4126.
[26] Spaggiari GM, Abdelrazik H, Becchetti F,et al.MSCs inhibit monocyte-derived DC maturation and function by selectively interfering with the generation of immature DCs: central role of MSC-derived prostaglandin E2.Blood. 2009;113(26): 6576-6583.
[27] Zhang B, Liu R, Shi D,et al.Mesenchymal stem cells induce mature dendritic cells into a novel Jagged-2-dependent regulatory dendritic cell population.Blood. 2009;113(1):46-57.
[28] English K, Barry FP, Mahon BP.Murine mesenchymal stem cells suppress dendritic cell migration, maturation and antigen presentation.Immunol Lett. 2008;115(1):50-58.
[29] Le Blanc K, Tammik C, Rosendahl K,et al.HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells.Exp Hematol. 2003;31(10):890-896.
[30] Hirano T.Interleukin 6 and its receptor: ten years later.Int Rev Immunol. 1998;16(3-4):249-284.
[31] Levy Y, Tsapis A, Brouet JC.Interleukin-6 antisense oligonucleotides inhibit the growth of human myeloma cell lines.J Clin Invest. 1991;88(2):696-699.
[32] Landgraf K, Brunauer R, Lepperdinger G,et al.The suppressive effect of mesenchymal stromal cells on T cell proliferation is conserved in old age.Transpl Immunol. 2011; 25(2-3):167-172.
[33] Djouad F, Charbonnier LM, Bouffi C,et al.Mesenchymal stem cells inhibit the differentiation of dendritic cells through an interleukin-6-dependent mechanism.Stem Cells. 2007;25(8): 2025-2032.
[34] Shi D, Ma A, Zheng H,et al.Paeoniflorin inhibits the maturation and immunostimulatory function of allergen-induced murine dendritic cells.Int Immunopharmacol. 2014;19(2):221-232.
[35] Li CR, Zhou Z, Zhu D,et al. Protective effect of paeoniflorin on irradiation-induced cell damage involved in modulation of reactive oxygen species and the mitogen-activated protein kinases.Int J Biochem Cell Biol. 2007;39(2):426-438.
[36] Wu H, Li W, Wang T,et al.Paeoniflorin suppress NF-kappaB activation through modulation of I kappaB alpha and enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis in human gastric carcinoma cells.Biomed Pharmacother. 2008;62(9):659-666.
[37] 郭平,王升启.芍药苷对人骨髓基质细胞HFCL蛋白质表达的作用[J].中草药,2006, 37(8):1206-1210.
[38] 陈少清,林建平,王诗忠,等.芍药苷促椎间盘纤维环细胞增殖的作用[J].中国组织工程研究,2013,17(2):254-258.

引言

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是中胚层发育的早期细胞，主要特点是能够自我更新和多向分化，由于骨髓间充质干细胞取材方便、易分离、可在体外大量扩增及免疫排斥反应低等优点，成为组织工程理想的种子细胞，也是临床细胞疗法理想的干细胞来源。

骨髓间充质干细胞是造血微环境的重要组成成分，可在结构和生理上支持造血细胞的存活、增殖和分化，而骨髓造血干祖细胞在造血微环境的影响下分化发育成不同类型的成熟血细胞，维持机体正常造血功能；骨髓间充质干细胞还可促进移植后造血干细胞的归巢，促进造血重建，调节淋巴细胞的免疫功能，减轻移植物抗宿主病，因此骨髓间充质干细胞被广泛应用于血液系统疾病的治疗^[1-3]。骨髓间充质干细胞在组织修复中也扮演着重要角色，通过直接分化成不同的组织细胞或分泌一些有益于组织修复的营养因子来修复受损组织^[4-6]。

骨髓间充质干细胞除了具有造血调控、组织修复功能外，还具有抑制免疫和抗炎的免疫调节效应，这些新的功能为其临床应用开辟了新的途径，特别是骨髓间充质干细胞作为细胞免疫疗法用于骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、器官移植、移植物抗宿主病和一些自身免疫性疾病的治疗^[7-9]。

芍药是经典补血名方四物汤的组成药物之一，具有养血柔肝之功效，芍药苷(Paeoniflorin，Pae)是芍药的主要活性单体，研究表明芍药苷不仅具有补血功效，还能调节机体的免疫功能，芍药苷可促进骨髓基质细胞增殖，提高粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子等造血细胞因子的分泌水平，降低造血抑制因子巨噬细胞炎症蛋白的分泌水平，以直接和间接两种方式改善造血微环境，影响骨髓的造血功能；芍药苷还可通过上调血虚证小鼠骨髓细胞白细胞介素6、白细胞介素4受体、白细胞介素7受体等基因表达，促进骨髓造血细胞的增殖，诱导髓系细胞的分化、发育和成熟，调节和活化淋巴细胞的免疫功能，从而发挥补血和免疫调节功能^[10-12]。另外，白芍总苷(含芍药苷不少于40.0%)已被广泛应用于类风湿性关节炎的临床治疗，且疗效确切，对强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮等多种自身免疫性疾病的治疗也显示出良好的应用前景。

本实验以体外培养骨髓间充质干细胞的方式，探讨芍药苷对骨髓间充质干细胞的增殖及白细胞介素6表达的影响，以期从细胞水平阐明芍药苷的补血及免疫调节机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2013年3月至2014年3月在解放军兰州军区兰州总医院血液病研究所完成。

材料：

骨髓：来自成人健康志愿者。

药物：芍药苷(中国食品药品生物制品检定所)。

引物：由大连宝生物服务有限公司合成。

主要试剂：低糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)；Ficoll淋巴细胞分离液、胰蛋白酶、噻唑蓝、二甲基亚砜(美国Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)；白细胞介素6 ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；荧光标记兔抗人抗体CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-PE、HLA-DR-FITC(美国eBioscience公司)；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(大连宝生物公司)。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离与培养：用骨髓穿刺法，从成年健康志愿者的髂后上棘处抽取骨髓约5 mL，肝素抗凝，用适量的PBS稀释，缓慢加在密度为1.073 g/mL的人淋巴细胞分离液中，2 000 r/min离心20 min，取中间白膜层(单核细胞层)，用L-DMEM不完全培养液洗涤2次，再用 L-DMEM完全培养液(含体积分数为10%胎牛血清和青、链霉素100 U/mL)重悬细胞并计数，以2×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于25 cm²培养瓶中，置于体积分数为5%CO₂、饱和湿度、37 ℃的二氧化碳培养箱中培养，48 h后换液去除非贴壁细胞，以后每3 d换液1次。待细胞融合率达80%-90%时，用PBS洗涤2遍后0.25%胰蛋白酶消化，以1︰4的比例传代。每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
骨髓间充质干细胞表面标志鉴定：取培养至第3代的骨髓间充质干细胞，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%乙二胺四乙酸)消化，PBS洗涤2遍后制成1×10⁹ L^-¹单细胞悬液，分别加入抗CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-PE、HLA-DR-FITC单克隆抗体各5 μL，室温避光反应40 min，PBS洗涤2遍并重悬细胞后，用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原的表达(计数细胞数为5×10³)，并用Cell-Quest软件分析。

骨髓间充质干细胞成骨成脂诱导分化：取第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种到6孔板中，置体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱中培养，细胞融合达80%-90%时，弃培养上清，加入成骨诱导培养液(含体积分数为10%胎牛血清、0.2 mmol/L维生素C、10 μmol/L地塞米松和10 mmol/L β-甘油磷酸钠的L-DMEM培养液)，诱导培养28 d后，茜素红染色鉴定。

取第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种到6孔板中，置体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱中培养，细胞融合达80%-90%时，弃培养上清，加入成脂诱导培养液(含体积分数为10%胎牛血清、10 μmol/L地塞米松、5 mg/L胰岛素、0.5 μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和 60 μmol/L吲哚美辛的L-DMEM培养液)，诱导培养21 d后，油红O染色鉴定。

芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响：取第3代或第4代骨髓间充质干细胞，接种于96孔培养板中，每孔200 μL (含2×10³个细胞)，待细胞贴壁后，吸去培养液，实验组用终浓度分别为0.4，2，10，50，250 μmol/L的含芍药苷完全培养液干预骨髓间充质干细胞，对照组仅用完全培养液培养细胞，每组5个复孔，置于饱和湿度、37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24，48，72 h，弃去培养液，每孔加入20 μL MTT溶液(0.5 g/L)，培养4 h，然后小心吸尽MTT，每孔加入二甲基亚砜150 μL，置摇床上轻振10 min，在酶标仪570 nm波长处检测吸光度(A)值，按照下列公式计算细胞相对增殖率：细胞增殖率(%)=(药物组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。

流式细胞仪检测细胞周期：将生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，以2×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于25 cm²培养瓶中，培养24 h后换液，实验组加含2或10 μmol/L芍药苷的培养液，对照组只换完全培养液。继续培养48 h后，消化细胞，用预冷PBS洗涤2次后，加入预冷体积分数为70%乙醇，4 ℃固定过夜，经PBS洗涤及离心收集细胞后，加入500 μL含50 mg/L碘化乙锭、100 mg/L RNA水解酶、0.2%曲拉通X-100的PBS，4 ℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。

ELISA 法测定细胞培养上清白细胞介素6水平：取第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔板中，分实验组和对照组，实验组培养液中芍药苷终浓度为10 μmol/L，对照组培养液不含芍药苷。待细胞融合至90%时，收集细胞培养上清，按人白细胞介素6 ELISA试剂盒说明检测细胞培养上清液中白细胞介素6水平。

RT-PCR法检测白细胞介素6的表达：取第3代骨髓间充质干细胞，以2×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔板中，实验组芍药苷终浓度分别为2和10 μmol/L(各2个复孔)，对照组只含完全培养液，培养72 h后收集细胞，按TRIZOL试剂盒说明提取细胞总RNA，反转录反应严格按RT-PCR试剂盒提供步骤进行操作。白细胞介素6上游引物5’-GTA GCC GCC CCA CAC AGA CAG CC-3’，下游引物5’-GCC ATC TTG GAA GGT TCA GG-3’。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 g/L溴化乙啶)，用计算机凝胶成像系统进行吸光度扫描分析，以β-actin基因作为内参基因，测定各组骨髓间充质干细胞内白细胞介素6基因的表达情况，进行半定量分析。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞形态学观察及表型鉴定。②骨髓间充质干细胞的成骨成脂分化能力。③芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响。④芍药苷干预后骨髓间充质干细胞白细胞介素6的表达和分泌情况。

全文链接：

讨论

骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞，与造血祖细胞相比，骨髓间充质干细胞在骨髓中数量很少，但在提供支持造血的生长因子方面有着关键性作用，骨髓间充质干细胞通过与造血细胞密切接触，产生和分泌多种细胞因子，对造血干、祖细胞的增殖、分化和发育及造血细胞的储存、释放和归巢起重要的调控作用^[13]。由于骨髓间充质干细胞具有多种作用于T细胞^[14-18]、B细胞^[19-22]、自然杀伤细胞^[23-24]、树突状细胞的效应^[25-28]，包括抑制某些机制诱导的T细胞、B细胞的活化和增殖，诱导产生CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞(Treg)以及影响树突状细胞的成熟等，所以近年来许多研究都集中在骨髓间充质干细胞的免疫抑制潜能方面，作为细胞免疫抑制剂的骨髓间充质干细胞已应用于临床试验，而MHCⅠ类、Ⅱ类分子缺乏以及共刺激因子低表达使骨髓间充质干细胞有更低的免疫原性^[29]。因此，骨髓间充质干细胞对于保持机体造血和免疫功能的稳定方面具有重要作用。

白细胞介素6是一种多功能的细胞因子，主要由T细胞产生，也可由成纤维细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞产生，并能作用于多种靶细胞，且可与其他细胞因子相互作用，除了具有免疫增强作用和造血促进作用外，还可参与炎症反应，具体表现为可以促进B细胞增殖分化和分泌抗体，促进T细胞增殖分化和表达白细胞介素2受体，协同白细胞介素3促进造血干细胞的分化和巨噬细胞的成熟，加速肝细胞合成急性期蛋白等。但白细胞介素6的生物学活性具有比较明显的双重性，即一方面具有很重要的生理意义，另一方面则参与多种疾病的病理过程，例如多发性骨髓瘤、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、膜增生性肾小球肾炎的发病过程，且白细胞介素6的产生水平与此类疾病的严重程度有关^[30-31]。研究表明骨髓间充质干细胞可通过升高白细胞介素6和血管内皮生长因子的分泌水平，抑制T细胞增殖，抑制骨髓祖细胞分化成树突状细胞^[32-33]，由此说明白细胞介素6在骨髓间充质干细胞介导的免疫调节效应中起到了一定的作用，因此实验检测了芍药苷对骨髓间充质干细胞表达白细胞介素6的影响。

芍药苷是中药芍药的主要活性成分，具有补血、调节免疫、抗炎止痛、保肝、抗肿瘤、抗血小板聚集等多种作用。近年来许多研究都集中在芍药苷的补血、调节免疫、保护细胞损伤以及抗肿瘤作用方面^[34-37]，有研究发现，芍药苷对椎间盘纤维环细胞有明显的促增殖作用^[38]，可促使骨髓基质细胞由G₀/G₁期进入S期，促进骨髓基质细胞增殖及多种蛋白质合成和表达，上调骨髓细胞白细胞介素6的基因表达，从而发挥补血及免疫调节作用^[12^，^33]，芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖、细胞周期及白细胞介素6分泌和基因表达有何影响报道较少。

实验从成年健康志愿者骨髓中分离、培养骨髓间充质干细胞，用贴壁培养法纯化后，观察细胞形态为成纤维样细胞，呈漩涡状生长；用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标志显示不表达或低表达CD34、CD45、HLA-DR，高表达CD29、CD44、CD105；经诱导培养后，证明骨髓间充质干细胞具有成骨、成脂分化潜能。通过以上形态学、细胞表型特征及具有多向分化潜能等方面证实分离得到的细胞为骨髓间充质干细胞。

采用不同浓度的芍药苷与骨髓间充质干细胞共培养，MTT法检测芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响，结果表明2 μmol/L和10 μmol/L的芍药苷能促进骨髓间充质干细胞增殖，其中以10 μmol/L的芍药苷作用最明显，且促增殖作用呈时间依赖性；流式细胞仪检测细胞周期显示：骨髓间充质干细胞与10 μmol/L芍药苷共培养后更多的骨髓间充质干细胞由G₀/G₁期进入S期，骨髓间充质干细胞增殖指数显著升高。研究结果也显示高浓度的芍药苷对骨髓间充质干细胞的促增殖作用并不明显，由此推测，不同浓度芍药苷对细胞的作用机制及作用途径或许存在差异，这有待进一步的研究证实。

研究发现，骨髓间充质干细胞经10 μmol/L芍药苷诱导培养后，骨髓间充质干细胞的白细胞介素6分泌和mRNA表达均高于对照组(P < 0.01)，说明芍药苷促进骨髓间充质干细胞增殖的同时，可使骨髓间充质干细胞高表达白细胞介素6基因，并促进其细胞外分泌白细胞介素6。由此推测，芍药苷或许是通过促进骨髓或外周血中骨髓间充质干细胞的增殖，促使其高分泌白细胞介素6等细胞因子进而影响造血细胞及免疫细胞的功能。

实验结果显示芍药苷促进骨髓间充质干细胞分泌白细胞介素6，但以往研究证实，多发性骨髓瘤、类风湿关节炎等疾病患者相关组织中白细胞介素6水平通常高于健康人，芍药苷对类风湿关节炎等自身免疫性疾病也有明确的治疗效果，因此作者推测，芍药苷在不同浓度时或许存在一个双向的调节作用，可能和中药的使用剂量有关，但也不排除作为一种天然药物活性成分的芍药苷，或许可以通过其他机制或对其他免疫细胞的作用途径改变人体相应组织中细胞因子的含量来改善造血和免疫机能，从而改善类风湿关节炎等疾病的病情。但本研究还是从一个侧面阐明了芍药苷的补血及免疫调节机制。

芍药苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响

Effects of paeoniflorin on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[5]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.