体外扩增自体脂肪来源干细胞移植恢复鼻黏膜功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：体外扩增的自体脂肪来源干细胞具有多向分化的潜能，在组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
目的：观察自体脂肪来源干细胞移植受损人鼻黏膜组织的结构和功能变化。
方法：选取因物理或化学因素造成鼻黏膜损害的患者10例，其中6例黏膜瘢痕，4例黏膜破溃，抽取自体脂肪组织进行脂肪来源干细胞体外分离、培养、扩增，移植前进行质量安全性检测。6例患者在黏膜瘢痕基底部、4例患者在黏膜破溃处注射移植脂肪来源干细胞(1×10⁷/cm²)，共注射3次，每2次间隔15 d。末次注射移植后30，90，150 d分别行鼻腔容积、最小横断面积、黏膜纤毛清除功能测定，其中3例患者在移植前和移植后30 d，取0.1 cm×0.1 cm黏膜组织，进行苏木精-伊红染色、Masson三色染色、AB-PAS染色。
结果与结论：脂肪来源干细胞注射移植后，所有患者临床症状得到缓解。与移植前比较，脂肪来源干细胞注射移植后30，90，150 d鼻腔容积及鼻腔最小横断面积有所减少(P < 0.05)，鼻黏膜纤毛清除功能有所改善，但差异无显著性意义(P > 0.05)。与移植前相比，脂肪来源干细胞移植30 d时3例患者鼻黏膜炎症明显减轻，胶原纤维排列整齐、沉积减少，杯状细胞分泌的黏蛋白增多。结果证明了体外扩增的脂肪来源干细胞可以重建鼻黏膜结构和恢复其功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 自体脂肪间充质干细胞, 鼻黏膜, 修复重建, 组织细胞移植, 间充质干细胞, 鼻黏膜瘢痕, 鼻黏膜溃疡, 鼻腔容积, 最小横断面积, 鼻黏膜纤毛清除功能

Abstract:

BACKGROUND: The ex-vivo expanded autologous adipose-derived stem cells have the capability of multipotential differentiation and have a broad application prospect in the field of tissue engineering and regenerative medicine.
OBJECTIVE: To observe the nasal mucosal structural repair and functional reconstruction using ex-vivo expanded autologous adipose-derived stem cells.
METHODS: Ten patients with mucosal damage due to the physical or chemical factors were enrolled, including six cases of mucosal scar and four cases of mucosal ulceration. Autologous adipose tissue was extracted for in vitro isolation, culture and expansion of adipose-derived stem cells. Before transplantation, quality safety testing was done. All the patients were injected adipose-derived stem cells (1×107/cm2) at an interval of 15 days, totally for three times. Nasal volume, minimum cross-sectional area, and mucociliary clearance function were determined at 30, 90, 150 days after the final injection. Three of 10 patients were selected to take a 0.1 cm×0.1 cm mucosal tissue sample at 30 days before and after transplantation for hematoxylin-eosin staining, Masson trichrome staining, and AB-PAS staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Clinical symptoms were alleviated in all patients undergoing transplantation of adipose-derived stem cells. Compared with the baseline data, the nasal volume and minimum cross-sectional area were both decreased at 30, 90, 150 days after transplantation (P < 0.05), and the mucociliary clearance function was improved but not significantly (P > 0.05). Compared with the baseline data, the inflammation of the nasal mucosa was significantly reduced, collagen fibers arranged neatly, the deposition was decreased, and mucin secreted from goblet cells was increased in the selected three patients at 30 days after cell transplantation. These findings indicate that ex-vivo expanded autologous adipose-derived stem cells can be used to reconstruct the nasal mucosal structure and its function.

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Key words: Stem Cells, Adipose Tissue, Nasal Mucosa, Mucociliary Clearance

中图分类号:

R394.2

刘洋，贾德进，闫俊灵，李梁，陈冲，王程，丁红，汤苏阳. 体外扩增自体脂肪来源干细胞移植恢复鼻黏膜功能[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 72-77.

Liu Yang, Jia De-jin, Yan Jun-ling, Li Liang, Chen Chong, Wang Cheng, Ding Hong, Tang Su-yang. Ex-vivo expansion of autologous adipose-derived stem cells for the recovery of nasal mucosal function[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(1): 72-77.

图/表（结果） 4

2.1 脂肪来源干细胞原代培养及体外扩增 原代细胞呈现椭圆形，待细胞培养24-48 h 后可见大部分细胞贴壁，成梭形(图1A)。7 d后细胞基本融合成单层，呈长梭形排列(图1B)。待细胞传到3代时，经显微镜观察可见贴壁细胞呈长梭形，偶见鱼群样分布(图1C)。

脂肪来源干细胞染色体的形态、结构和数目均未见异常，呈二倍体结构，显示其核型稳定(图2)。

流式细胞仪检测细胞免疫表型(图3)：CD90、CD105表达呈阳性，阳性率>95%；CD34、CD45和HLA-DR表达阴性，阳性率< 2%。

2.2 临床表现 10例患者脂肪来源干细胞注射移植后鼻黏膜基底、鼻黏膜周围组织未出现明显红、肿、分泌物异常、感觉障碍等症状。10例患者3-7 d后自感鼻黏膜湿润，通气时黏膜的挛缩感消失，分泌物较移植明显增加，睡眠质量明显改善。
2.3 鼻腔容积、最小横断面积、黏膜纤毛清除功能测定结果 见表1。与脂肪来源干细胞注射移植前相比，鼻腔容积及鼻腔最小横断面积有所减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。鼻黏膜纤毛清除功能虽有所改善，但统计学分析显示差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 不良反应 脂肪来源干细胞注射移植后的所有患者均未发生过敏感染现象。

2.5 苏木精-伊红染色 对黏膜组织苏木精-伊红染色后，各组黏膜表现见图4。

在显微镜下可观察到脂肪来源干细胞注射移植前鼻黏膜切片中有明显的淋巴细胞、中性粒细胞浸润(图4A)；而脂肪来源干细胞注射移植后30 d鼻黏膜切片中淋巴细胞、中性粒细胞浸润较少(图4B)。

2.6 Masson三色染色 对黏膜组织行Masson三色染色后，各组黏膜表现见图5。

在显微镜下可观察到脂肪来源干细胞注射移植前鼻黏膜中胶原纤维呈粗而排列紊乱，腺体间胶原纤维沉积严重(图5A)；而脂肪来源干细胞注射移植后30 d在鼻黏膜切片中显示胶原纤维排列整齐，腺体间胶原纤维沉积较少(图5B)。

2.7 AB-PAS染色 对黏膜组织AB-PAS染色后，各组黏膜表现见图6。

在显微镜下可观察到脂肪来源干细胞注射移植前鼻黏膜表面由杯状细胞产生的黏蛋白不连续(图6A)；黏膜下腺体代偿性增生，脂肪来源干细胞注射移植后30 d鼻黏膜表面由杯状细胞产生的黏蛋白呈连续分布(图6B)。

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引言

材料方法

设计：脂肪来源干细胞的体外分离、培养、扩增与患者随访分析。

时间及地点：于2014年3至5月在武装警察部队总医院皮肤再生科完成。

对象：纳入因物理或化学因素造成鼻黏膜损害的患者10例，其中男6例，女4例；年龄25-30岁，平均28岁；黏膜瘢痕6例，黏膜破溃4例；无其他系统性疾病。所有患者在脂肪来源干细胞注射移植前均签订知情同意书，并经武装警察部队总医院伦理委员会批准。

纳入标准：鼻黏膜损害的患者，伴有鼻黏膜干燥、出血、异常分泌物以及通气异常等症状。

排除标准：①患有精神类疾病者。②患有血液系统或免疫系统疾病者。③对治疗结果过度期望的患者。④患有严重脏器疾病者。⑤有急、慢性传染病患者。

方法：

脂肪来源干细胞的体外分离、培养、扩增、冻存、复苏：入选患者行血液常规检查(凝血4项、血常规、血生化)及传染病抗原抗体检测(肝炎5项、性病2项)。从患者下腹部或大腿外侧通过吸脂手术抽取15-20 mL脂肪，离心 (1 000 r/min，5 min)，取上层脂肪组织及下层细胞。向脂肪组织中加入0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶，放入37 ℃的水浴摇床中消化30 min，离心700×g/min，5 min，留取下层细胞，将两次离心后的下层细胞混匀，加PBS重悬细胞，再次离心700×g/min，5 min。原代培养基重悬细胞后接种至培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养，记为P0代，观察细胞生长情况。

首次第3天半量换液，以后每3 d换液1次，待原代细胞达90%融合时传代培养，用0.05%胰蛋白酶消化，按照1︰4的比例传代。传至第3代(P3)时按《中华人民共和国药典》^[10]2010年版三部附录ⅫA无菌检测法进行检测，采用全自动微生物培养检测系统检测支原体、人源特定病毒、猪源病毒、内毒素以及细胞形态、细胞活性、染色体核型、免疫表型。

脂肪来源干细胞黏膜下注射移植：6例患者在黏膜瘢痕基底部、4例患者在黏膜破溃处，进行脂肪来源干细胞注射移植(1×10⁷/cm²)，从开始第一次注射时间起，每两次间隔15 d，共进行3次。

主要观察指标：脂肪来源干细胞末次注射移植后30，90，150 d分别行鼻腔容积、最小横断面积、黏膜纤毛清除功能测定。

鼻声阻力检测鼻腔容积和最小横断面积：受试者在安静的检查室内进行测量, 室温25-30 ℃，相对湿度70%-90%，受试者于检查室内静坐20 min后保持端坐位，使用美国Eccovision鼻声反射仪(Hood Labs)进行检测。取适合鼻孔大小的鼻腔探头并使用密封胶，以达到既密封鼻腔又不使鼻翼变形的目的，嘱受试者摒住呼吸，发射声波10-12 s，得到相应的面积-距离曲线，记录鼻腔最小横截面积和鼻腔容积。

鼻腔最小横截面积正常值：男性为(0.66±0.18) cm²，女性为(0.61±0.11) cm²；鼻腔容积正常值：男性为(15.71± 3.57) cm³，女性为(15.37±3.84) cm³。

糖精清除试验检测黏膜纤毛清除功能：受试者正坐位，清除鼻腔分泌物，平静呼吸，在肉眼下，将糖精(直径≤1 mm)置入受试者下鼻甲表面，距下鼻甲头端1 cm，放置后开始计时，嘱受试者每隔30 s吞咽1次，受试者不能饮食和擤鼻子，感到甜味时计时结束。试验时间正常范围是20-40 min，> 40 min为鼻黏膜纤毛清除能力减弱。

3例患者(1例黏膜瘢痕患者和2例黏膜破溃患者)因需要30 d后行鼻中隔手术，同意在脂肪来源干细胞注射移植前和注射移植后30 d，取0.1 cm×0.1 cm黏膜组织，采用苏木精-伊红染色检测黏膜炎症反应、Masson三色染色检测胶原纤维排列沉积情况、AB-PAS染色检测杯状细胞黏蛋白的分泌情况。

统计学分析：采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据结果以x(_)±s表示，脂肪来源干细胞注射移植后各时间点与移植前数据作比较，采用One-way ANOVA方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脂肪来源干细胞作为种子细胞，具有空间记忆性和对局部环境做出反应的特性^[11]，是实现组织修复重建生理功能的新途径^[12]。脂肪来源干细胞具有多向分化的潜能^[13-14]，还具有来源丰富、获取方便、操作简单、损伤程度小、扩增能力强、表型稳定、低免疫原性、遗传稳定、促进伤口愈合^[15-16]、组织修复等特点^[17]。国外在应用脂肪来源干细胞治疗结肠炎取得了很好的效果^[18]，在国内还正在开发阶段。

正常鼻、鼻窦黏膜上皮完整连续，黏膜表面平整光滑，基底膜无增厚，间质无水肿，炎性细胞极少，腺体及其导管无扩张^[19]。黏膜为假复层柱状纤毛上皮，由纤毛柱状细胞、基底细胞、柱状细胞和杯状细胞组成，以纤毛柱状细胞为主^[20]。鼻黏膜具有调节温度、湿润、洁净等作用^[21]。鼻黏膜的损伤会造成患者的痛苦，黏膜干燥、结痂，严重者会引起“空鼻征”^[22]，出现“鼻空”，过度通气、吸气时冷，鼻腔干痂，入睡困难，睡眠状态欠佳等，严重影响患者的生活学习。黏膜功能破坏后，溃疡出现瘢痕，患者有鼻空的感觉认为是心理障碍^[23]。

作者进行了10例患者的统计学分析，在移植前发现鼻腔容积为(19.03±4.65) cm³，移植后30 d 为(15.15±1.46) cm³，移植后90 d为(14.84±2.31) cm³，移植后150 d为(11.34± 2.62) cm³，最小横断面积在移植前为(0.68±0.11) cm²，移植后30 d时为(0.52±0.65) cm²，移植后90 d时为(0.59± 0.55) cm²，移植后150 d为(0.58±0.11) cm²，黏膜纤毛清除功能移植前为(1 107.23±989.42) s，移植后30 d为 (1 077.12±1 085.23) s，移植后90 d为(753.03± 434.56) s，移植后150 d为(1 215.13±125.06) s，其中鼻腔容积、最小横断面积变小，可能是经过脂肪来源干细胞修复后瘢痕挛缩明显减轻，弹性增加造成横断面积小，差异有显著性意义(P < 0.05)。由于病例少造成黏膜纤毛清除功能差异无显著性意义，但有一个变化值。

淋巴细胞、中性粒细胞参与了鼻黏膜异常的免疫反应，导致持续剧烈的炎性病变的产生^[24-25]。脂肪来源干细胞注射移植后观察鼻黏膜切片中淋巴细胞、中性粒细胞浸润较少。说明脂肪来源干细胞有控制炎症的作用。

慢性炎症引起纤维组织增生，可影响组织相应结构和组成改变^[26-27]。胶原纤维作为细胞外基质主要构成成分，对维持组织结构及细胞间联系有重要作用^[28]。胶原纤维沉积过多形成纤维结缔组织挤压造成局部器官结构重塑和功能的改变，甚至严重威胁健康。环境、感染、肿瘤、创伤、自身免疫或药物都可损伤机体，引起相应的组织胶原纤维异常增多^[29]。胶原纤维在正常鼻黏膜中起到支架作用^[30]，Masson染色切片中蓝色区域代表了胶原纤维沉积部位，在显微镜下可观察到脂肪来源干细胞注射移植前鼻黏膜胶原纤维呈粗而排列紊乱，胶原含量持续上升，腺体间胶原纤维沉积严重提示大量瘢痕组织形成；而脂肪来源干细胞注射移植后30 d鼻黏膜切片显示胶原纤维排列整齐，腺体间胶原纤维沉积较少，说明脂肪来源干细胞降低固有层中胶原的沉积及无序排列。

鼻黏膜中的杯状细胞可以分泌黏液，适量的黏液中含有的抗菌成分，可以抵抗致病因子的刺激作用，能够保护和促进纤毛活性，有利于疾病的恢复^[30]。AB-PAS染色中黏液成粉红色^[31]，脂肪来源干细胞注射移植前黏膜纤维化改变，增生腺泡萎缩，因而杯状细胞数量减少，粉红色不连续；而脂肪来源干细胞注射移植后黏液分泌增大，粉红色呈连续性。

作者认为真正意义的黏膜恢复要从黏膜结构重建和功能恢复两方面进行，本文结果虽然在结构上未必恢复到原来的形状，但黏膜的功能得到恢复，可见脂肪来源干细胞注射移植是值得推荐的黏膜组织再生技术。

本研究在10例鼻黏膜损伤患者中进行了脂肪来源干细胞移植注射，结果显示该方法效果较好，但由于随访时间短、样本量小等不足，还需要更深入的研究来充分证实其临床疗效和作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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