骨髓间充质干细胞移植炎症性肠上皮组织中Wnt/β-catenin信号分子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.009

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (1): 49-53.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.009

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骨髓间充质干细胞移植炎症性肠上皮组织中Wnt/β-catenin信号分子的表达

邢艳粉¹，解绪红¹，苑召虎¹，崔业佳¹，李瑜元²，聂玉强²，魏亚明¹

广州医科大学附属广州市第一人民医院，¹输血科，²消化科，临床分子医学及分子诊断实验室，广东省广州市 510180

修回日期:2014-12-15 出版日期:2015-01-01 发布日期:2015-01-01
通讯作者: 魏亚明，博士，教授，博士生及研究生导师，广州医科大学附属广州市第一人民医院输血科，广东省广州市 510180
作者简介:邢艳粉，女，1990年生，河南省汝州市人，汉族，2015年广州医科大学毕业，硕士，主要从事分子诊断学与细胞治疗。
基金资助:
国家自然科学基金(81070385)；广州市重大民生专项基金(201300000100)

The expression of Wnt/beta-catenin signaling molecule in inflammatory bowel diseases treated with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation

Xing Yan-fen¹, Xie Xu-hong¹, Yuan Zhao-hu¹, Cui Ye-jia¹, Li Yu-yuan², Nie Yu-qiang², Wei Ya-ming¹

¹Department of Blood Transfusion, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China; ²Guangdong Key Laboratory of Clinical Molecular Medicine and Diagnostics, Department of Gastroenterology, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China

Revised:2014-12-15 Online:2015-01-01 Published:2015-01-01
Contact: Wei Ya-ming, M.D., Professor, Doctoral and Master’s supervisor, Department of Blood Transfusion, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
About author:Xing Yan-fen, Master, Department of Blood Transfusion, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070385; Guangzhou People’s Livelihood Special Fund, No. 201300000100

摘要/Abstract

摘要：

背景：Wnt/β-catenin信号通路是干细胞调控中最关键的信号通路之一，参与调控细胞的增殖与分化。
目的：观察Wnt/β-catenin信号通路中主要信号分子在骨髓间充质干细胞移植修复炎性肠疾病过程中的表达状况。
方法：采用三硝基苯磺酸灌肠法制作SD大鼠炎症性肠病模型，并将绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞经尾静脉注入体内，以注射生理盐水为移植正常对照，于移植第14和28天处死大鼠，取其大肠组织，采用qRT-PCR的方法进行检测Wnt/β-catenin信号通路中信号分子的表达情况。
结果与结论：qRT-PCR检测结果显示，wnt3a和β-catenin在炎症性肠组织中相对表达量明显增加(P < 0.05)，而c-myc的表达量没有明显变化(P > 0.05)。骨髓间充质干细胞移植修复后，wnt3a、β-catenin和c-myc的表达量都显著下降(P < 0.05)。结果表明Wnt/β-catenin信号通路在炎症性肠病以及移植骨髓间充质干细胞后的修复过程中起着重要的作用，协助骨髓间充质干细胞向肠上皮细胞分化，促进肠炎症的好转，并修复炎症区域，恢复肠组织的稳态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 炎症性肠病, 骨髓间充质干细胞, Wnt/β-catenin信号通路, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The Wnt/β-catenin signaling pathway is one of the most important signaling pathways in stem cell regulation, which is involved in regulation of cell proliferation and differentiation.
OBJECTIVE: To investigate the expression of Wnt/β-catenin main signaling molecule in inflammatory bowel tissues treated with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.
METHODS: 2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid was used for establishing inflammatory bowel diseases rat models. Bone marrow mesenchymal stem cells labeled with green fluorescent protein were transplanted into rat models via tail vein. Normal saline was injected as control. The expression of Wnt/β-catenin signaling molecule was detected in the large intestine tissue of inflammatory bowel disease rat models by quantitative RT-PCR at 14 and 28 days after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Real-time quantitative PCR results showed that the expression of Wnt3a and β-catenin in the inflammatory bowel tissue increased significantly (P < 0.05), while no difference in the expression of c-myc (P > 0.05). The expressions of Wnt3a, β-catenin and c-myc in the transplantation group were significantly lower than those in the control group after transplantation (P < 0.05). These findings indicate that the Wnt/β-catenin signaling pathway plays important roles in inflammatory bowel disease and repair after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation, while this pathway may promote stem cells differentiating into intestinal epithelium, promote recovery from inflammatory bowel disease, repair inflammatory area, and restore intestinal tissue homeostasis.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Intestinal Diseases, Signal Transduction

中图分类号:

R394.2

邢艳粉，解绪红，苑召虎，崔业佳，李瑜元，聂玉强，魏亚明. 骨髓间充质干细胞移植炎症性肠上皮组织中Wnt/β-catenin信号分子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 49-53.

Xing Yan-fen, Xie Xu-hong, Yuan Zhao-hu, Cui Ye-jia, Li Yu-yuan, Nie Yu-qiang, Wei Ya-ming. The expression of Wnt/beta-catenin signaling molecule in inflammatory bowel diseases treated with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(1): 49-53.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)是一种反复发作的慢性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，重症患者迁延不愈，对人体健康构成极大的威胁。目前许多研究认为炎症性肠病主要由遗传、环境及免疫等多方面共同作用于肠组织，从而导致肠道慢性炎症的发生^[1-2]。目前治疗炎症性肠病的传统药物有水杨酸类、肾上腺糖皮质类固醇激素、免疫抑制剂及抗生素等^[3]，但是传统药物治疗效果有限，能够起到短暂的缓解效果，疗效欠佳，甚至会产生一些诸如银屑病、细胞毒性、过敏反应等患者难以忍受的不良反应^[4-6]。越来越多的研究表明间充质干细胞能够用于炎症性肠病的治疗，改善克罗恩病和溃疡性结肠炎的临床症状，为治疗炎症性肠病开创新的治疗途径^[7]。有些研究认为间充质干细胞是通过恢复上皮屏障的完整性^[8]、免疫抑制^[9-10]、刺激内源性祖细胞改善肠上皮的自我更新等方面治疗炎症性肠病^[11]。间充质干细胞具有自我更新及向不同细胞类型分化的能力，比如向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞分化^[12]，也有研究证明了间充质干细胞能够跨系分化为肠上皮组织^[13]。课题组的前期研究也证实了间充质干细胞可以定植于肠组织的炎症区域，并具有上皮细胞的形态特点^[14-15]。但是间充质干细胞定植于肠炎症组织后修复肠上皮组织的机制尚不清楚。

Wnt/β-catenin信号通路是肠干细胞的重要调节信号之一，主要维持肠干细胞的发展，调节肠干细胞的增殖与分化^[16]。Wnt3a能够诱导激活Wnt/β-catenin信号通路，促进一系列目的基因的转录，如C-myc等^[17]。Wnt/ β-catenin信号通路相关分子在间充质干细胞移植修复炎症性肠病过程中的作用报道较少。本实验主要观察骨髓间充质干细胞移植修复炎性肠疾病过程中Wnt/β-catenin信号分子的表达情况，并探讨可能在其中的调控机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞移植的随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年8月至2014年5月在广州市第一人民医院输血科实验室，广州市第一人民医院临床分子医学及分子诊断实验室完成。

材料：

大鼠骨髓间充质干细胞：购自美国Cyagen Biosciences Inc.公司，该细胞应用病毒转染技术使其稳定表达绿色荧光蛋白标记。

实验动物：健康SPF级的雄性SD大鼠18只，体质量180-200 g，来自于广东省实验动物中心。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

主要试剂：L-DMEM培养液(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，PrimeScript^®RT Master Mix Perfect Real Time(TAKARA，日本)，SYBR^®Premix Ex Taq^TM(TAKARA，日本)，Trizol试剂(美国Invitrogene公司)。

实验方法：

实验分组：将18只健康SD大鼠随机分为3组，分别为正常对照组、模型组和细胞治疗组，每组6只。

炎症性肠病模型的建立：模型组和细胞治疗组SD大鼠用注射器从肛门缓缓推入1.0 mL体积分数为50%乙醇溶液含20 mg三硝基苯磺酸进行灌肠，倒立1 min，制作成炎症性肠病模型。正常对照组SD大鼠采用同样的方法用生理盐水进行灌肠。

骨髓间充质干细胞移植：在炎症性肠病动物模型建立24 h后，将骨髓间充质干细胞调整成2×10⁹ L^-¹细胞浓度，采用静脉注射方法移植1 mL骨髓间充质干细胞于细胞治疗组大鼠。

取材：于移植后的第14天和28天各取模型组、细胞治疗组、正常对照组3只大鼠进行处死，取其大肠炎症病变组织，一份用体积分数为10%甲醛溶液进行固定，再进行苏木精-伊红染色和荧光显微镜观察；另一份放入冻存管中，保存在-80 ℃冰箱中，再进行后续总RNA提取、反转录及RT-PCR实验。

冰冻切片苏木精-伊红染色：冰冻切片固定1 min后，用水冲洗；苏木精溶液染色5 min，染色后流水冲洗；加1%盐酸乙醇3 s后，流水冲洗10 min；再用伊红染色5 s后，脱水，吹干，用中性树胶封固。

总RNA的提取及反转录：取模型组、细胞治疗组、正常对照组的组织和单纯骨髓间充质干细胞用Trizol试剂提取总RNA，进行RNA浓度及纯度的鉴定。按照RNA反转录说明书进行RNA的反转cDNA。

荧光定量PCR：每个20 µL反应体系中包含100 ng DNA模板，10 µL SYBR^®Premix Ex Taq^TM试剂，0.8 µL引物。用荧光定量ABI ViiA7 PCR仪进行基因扩增。每条PCR引物的具体信息见表1。

本实验均按照SYBR^®Premix Ex Taq^TM试剂盒的两步法PCR扩增标准程序进行扩增：预变性95 ℃ 30 s 1个循环，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。实验数据由ABI ViiA7 PCR仪自带的软件自动完成。以β-actin为内参基因，检测单纯骨髓间充质干细胞组、正常对照组、模型组及细胞治疗组的目的基因相对表达量。

主要观察指标：各组大肠组织或单纯骨髓间充质干细胞中Wnt3a、β-catenin及c-myc的表达。

统计学分析：应用SPSS13.0软件进行分析，数据以 x(_)±s表示，各组间比较采用单因素方差分析方法，方差不齐时，采用非参数检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

炎症性肠病是常见的消化系统疾病，常用的传统药物效果欠佳，不能完全治愈。有研究证明静脉移植间充质干细胞于溃疡性结肠炎大鼠体内能够定植于肠道的受损区域^[18]。在课题组前期实验中也发现标记了Y染色体的间充质干细胞能够定植于有炎症的肠道受损区域，并具有上皮细胞的形态特点^[19-20]。间充质干细胞不仅能够向相关的细胞类型分化，还能够跨系分化成肠上皮细胞，在修复受损的肠上皮细胞，维持肠上皮屏障的完整性方面起着重要的作用。
参与调节肠干细胞的增殖与分化稳态的信号通路有多条，如Wnt/β-catenin，Notch，BMP及MAPK等信号通路，这些通路共同维持肠干细胞的自身平衡^[21]。其中Wnt/β-catenin信号通路是最重要的信号通路之一，其主要作用是激活肠干细胞的增殖，抑制肠干细胞向成熟细胞类型的分化^[16]。同时在间充质干细胞的增殖中也起着重要的调节作用，可维持间充质干细胞的自我更新及稳态^[22]。

本实验成功将有绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞移植到炎症性肠病大鼠模型中，通过荧光定量PCR技术检测Wnt/β-catenin信号分子在炎症性肠病组及骨髓间充质干细胞移植组大鼠肠组织中的相对表达量，当发生炎症性肠病时，Wnt3a和β-catenin的表达量与上述研究结果相同，都表现为上调表达，同样下游相关因子c-myc的表达量没有明显变化。这说明炎症发生时，Wnt3a诱导激活Wnt/β-catenin信号通路，避免了β-catenin被降解，引起β-catenin表达的增加，促进肠干细胞的增殖，调节肠隐窝微环境，抵抗炎症的侵袭。但下游的相关因子c-myc的表达没有发生显著的变化，可能是没有通过下游目的基因c-myc的转录，而通过其他目的基因调控细胞的增殖。

在骨髓间充质干细胞移植治疗并定植于肠组织后，Wnt3a和c-myc基因的表达表现为下调。说明在修复过程中Wnt/β-catenin信号通路可能被抑制，Wnt3a表达量的下降，引起β-catenin的磷酸化，之后被降解，不能促进下游目的基因c-myc的转录，信号通路的机制可能与正常细胞中经典信号通路一致，抑制干细胞的增殖，从而促进间充质干细胞向肠上皮细胞的分化，促进炎症的好转。其中c-myc基因在骨髓间充质干细胞移植后的第14天表达量出现升高，可能为骨髓间充质干细胞中本身高表达c-myc，在移植后前期通过高表达的c-myc促进骨髓间充质干细胞自身的增殖，使间充质干细胞能够达到一定的细胞治疗数量，后期基因表达下调，说明当间充质干细胞自我增殖到一定细胞数量时，通过Wnt/β-catenin信号通路能够抑制细胞增殖，从而促进骨髓间充质干细胞分化为肠上皮细胞，补充受损的肠上皮组织，修复炎症区域。

综上所述，通过对Wnt/β-catenin信号通路中相关重要的信号分子进行研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在炎症性肠病以及移植骨髓间充质干细胞后的修复过程中起着重要的作用，协助骨髓间充质干细胞向肠上皮细胞分化，促进肠炎症的好转，并修复炎症区域，恢复肠组织的稳态。

骨髓间充质干细胞移植炎症性肠上皮组织中Wnt/β-catenin信号分子的表达

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