向脑海马区移植骨髓间充质干细胞改善阿尔茨海默病大鼠记忆功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：通过药物治疗虽然能在一定程度上减轻和延缓阿尔茨海默病进展，但是效果不明显，因此采用细胞替代治疗是目前治疗该疾病的一种新的尝试和探索。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠记忆能力改善的影响。
方法：注射β淀粉样蛋白1-40制备阿尔茨海默病动物模型并于双侧海马区移植骨髓间充质干细胞。治疗4周后采用Morris水迷宫检测大鼠空间认知和记忆能力变化，采用BrdU和NF，GFAP的免疫荧光双标技术观察移植的细胞是否存活并分化，免疫印迹和免疫组化技术检测大脑皮质及海马区β淀粉样蛋白表达。
结果与结论：与单纯造模组比较，移植骨髓间充质干细胞治疗后大鼠逃避潜伏期明显缩短(P < 0.01)，跨越平台次数明显均多(P < 0.05)。免疫荧光双标显示，移植细胞在大鼠海马周围分化为NF或GFAP阳性的细胞。免疫组化和免疫印迹分析显示，经骨髓间充质干细胞移植治疗后，其脑内β淀粉样蛋白表达明显下降 (P < 0.05)。结果表明骨髓间充质干细胞移植后能在阿尔茨海默病大鼠脑内局部存活并分化，并且能够提高阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, β淀粉样蛋白1-40, 大鼠, 海马, 阿尔茨海默病, 学习记忆

Abstract:

BACKGROUND: Although medications can reduce and delay the progression of Alzheimer’s disease to a certain extent, but the effect is not obvious. Therefore, cell replacement therapy is a new attempt and exploration for the treatment of Alzheimer’s disease.
OBJECTIVE: To study the improvement in learning and memory abilities of rats with Alzheimer’s disease after transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Alzheimer’s disease model was induced by injecting beta-amyloid 1-40 protein into the bilateral hippocampi. The bone marrow mesenchymal stem cells were then implanted into the hippocampus. After 4 weeks, the spatial cognition and memory ability of rats were evaluated with Morris water maze. BrdU and NF, GFAP immunofluorescence double-staining was adopted to test the differentiation and survival of implanted bone marrow mesenchymal stem cells. Western blot and immunohistochemistry methods were used to detect the expression of beta-amyloid protein in the cortex and hippocampus.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the escape latency of hidden platform was shortened significantly in the stem cell transplantation group (P < 0.01), while the number of crossing the platform was increased significantly (P < 0.05). The BrdU/NSE and BrdU/GFAP double staining positive cells could be found around the bilateral hippocampi. Western blot result showed the beta-amyloid protein expression decreased obviously after transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05). These findings indicate that transplanted bone marrow mesenchymal stem cells can survive and differentiate in the brain of rats, which can improve the learning and memory abilities of Alzheimer’s disease rats.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cell transplantation, Alzheimer disease, memory

中图分类号:

R394.2

王卓，任向前，未东兴. 向脑海马区移植骨髓间充质干细胞改善阿尔茨海默病大鼠记忆功能[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8130-8134.

Wang Zhuo, Ren Xiang-qian, Wei Dong-xing. Hippocampus transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells improves the memory function of Alzheimer’s disease rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8130-8134.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 40只动物纳入实验并行结果分析。中途脱落2只，由重新造模进行补充。

2.2 Morris水迷宫实验结果单纯模型组逃避潜伏期较假手术组明显延长(P < 0.01)。细胞移植组大鼠逃避潜伏期与治疗前相比明显缩短(P < 0.01)；药物治疗组逃避潜伏期较单纯模型组也有下降(P < 0.05)；细胞移植组逃避潜伏期明显较药物治疗组低(P < 0.05)；细胞移植组和药物治疗组在一定程度上降低了逃避潜伏期，但是仍然达不到恢复至正常动物水平(P < 0.05)。

从逃避潜伏期上看，单纯模型组>药物治疗组>细胞移植组>假手术组(P < 0.05)。跨越平台次数上分析，趋势与逃避潜伏期正好相反，为单纯模型组<药物治疗组<细胞移植组<假手术组(P < 0.05)，细胞移植组与药物治疗组比较，跨越平台次数明显增多(P < 0.05)，但未达到假手术组水平(P < 0.05)，见表1。

2.3 β淀粉样蛋白表达情况从免疫组织化学结果上看，经过β淀粉样蛋白诱导后的阿尔茨海默病大鼠，脑内呈现出较多的β淀粉样蛋白表达，表现为在大脑皮质以及海马等位置大量沉积。经骨髓间充质干细胞移植治疗和药物治疗后，其脑内β淀粉样蛋白表达明显下降，从图像分析系统分析吸光度值单纯模型组>药物治疗组>细胞移植组>假手术组 (P < 0.05)，见图1A-C。

从免疫印迹结果上看，也验证了上述结果，在M_r4 000处出现明显条带，即β淀粉样蛋白出现表达。假手术组动物β淀粉样蛋白表达很少，而单纯模型组动物β淀粉样蛋白大量表达，二者差异有显著性意义(P < 0.01)。细胞移植组动物β淀粉样蛋白表达明显下降，与单纯模型组比较差异有显著性意义(P < 0.01)。药物治疗组虽然能降低β淀粉样蛋白表达，但未能达到细胞移植组水平(图2)。

2.4 免疫荧光双标结果移植后4周，从BrdU与GFAP，NF的免疫双标结果看，一部分细胞表达BrdU同时也表达GFAP，说明移植的骨髓间充质干细胞分化成了神经胶质细胞(图3A)。而另一部分BrdU阳性骨髓间充质干细胞同时表达了神经元标志物NF，说明其向神经元方向分化(图3B)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年3月至2013年9月在辽宁医学院人体解剖学实验室完成。

材料：

实验动物：健康SD大鼠40只，SPF级，雄性，4月龄，体质量200-250 g，购置于辽宁医学院实验动物中心。另取SD大鼠3只，SPF级，3月龄，体质量150-180 g，雌雄不限，用于制备骨髓间充质干细胞。

海马处移植骨髓间充质干细胞治疗阿尔茨海默病实验所用主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
抗NSE/Aβ抗体，FITC标记山羊抗兔IgG	北京博奥森生物技术有限公司
盐酸美金刚(商品名易倍申)	丹麦灵北药厂
BrdU/β淀粉样蛋白1-40	Prospect公司
胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清	Hyclone公司
尼康80i倒置显微镜	日本尼康
凝胶成像系统	美国BioRad公司

实验方法：

阿尔茨海默病大鼠模型的建立：给予10%水合氯醛 (3 μL/g)腹腔注射麻醉SD大鼠，用脑立体定位仪固定头部，颅顶消毒后作1 cm切口，根据大鼠脑坐标图设好参数^[13]，在两侧海马处缓慢注入β淀粉样蛋白1-40溶液(2 g/L)5 μL，假手术组以等量PBS注射，缝合皮肤，正常饲养。造模后采用Morris水迷宫对大鼠学习、记忆能力进行测定。参照文献[13]标准来判断阿尔茨海默病模型是否成功。

骨髓间充质干细胞的培养扩增：将SD大鼠麻醉后无菌条件下取双侧股骨，剪断干骺端，注射器冲出骨髓，淋巴细胞分离液分离并离心，取云雾状细胞，按照5×10⁵/cm²密度接种于75 cm²培养瓶中，设立20瓶进行常规培养，培养体系为高糖DMEM培养基+体积分数为10%胎牛血清+青霉素/链霉素，倒置显微镜下观察细胞形态变化。待细胞达到80%汇合的时候，用胰蛋白酶-EDTA消化，用含胎牛血清的培养液终止消化，制成单细胞悬液，以1×10⁴/cm²进行传代，使细胞扩增到足够的数量进行移植。

BrdU标记骨髓间充质干细胞：第3代细胞培养第3天时，将BrdU添加到培养基中使得其使用的终浓度为 10 μmol/L。然后细胞在此培养基中培养72 h，用胰蛋白酶进行消化，采用血细胞计数仪对细胞进行计数，调整活细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹移植备用。

实验分组：随机选取30只大鼠制作阿尔茨海默病模型，10只大鼠作为假手术组。30只大鼠成功造模后，随机分为细胞移植组、药物治疗组、单纯模型组，每组10只。单纯模型组：造模后不做任何处理，正常饲养；药物治疗组：造模成功后第7天按3 mg/(kg•d)经胃管给予盐酸美金刚， 1次/d，共4周；细胞移植组：造模成功后第7天，行骨髓间充质干细胞移植，参照《大鼠脑立体定位图谱》，选取双侧海马为移植区，用10 μL微量注射器，将骨髓间充质干细胞悬液10 μL(1×10⁵个细胞)立体定位注入动物双侧海马区，每侧移植细胞数为1×10⁵ (体积10 μL)，注射速度为1 μL/min，留针5 min。

水迷宫法检测动物行为学：制备阿尔茨海默病模型后，用Morris水迷宫测试大鼠。①定位航行试验：大鼠头朝向池壁方向放入水中，观察大鼠寻找到平台并爬上且停留2 s为找到平台的时间，记为逃避潜伏期。如果大鼠在120 s内没有爬上平台，则将其引导到平台，并保持15 s使其熟悉环境，此时逃避潜伏期记为120 s。该训练连续5 d，每天训练4次。②空间探索试验：第5天最后一次训练结束后撤去平台，将大鼠仍然头向池壁置入水中，当其找到平台并爬上后重新放入水中，记录其在120 s内最多能找到平台的次数。采用同样的方法在治疗4周后再次行Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力。

样品采集及处理方法：行为学检测后，各组大鼠给予戊巴比妥钠50 mg/kg过量麻醉后，心脏灌注。在冰上剥离出双侧海马组织，分成2份，一份加入细胞裂解液剪碎、超声波对组织进行匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，留取上清液。加入10 μL SDS样品缓冲液，100 ℃煮沸5 min，用BCA法测定蛋白含量，-20 ℃冰箱保存。另外一份于40 g/L多聚甲醛后固定，制备石蜡切片。

β淀粉样蛋白表达变化的定位及定量检测：①免疫印迹检测：配制分离胶和浓缩胶，取含10 μg 海马组织蛋白裂解液上样，100 V电泳。转膜2 h。TBST洗，5%脱脂奶粉封闭1 h。与兔抗Aβ抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，然后与HRP标记的羊抗兔IgG(1∶200)室温孵育1 h，ECL显色后曝光，分析条带吸光度。②免疫组织化学：切5 μm厚度石蜡切片，脱蜡，水化，过氧化氢去除内源性过氧化酶，抗原修复，正常牛血清封闭。加兔抗Aβ抗体(浓度均为1∶200) 4 ℃过夜，复温，加入羊抗兔IgG抗体30 min，PBS洗3次，经DAB显色，脱水，封固。

移植后的骨髓间充质干细胞生存分化情况检测：切 5 μm厚度石蜡切片，脱蜡，水化，体积分数为3%过氧化氢去除内源性过氧化酶，枸橼酸盐高压锅抗原修复，体积分数为5%牛血清封闭。加兔抗BrdU/鼠抗NF，兔抗BrdU/鼠抗GFAP抗体(浓度均为1∶200)4 ℃过夜，复温，加入FITC标记驴抗兔和TR标记的驴抗鼠暗室孵育60 min，PBS洗，甘油封固，倒置荧光显微镜下观察。

主要观察指标：①行为学观察空间及记忆能力。②移植后的骨髓间充质干细胞生存分化情况。③脑内β淀粉样蛋白表达变化。

统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件包进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验、方差分析方法，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

当前主要采用各种药物治疗老年性痴呆病患者，其治疗作用主要集中在维持退化的胆碱能神经元功能及疾病的早期，并不能真正治愈晚期阿尔茨海默病患者。本实验中

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

假手术组单纯模型组药物治疗组细胞移植组

图2 免疫印迹法检测阿尔茨海默病大鼠脑内β淀粉样蛋白表达水平

Figure 2 Western blot detection of β-amyloid protein expression in the brain of Alzheimer’s disease

采用了盐酸美金刚作为对照治疗阿尔茨海默病大鼠，虽然在一定程度上对阿尔茨海默病大鼠的空间记忆力有所改善，但是其改善效果并不十分明显。

本实验采用向动物脑内注射β淀粉样蛋白的方式来模拟阿尔茨海默病模型，注射β淀粉样蛋白后，水迷宫实验检测发现动物的空间感知和记忆能力都明显下降，表现为逃避潜伏期明显增长，而且在水中找到并登上平台的能力下降。骨髓间充质干细胞移植治疗4周后大鼠的学习记忆能力明显提高，表现为逃避潜伏期显著缩短，在水中登上平台的次数也明显增多，这说明骨髓间充质干细胞移植疗法能够改善阿尔茨海默病大鼠的空间感知和记忆能力。为了证明阿尔茨海默病大鼠空间感知和记忆能力改善确实是所移植干细胞作用的结果，对移植的骨髓间充质干细胞进行了BrdU标记，然后采用了免疫荧光双标技术进行检测，发现在海马移植细胞部位及其周围可见BrdU/GFAP或者BrdU/NF双染阳性细胞，这说明移植的骨髓间充质干细胞在损伤局部存活并可以分化为神经元样及神经胶质样细胞。Cho等^[16]的研究认为向脑内移植神经干细胞可以分化为神经元以及神经胶质细胞，这些移植细胞通过分化为神经细胞，可以重建局部神经回路，代偿了损伤神经细胞的功能。本实验中观察到的双染阳性细胞较少，所以认为骨髓间充质干细胞促进阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力恢复还存在其他机制。在研究中发现阿尔茨海默病大鼠脑内β淀粉样蛋白沉积较多，通过药物治疗和细胞移植治疗后都能有效的降低脑内β淀粉样蛋白的表达，而这种降低基本上可以排除大鼠本身对β淀粉样蛋白的清除，因为药物治疗组和细胞治疗组对β淀粉样蛋白的清除效率并不一致，细胞移植组使得阿尔茨海默病大鼠脑内β淀粉样蛋白的下降更明显。有研究称海马β淀粉样蛋白的减少可能预防和治疗阿尔茨海默病^[17]。Malm等^[18]发现小胶质细胞通过分泌神经营养因子从而起到神经保护作用，此外它还通过吞噬作用消除脑内β淀粉样蛋白沉积。Lee等^[19-20]发现，将骨髓间充质干细胞移植到阿尔茨海默病大鼠海马的齿状回附近，细胞移植组的β淀粉样蛋白水平下降，并且β淀粉样蛋白沉积的减少伴随着小胶质细胞的激活，小胶质细胞常常出现在在β淀粉样蛋白沉积的附近，因此这表明骨髓间充质干细胞具有清除β淀粉样蛋白沉积和/或阻断β淀粉样蛋白沉积形成的作用^[21]。

总之，实验提示骨髓间充质干细胞在脑内可以分化为神经元样及神经胶质样细胞，提高阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力。但骨髓间充质干细胞移植对自然衰老所致阿尔茨海默病动物是否有效，以及骨髓间充质干细胞脑内移植改善阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的机制还有待进一步研究^[22]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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