三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.005

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (1): 24-29.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.005

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三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力

毕晓娟¹，郭晨明²，李亮¹，段显琳³，江明^1，3

¹新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院干细胞研究室，新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；新疆医科大学第一附属医院，²乳腺外科，³血液病中心、新疆维吾尔自治区血液病研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2014-12-08 出版日期:2015-01-01 发布日期:2015-01-01
通讯作者: 江明，硕士，主任医师，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院干细胞研究室、新疆医科大学第一附属医院血液病中心、新疆维吾尔自治区血液病研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:毕晓娟，1983年生，新疆维吾尔自治区人，汉族，2007年新疆医科大学毕业，助理研究员，主要从事究脂肪源间充质干细胞研究。
基金资助:
新疆医科大学第一附属医院组织工程专项基金(2012ZZGC04)

Three-dimensional culture method induces the chondrogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cell microspheres

Bi Xiao-juan¹, Guo Chen-ming², Li Liang¹, Duan Xian-lin³, Jiang Ming^{1, 3}

¹Stem Cell Laboratory, Clinical Medicine Research Institute, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Department of Biochemistry, Preclinical Medicine College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China;²Department of Breast Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³Hematologic Disease Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Xinjiang Research Institute of Hematology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2014-12-08 Online:2015-01-01 Published:2015-01-01
Contact: Jiang Ming, Master, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Stem Cell Laboratory, Clinical Medicine Research Institute, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Department of Biochemistry, Preclinical Medicine College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Hematologic Disease Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Xinjiang Research Institute of Hematology, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Bi Xiao-juan, Assistant researcher, Stem Cell Laboratory, Clinical Medicine Research Institute, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Department of Biochemistry, Preclinical Medicine College, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Special Fund for Tissue Engineering in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 2012ZZGC04

摘要/Abstract

摘要：

背景：关节软骨损伤后修复结果不满意，需要新的手段，而脂肪间充质干细胞较适宜做种子细胞诱导软骨，然而怎么能够使诱导的软骨具有功能需要研究。
目的：采用三维培养体系诱导人脂肪间充质干细胞微球向软骨分化。
方法：无菌切取吸脂术后脂肪组织，分离培养人脂肪间充质干细胞，传至第3代进行流式细胞术分析，成骨成脂肪诱导等鉴定，同时也给予合适的培养条件用三维培养的方式向软骨细胞诱导，并行阿利辛蓝染色鉴定糖胺多糖的合成，苏木精-伊红染色进行组织学分析，免疫荧光检测Ⅱ型胶原表达，称质量测量软骨硬度。
结果与结论：分离的人脂肪间充质干细胞CD105，CD44，CD29均高表达，而 CD45，CD34低表达，并且成骨成脂诱导后细胞茜素红染色和油红O染色均为阳性。三维培养法诱导的软骨细胞可表达大量糖胺多糖及Ⅱ型胶原。结果证实，三维培养法诱导人脂肪间充质细胞向软骨分化后，具有软骨细胞的特性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 三维培养体系, 软骨微球, 诱导分化, 间充质干细胞, 脂肪源间充质干细胞, 人脂肪间充质干细胞, 无支架微球, 培养条件优化, 软骨诱导

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells are more appropriate as seed cells for cartilage induction in patients who have unsatisfied repair after articular cartilage injuries, but how to induce the cartilage function need to be studied.
OBJECTIVE: To induce the chondrogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cell microspheres using three-dimensional culture system.
METHODS: Adipose tissues were extracted after liposuction under sterile, to isolate and culture human adipose-derived mesenchymal stem cells. The third passage cells were analyzed by flow cytometry and identified by osteogenic induction and adipogenic induction, and meanwhile, cells were cultured under three-dimensional culture system for chondrogenic differentiation. Then, cells were observed by Alcian blue staining for identification of glycosaminoglycan synthesis as well as hematoxylin-eosin staining for histological analysis. Expression of collagen type II was detected by immunofluorescence method. Cartilage stiffness was determined by mass measurement.
RESULTS AND CONCLUSION: Isolated human adipose-derived mesenchymal stem cells highly expressed CD105, CD44, CD29, but showed low expressions of CD45, CD34. After osteogenic and adipogenic induction, cells were positive for alizarin red staining and oil red O staining. Under the three-dimensional culture, chondrocytes could greatly express glycosaminoglycans and collagen type II. The results suggest that under the three-dimensional culture, human adipose-derived mesenchymal cells differentiate into chondrocytes and have the characteristics of chondrocytes.

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Key words: Tissue Engineering, Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Cartilage

中图分类号:

R394.2

毕晓娟，郭晨明，李亮，段显琳，江明. 三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(1): 24-29.

Bi Xiao-juan, Guo Chen-ming, Li Liang, Duan Xian-lin, Jiang Ming. Three-dimensional culture method induces the chondrogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cell microspheres[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(1): 24-29.

图/表（结果） 4

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引言

关节软骨损伤和骨关节炎是最常见的关节疾病，并且关节很容易被损害，运动损伤或老化，目前关节软骨损伤的修复方法主要包括镶嵌式成形术、微骨折、注射自体软骨细胞^[1-3]，并且这些治疗方法主要产生纤维软骨而不是透明软骨，虽可以缓解疼痛和改善关节功能，但是长期的结果不是令人不满意。现较有前途的方法就是关节腔内大量注射间充质干细胞，因为细胞可以作为营养的生物活性因子启动再生活动导致缺陷的修复^[4]。软骨细胞培养条件和移植后的固定问题限制了软骨细胞移植的临床应用。有研究首先将软骨细胞种植于人工合成多聚物和胶原凝胶支架上，成功的在体外再生了软骨组织，用于修复关节软骨缺损，获得了满意的效果^[5-6]。然而在细胞支架复合物移植入体内后，支架将可能引起受者的免疫排斥反应；原有组织和支架材料整合困难，复合物的机械强度较低。

颜炜群等^[7]分离软骨细胞，并在离心管内进行高密度培养，这些软骨细胞在自身合成的基质中增殖，分化形成软骨组织，在组织学上细胞的排列呈现出明显的规律性，细胞纵向排列成柱状并且肥大细胞位于上侧，增殖细胞位于下面形成明显的细胞分化区带。杨志明等^[8]研究认为无支架人胎软骨细胞离心培养形成软骨表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，具有类似透明软骨组织学和生物化学性质。脂肪间充质干细胞取材方便，对患者创伤较小，且具备很强的增殖能力和多向分化潜能^[9]，是组织工程理想的种子细胞，已广泛应用于实验研究。脂肪间充质干细胞在适宜的环境和诱导条件下，可向软骨细胞分化，并具有稳定的增殖能力。而在长期的单层培养中，软骨细胞本身将发生去分化现象，其外形由椭圆形和多角形转变为梭形的成纤维细胞样外形，并失去表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等软骨细胞特异性基质的能力，转而表达Ⅰ型胶原等成纤维细胞特异性基质^[10]。

而三维培养体系中，细胞经过长时间增殖，仍具有较好的生物学特性，同时促进细胞外基质的分泌^[11]，三维培养的特点是不需要支架材料参与的培养技术。体外微球培养体系的细胞团更接近体内生理微环境，能够促进细胞间的相互作用，增加细胞外基质及细胞因子介导效应。

本次实验旨在寻找产量高，效果稳定，更适合临床应用的软骨，并探索在三维培养体系中脂肪间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的适宜条件并进行相应的鉴定，为后期利用脂肪间充质干细胞进行相关的组织工程研究工作打下基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学实验。

时间及地点：于2013年3月至2014年3月在新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院干细胞研究室完成。

材料：

脂肪：脂肪来源于新疆医科大学第一附属医院吸脂术患者，患者及家属均知情同意，实验通过本院内伦理委员会批准。

实验方法：

人脂肪间充质干细胞的原代培养：无菌条件下收集手术患者脂肪，浸泡冲洗后去除血管及其他组织，将脂肪组织剪成小块，置于体积分数0.1%Ⅰ型胶原酶中37 ℃消化30 min，1 200×g离心10 min，弃上清，用PBS漂洗，离心后用含10 mL培养体系：低糖DMEM培养液中加入100 U/mL青霉素、链霉素+2 mmol/L L-谷胺酰胺+体积分数10%FBS接种。置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养。培养48 h后首次换液，约7 d细胞形成克隆并且融合达80%传代^[12-13]。

流式细胞仪检测：将脂肪间充质干细胞传代至P3代，体积分数0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，收集细胞到1.5 mL离心管，冷PBS漂洗2次，调整细胞浓度至1×10¹⁰ L^-1，设置空白对照，每管100 μL，分别加入流式检测单抗体(CD29-PE，CD34-PE，CD45-FITC，CD31-FITC，CD44-FITC及CD105-PE)，避光孵育15 min，加入DPBS 500 μL稀释，流式细胞仪分析阳性指标百分比含量。

人脂肪间充质干细胞成骨诱导：取第3代细胞培养汇合达60%-70%，换成骨诱导培养基，诱导培养基为低糖DMEM加入100 U/mL青霉素、链霉素，2 mmol/L的L-谷胺酰胺，体积分数10%FBS，10 mmol/L β-磷酸甘油，10^-⁷ mol/L地塞米松，质量浓度50 mg/L左旋维生素C，对照组培养基为低糖DMEM加入100 U/mL青霉素、链霉素，2 mmol/L的 L-谷胺酰胺，体积分数10%FBS。成骨诱导8-13 d肉眼可观察到白色小点，显微镜下可见黑色团块，行茜素红钙结节染色。

人脂肪间充质干细胞成脂诱导：取第3代细胞培养汇合达60%-70%，换成脂诱导培养基，诱导培养基为低糖DMEM加入100 U/mL青霉素、链霉素，2 mmol/L的L-谷胺酰胺，体积分数10%FBS，0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，10^-⁶ mol/L地塞米松，10 μmol/L胰岛素，200 μmol/L吲哚美辛，对照组培养基为低糖DMEM加入100 U/mL青霉素、链霉素，2 mmol/L L-谷胺酰胺，体积分数10%FBS。成脂诱导5-8 d镜下可见细胞脂滴，进行油红O染色。

人脂肪间充质干细胞三维培养成软骨诱导^[14]：收集第3代细胞，计数，调整细胞使5×10⁶个细胞置于15 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min。弃上清，勿吹打细胞层，轻轻换成软骨诱导液2 mL，软骨诱导培养基为：高糖DMEM加入100 U/mL青霉素、链霉素，2 mmol/L的L-谷胺酰胺，体积分数10%FBS，胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(insulin- transferrin-selenium，ITS⁺¹，包含质量浓度10 mg/L胰岛素，5.5 mg/L转铁蛋白，5 μg/L硒，0.5 g/L BSA，亚油酸4.7 mg/L)，50 mg/L左旋维生素C，10^-⁷ mol/L地塞米松，10 μg/L 转化生长因子β。对照组培养基为低糖DMEM加入100 U/mL青霉素、链霉素，2 mmol/L的L-谷胺酰胺，体积分数10%FBS。以后每隔两三天全量换液，并且新鲜加入转化生长因子β，约21 d收获细胞。

软骨诱导及鉴定：三维培养的软骨细胞先称质量，测量后40 g/L多聚甲醛固定1 h，包蜡块，切片后二甲苯中脱蜡10 min。换用新鲜的二甲苯，再脱10 min。无水乙醇洗2遍，每次10 s。体积分数95%乙醇洗2遍，每次10 s。体积分数80%乙醇洗1遍，每次10 s，蒸馏水2 min进行相应染色。

苏木精-伊红染色：脱蜡脱水后苏木精染色5 min，浸入自来水洗去多余染液，返蓝1 s后浸入自来水1 min，伊红染色3 min后浸入自来水洗去多余染液。脱水、透明、封固。观察组织结构及细胞外基质含量。

阿利新蓝染色：脱蜡脱水后阿利新蓝染色30 min，入水冲洗5 min。脱水、透明、封固。酸性黏蛋白、透明质酸、蛋白多糖均会被染成蓝色。

免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达：脱蜡脱水后用抗原修复液修复，PBS洗3遍，每次3 min；加体积分数为0.5% Triton X-100室温15 min，PBS洗3遍，每次3 min；用体积分数5%羊血清室温封闭1 h；加兔抗人Ⅱ型胶原抗体 (1∶1 000)覆盖组织4 ℃过夜，PBS洗3遍，每次3 min；滴加羊抗兔荧光二抗避光孵育1 h(1∶1 000)，复染核用PI染色5 min，荧光显微镜采集图片，Ⅱ型胶原阳性表达细胞呈绿色。

主要观察指标：观察细胞形态，茜素红染色成骨诱导的钙结节，油红O染色成脂诱导的脂滴流式检测CD29，CD34，CD45，CD31，CD44及CD105。观察诱导的软骨微球大体形态，测量直径、称质量。染色软骨微球的细胞外基质及细胞。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析，以Student-t 检验检测组间数据差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

组织工程化软骨与宿主的完美结合是软骨修复的终极目标，而对于软骨修复和再生，有功能的组织工程化软骨必须在体外能够合成软骨组织^[15-17]。之前已经有不少研究者运用不同的方法研究软骨修复，产生了不同的结果^[18-19]。在自体软骨细胞植入中首先要解决细胞量的问题，种子细胞的选择必须基于临床应用。因此实验选取的脂肪间充质干细胞是Zuk等^[9]首先从脂肪组织提取出有多种分化潜能的细胞，名为脂肪间充质干细胞，获取容易，来源丰富，生长速度快。患者自身来源的脂肪源性干细胞能够自体移植，可以克服种族及免疫障碍，具有很广阔的应用前景。

有报道软骨细胞在培养皿中很容易去分化^[20]，二维培养体系中，细胞特征性蛋白主要分布于胞浆内，细胞间基质累积较少，并在快速生长下很快达到接触抑制，因此不利于脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化，容易出现细胞的老化和自发多向分化的情况。如何让诱导的软骨细胞在体外稳定。有报道研究者将细胞高密度离心，无需支架材料即可产生软骨样组织^[21-22]，并且形成的组织间隙内有很多软骨细胞分泌的糖胺多糖及Ⅱ型胶原。有研究使用低糖培养环境发现更有利于阻止三维诱导的软骨去分化^[23]。

实验选取人皮下脂肪中的脂肪干细胞，诱导培养基中地塞米松可以抑制脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化，可直接诱导或通过转化生长因子β增加软骨基质Ⅱ型胶原基因的表达而促进人间充质干细胞向软骨细胞分化^[24]。Mehlhorn等^[25]用转化生长因子β与骨形态发生蛋白2，分别或联合使用对脂肪干细胞进行诱导，14 d检测特异性基因表达，发现两者均能诱导脂肪干细胞向软骨分化，联合使用时，对Col10a1与Col2a1 mRNA表达及糖胺聚糖合成产生加性协同效应，并且转化生长因子β能抑制骨形态发生蛋白2引起的碱性憐酸酶表达，促进向软骨的分化。胰岛素在体外对细胞成活、有丝分裂、糖原合成及增殖方面有明显促进作用^[26]；维生素C的作用主要为维持细胞间质的正常胶体状态，促进细胞胶原蛋白的正常分泌。

实验结果显示，在体外三维培养体系中，添加诱导剂，可诱导人脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化，并且构建了软骨样组织。免疫荧光显示实验组中Ⅱ型胶原均为阳性表达，苏木精-伊红染色显示新生组织具有软骨组织的结构特征，实验组中细胞保持了软骨细胞典型的形态学特征，即主要由圆形的成熟软骨细胞和肥大化软骨细胞构成，证明了三维培养对软骨细胞分化表型的维持作用。在三维培养体系的生长环境接近于体内软骨细胞的生长方式，细胞在立体环境中呈圆形生长，细胞间具有一定空间可以满足其增殖需要，并可以在体外保持相对较长时间的持续生长，在三维培养体系中，细胞间可以积累大量的蛋白分泌物，细胞几乎完全被基质所包裹，形成了类似软骨囊样结构。

基质中Ⅱ型胶原是软骨组织的最重要的特征性标志物，在体外培养过程中，胶原可以显著刺激基质的合成，而且以刺激蛋白聚糖合成的作用更加明显，同时胶原可以通过蛋白聚糖中的核心蛋白质和碳水化合物类物质与蛋白聚糖发生相互作用，并影响基质的合成和钙化^[27]。此外，胶原还具有稳定软骨细胞表型的作用发生去分化的软骨细胞将失去其合成软骨细胞特异性基质的能力。胶原将通过对细胞表型的维持保持软骨细胞分泌基质的能力。

目前，脂肪间充质干细胞的诱导分化并用于体内椎间盘组织修复尚在实验阶段，下一步将脂肪间充质干细胞联合生物支架进行研究，观察诱导后的细胞与正常软骨组织的功能是否有差异，能否达到临床要求，为组织工程软骨修复治疗提供依据。

三维培养诱导人脂肪间充质干细胞微球的成软骨分化能力

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