骨髓间充质干细胞移植对结肠吻合口愈合的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (50): 8113-8121.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.014

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骨髓间充质干细胞移植对结肠吻合口愈合的影响

冯涛，赵鑫，徐兴伟，郑鹏，考晓明，嵇武

南京大学医学院附属金陵医院，解放军南京军区南京总医院全军普通外科研究所，江苏省南京市 210002

收稿日期:2014-11-02 出版日期:2014-12-03 发布日期:2014-12-03
通讯作者: 嵇武，博士，主任医师，教授，博士生导师，南京大学医学院附属金陵医院，解放军南京军区南京总医院全军普通外科研究所，江苏省南京市 210002
作者简介:冯涛，男，1987年生，山东省潍坊市人，汉族，南京大学在读硕士，主要从事肠黏膜损伤修复方面的研究。
基金资助:
南京市科技发展计划(201104027)

Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on colon anastomotic healing

Feng Tao, Zhao Xin, Xu Xing-wei, Zheng Peng, Kao Xiao-ming, Ji Wu

Affiliated Jinling Hospital of Nanjing University School of Medicine, Military Institute of General Surgery, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

Received:2014-11-02 Online:2014-12-03 Published:2014-12-03
Contact: Ji Wu, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Affiliated Jinling Hospital of Nanjing University School of Medicine, Military Institute of General Surgery, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
About author:Feng Tao, Studying for master’s degree, Affiliated Jinling Hospital of Nanjing University School of Medicine, Military Institute of General Surgery, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Science and Technology Developmental Plan of Nanjing City, No. 201104027

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞具有很大的增殖能力、多向分化潜能、向损伤组织定位修复的功能、低免疫原性和免疫调节作用，其可以用来治疗传统治疗方案难以治愈的疾病，具有广阔临床应用价值，成为细胞移植治疗的新热点。
目的：观察局部注射的骨髓间充质干细胞在缺血性结肠吻合模型大鼠肠黏膜的定植情况及对结肠吻合口愈合的影响。
方法：将40只雌性SD大鼠随机分为4组：对照4 d组和对照7 d组，行左侧结肠缺血性吻合后肠黏膜下局部注射0.5 mL胎牛血清，骨髓间充质干细胞移植4 d组和骨髓间充质干细胞移植7 d组，行左侧结肠缺血性吻合后，取培养至第3代的骨髓间充质干细胞(0.5 mL，1×107个细胞)直接在肠黏膜下注射移植。分别测定各组大鼠吻合口爆破压，取吻合口处肠管行羟脯氨酸含量测定，苏木精-伊红染色及Masson染色行组织病理学评分，Y 染色体原位杂交检测供鼠来源的细胞迁徙及定植情况。
结果与结论：骨髓间充质干细胞移植组吻合口爆破压、羟脯氨酸含量较对照组明显增高，组织病理学评分提示除上皮形成及炎症指标外，黏膜坏死、胶原蛋白沉积量、成纤维细胞活性及新生血管形成指标骨髓间充质干细胞移植组优于对照组。结果表明移植同种异体大鼠骨髓间充质干细胞可在受体缺血性结肠吻合模型肠道内定植，并可加速结肠吻合口的愈合，其发挥疗效主要是通过旁分泌的形式促进机体内源性修复，而骨髓间充质干细胞直接分化为肠黏膜上皮细胞作用较小。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 缺血性肠吻合, 骨髓间充质干细胞, 吻合口爆破压, 羟脯氨酸

Abstract:

BACKGROUND: With the advantage of strong proliferation ability, multi-directional differentiation potential, fully repair of damaged tissue, low immunogenicity and immune regulation, bone marrow mesenchymal stem cells can be used to treat refractory diseases which are difficult to cure by the traditional methods. Its immeasurable clinical application value makes it the new hot spots of cell transplantation therapy.
OBJECTIVE: To observe the colonization of bone marrow mesenchymal stem cells in intestinal submucosa and healing effects after local injecting bone marrow mesenchymal stem cells into rat models of ischemic colon anastomosis.
METHODS: Forty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: group A (postoperative 4 days, control group), group B (postoperative 7 days, control group), group C (postoperative 4 days, bone marrow mesenchymal stem cells group), group C (postoperative 7 days, bone marrow mesenchymal stem cells group). In group A and group B, 0.5 mL fetal bovine serum was injected into the line of the left colon ischemic bowel mucosa after anastomosis. Similarly, about 1×107 cells suspended in 0.5 mL sterile physical serum were submucosally injected into the left colon ischemic bowel mucosa in group C and group D. Rat anastomotic bursting pressure and hydroxyproline content were detected respectively. The migration and engraftment of donor derived bone marrow mesenchymal stem cells was detected by Y chromosome in situ hybridization in colon tissue. Histopathological observation was scored though hematoxylin-eosin and Masson staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells transplantation augmented bursting pressure and hydroxyproline content at the site of ischemic colonic anastomosis. The histopathological features, except for the epithelization and inflammation, were significantly more favorable in the bone marrow mesenchymal stem cell groups, and the microvascular density was significantly higher than that in the control groups. These findings indicate that allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells can be colonized in the receptor of ischemic colon anastomosis model, and significantly accelerate the recovery of ischemic colonic anastomosis. It contributes to the healing of ischemic colonic anastomosis through the paracrine activities of bone marrow mesenchymal stem cells, rather than direct differentiation.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cell transplantation, colon, anastomosis, surgical

中图分类号:

R394.2

冯涛，赵鑫，徐兴伟，郑鹏，考晓明，嵇武. 骨髓间充质干细胞移植对结肠吻合口愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8113-8121.

Feng Tao, Zhao Xin, Xu Xing-wei, Zheng Peng, Kao Xiao-ming, Ji Wu. Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on colon anastomotic healing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8113-8121.

图/表（结果） 2

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态学特征刚接种的细胞呈圆形，大小不一，细胞膜清晰，细胞体透明，悬浮于培养液中，见图1A。培养6-8 h后部分细胞贴附在塑料培养皿底，开始亦呈圆形，部分细胞有伪足伸出，呈椭圆形、多角形、纺锤形或梭形，见图1B。24 h后大部分细胞贴壁，48 h后细胞基本完成贴壁，进行首次半量换液，后每3 d全量换液，见图1C。红细胞等杂细胞随换液逐渐被清除，随后贴壁细胞开始分裂增殖，四五天后部分区域开始形成集落，细胞呈成纤维细胞样外观，其后集落逐渐增大铺展，10 d左右细胞基本汇合长满瓶底，即为第1代，见图1D。传代后，细胞贴壁迅速，形态以梭形为主，不再以集落的方式生长，细胞呈放射状或平行排列，形态趋于一致，见图1E，7 d即可传代1次。

2.2 骨髓间充质干细胞的活力以及增殖能力评估锥虫蓝拒染实验显示骨髓间充质干细胞活力良好，细胞存活率为(95.69±2.17)%。CCK-8 法检测细胞增殖能力示显示骨髓间充质干细胞生长状态良好，增殖能力较强，培养第1，2天为相对潜伏期，接种第3天始细胞增殖活跃，步入对数增长期，第5-7天达到高峰，逐渐进入平台期，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞细胞表型鉴定体外培养骨髓间充质干细胞常用的标志物有CD29、CD44、CD90、CD106等，本实验选取CD29-PE，CD90-PE作为骨髓间充质干细胞阳性对照。CD45在淋巴造血干细胞表面高度表达，选取CD45-PE作为骨髓间充质干细胞的阴性对照，同型对照分别为 IgG1, κ Isotype Control-PE，IgG2，λ1 Isotype Control-PE，结果显示骨髓间充质干细胞CD29、CD90阳性表达率为97.58%，96.85%，而CD45阳性表达率仅为6.11%，见图3。

2.4 细胞培养上清中肝细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子β水平第3代骨髓间充质干细胞培养上清液肝细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子β水平分别为(498.42±39.78)，(249.90±34.57)，(172.28±39.57) ng/L，见图4。

2.5 骨髓间充质干细胞在肠黏膜归巢的检测 Y染色体示踪实验显示，在肠道黏膜固有层、肠黏膜上皮细胞层和肠黏膜下层均可见归巢的骨髓间充质干细胞，其中肠黏膜固有层居多。骨髓间充质干细胞移植4 d组和骨髓间充质干细胞移植7 d组细胞归巢率分别为(9.62±2.57)%、(11.69± 3.09)%，见图5。

2.6 吻合口爆破压的测定术后第4天，骨髓间充质干细胞移植组吻合口压力较对照组明显增高[(15.4±2.77) kPa，(8.25±2.54) kPa，P < 0.01]，同样，术后第7天，骨髓间充质干细胞移植组吻合口压力较对照组明显增高[(26.6± 2.94) kPa，(16.3±4.34) kPa，P < 0.01]，见图6。

2.7 羟脯氨酸含量的测定术后第4天，骨髓间充质干细胞移植组羟脯氨酸含量较对照组明显增高[(0.66±0.11) mg/g，(0.36±0.12) mg/g，P < 0.05]，同样，术后第7天，骨髓间充质干细胞移植组羟脯氨酸含量较对照组明显增高[(0.71±0.13) mg/g，(0.47±0. 09) mg/g，P < 0.05]，见图7。

2.8 组织病理学特征骨髓间充质干细胞移植组黏膜坏死、新生血管形成、胶原蛋白沉积量及成纤维细胞活性评分与对照组有明显区别，差异有显著性意义(P < 0.05)，骨髓间充质干细胞移植组上皮形成、炎症反应评分和对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8，表1。

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引言

消化道吻合口愈合不良将导致一系列严重后果，例如二次手术、长期功能失调、住院时间延长、住院费用增加、患者生活质量严重下降等，其中吻合口瘘是常见的并发症之一。研究表明胃肠道手术吻合口瘘的发生率高达3.4%-8%，结直肠术后患者死亡至少1/3可归因于吻合口瘘进而导致的严重腹腔感染、电解质及酸碱平衡紊乱、重度营养不良，最终出现多器官功能障碍^[1]。

对于消化道切除重建手术者，肠道受到外界刺激后，肠道黏膜上皮细胞层首先迁移、分化，最大程度上避免肠道细菌移位造成的二重打击。肠道固有层富含的平滑肌细胞和成纤维细胞进而合成、分泌大量的胶原蛋白，其主要沉积于肠黏膜下层。吻合口浆膜层对齐良好保证了肠道的连续性^[2]。Thornton等^[2-3]研究发现，消化道吻合口张力大小主要取决于胶原蛋白合成和降解的平衡，术后4 d是吻合口张力疲软期，而术后7 d是吻合口裂开发生的高峰期。已往研究表明，手术创伤影响吻合口愈合的因素主要包括：①局部因素：组织灌注不良、吻合口张力过大、吻合口对齐不良、局部感染、放射性损伤、远端梗阻。②全身因素：营养不良、血液转流、低血量性休克、药物不良反应、免疫缺陷、血糖控制不佳。③技术性因素：血管增压技术、外科延迟术，其中局部因素在促进吻合口愈合方面起着重要作用。吻合口张力缝合、断端过度去血管化使得吻合口局部血供不足，进而导致胃肠道缺血性损伤，吻合口愈合缓慢、局部感染发生率增加，吻合口瘘的发生率随之增高^[4-5]。

如何预防和降低胃肠道缺血性损伤成为人们关注的热点，也是难点。既往研究表明，肠道缺血性损伤时无氧自由基形成，储存铁和炎性因子释放、补体激活、中性粒细胞浸润、肠道菌群易位等显著降低了肠移植成功率和存活率^[6]，对于消化道切除重建手术同样面临着上述问题。预防吻合口裂开最基本的原则主要有足够的血供、无张力缝合以及黏膜内翻缝合。近年来，腔内无缝合人工代用品、生物盾牌以及其他支撑材料备受外科医生青睐。但是，目前为止没有研究显示这类附属物的益处，相反有不少文献指出这类生物制剂能够侵蚀肠管、引发肠梗阻^[7]。目前，纤维蛋白胶在消化外科领域应用广泛，其在吻合口周围具有止血及诱导巨噬细胞趋化功能，从而起到抗炎、增强成纤维细胞活性、增加胶原蛋白沉积及促进新生血管形成作用^[8-9]。也有研究显示，纤维蛋白胶和牛心包片的使用虽然能够增强手术钉合线的缝合效果，但仍然需要进一步研究其在临床应用中的安全性、高效性^[10]。Binnebosel等^[11-12]研究发现腹腔局部应用庆大霉素可以增加胶原蛋白沉积量，并改变胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ比例，从而加速吻合口愈合。另有大量研究证明外科延迟术、抗氧化剂、抗炎药物、抑制补体激活药物、自由基清除剂、谷氨酰胺、甘氨酸等可以降低缺血性损伤对肠道黏膜造成的二次打击，促进肠道损伤修复^[13]。

关于肠道损伤修复的最新研究显示，干细胞疗法具有广阔的临床应用前景。已有研究显示，间充质干细胞在肠道损伤修复及促进新生血管形成方面扮演了极其重要的角色。

间充质干细胞具有强大的增殖能力、多向分化潜能以及向损伤组织定位修复的功能，在一定条件下可以定向分化成某种成体干细胞或者横向分化为多种组织细胞，其主要来源于骨髓和脂肪组织^[14]。骨髓间充质干细胞在分离、培养、定向诱导和应用基础研究方面取得了诸多突破性进展，部分干细胞产品已进入临床应用，为诸多疑难病症治疗带来了希望^[15]。骨髓间充质干细胞移植在血液系统、神经系统、骨科等领域已取得可喜的临床应用研究效果，成为细胞移植治疗的新热点^{[14, 16-17]}。与造血干细胞相比，骨髓间充质干细胞可以从骨髓组织中大量提取，并且在体外容易培养和扩增，从而成为自体再生细胞疗法的理想选择。在临床应用中，骨髓间充质干细胞移植可以避开宿主免疫系统，这在一系列实验室和临床研究中得到了证实^[18]。

本研究拟采用肠黏膜下直接注射的方法移植骨髓间充质干细胞，观察其在缺血性结肠吻合口黏膜中的迁徙、定植情况及其对吻合口愈合的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞生物学特性实验。

时间及地点：于2014年4至10月在解放军南京军区南京总医院普通外科实验室完成。

材料：

实验动物：4周龄SPF级SD大鼠(雄性，体质量约 150 g)4只，6周龄SPF级SD大鼠(雌性，体质量约220 g)40只，由解放军南京军区南京总医院比较医学科提供，实验处置及饲养符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验仪器及主要试剂：细胞培养箱(Heraeus cell 150，美国)，超净台(HF1500，香港)，倒置相差显微镜(Olympus，日本)，流式细胞仪(BD公司，美国)，CO₂培养箱(HERAcell，德国)。低糖DMEM培养液(Gibico公司)，体积分数为10%胎牛血清(HYCLONE公司)，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液、青链霉素溶液(Sigma公司)，PE标记的CD45、CD29和CD90抗体(BD公司，美国)，CCK-8试剂盒(武汉博士德公司)，SRY探针杂交试剂盒(sex determining region Y，武汉博士德公司)，Masson三色染色试剂盒(南京凯基生物公司)。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离纯化及培养：4周龄SD大鼠麻醉处死(氯胺酮、安定、阿托品各1支混到一起，腹腔麻醉)，体积分数为75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，剪开干骺端，以含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM冲洗骨髓腔得到骨髓细胞，并用5 mL无菌针管将其吹打成单细胞悬液。锥虫蓝计数，调整细胞终浓度为(6-8)×10⁹ L^-¹，用完全贴壁法培养骨髓间充质干细胞，接种于一次性塑料培养皿，在体积分数为5% CO₂培养箱中37 ℃培养，48 h后半量更换细胞培养液，以后每3 d全量更换新鲜培养液，待细胞铺满培养皿约80%时用胰蛋白酶-EDTA溶液消化，按1∶2传代后继续培养，周期大约为7 d。倒置显微镜下逐日观察细胞形态。

细胞表型鉴定：新鲜培养的未分化的第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化处理，离心获得单细胞悬液，取(0.5-1.0)× 10⁶细胞，加入适量抗体(根据抗体说明书)，充分混匀后(总体积50-100 μL)，4 ℃避光孵育15 min。加入1 mL PBS，1 500×g离心洗涤5 min。弃去上清后加入300 μL PBS，重悬细胞后立即上机检测。

细胞培养上清中肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)以及转化生长因子β(TGF-β)水平的测定：取第3代骨髓间充质干细胞培养上清液前1 d更换无血清培养基，3 000×g离心10 min去除细胞和细胞残渣，用大鼠肝细胞生长因子(HGF)、大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)以及大鼠转化生长因子β(TGF-β)ELISA 试剂盒测定相应细胞因子水平。

骨髓间充质干细胞移植前细胞活力以及增殖能力的评估：取生长良好的第3代细胞悬液，将20 μL细胞悬液+ 170 μL生理盐水+10 μL 4%锥虫蓝液充分混匀，抽取混合液中17 μL点到放有载玻片的一个计数池中，镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计算锥虫蓝拒染率(细胞存活率)=拒染细胞数/(拒染细胞数+蓝染细胞数)×100%。

取生长良好的第3代细胞悬液接种于96孔板(每孔细胞数2×10³，100 μL)，以无细胞的培养基孔作为空白对照孔，接种后分别于1，3，5，7，9 d测定细胞增殖能力。检测前向每孔加入CCK-8液10 μL，置于体积分数为5% CO₂、 37 ℃的细胞培养箱中孵育2 h，上酶联免疫检测仪测定波长450 mm下各孔吸光度值，以空白孔调零后求出各孔吸光度值，以时间为横坐标，吸光度值均值为纵坐标，记录并绘制细胞生长曲线。

缺血性结肠吻合模型的建立：采用文献[19]报道方法。6周龄SD大鼠(雌性，体质量约220 g)40只，术前均禁食 12 h，不禁水，腹腔麻醉成功后取仰卧位，沿中下腹部正中切开约3 cm进腹。在腹膜反折上游离约3 cm左侧降结肠，注意保护结肠系膜血管。清空肠道残余内容物，切断结肠，并用6-0不可吸收丝线行结肠端-端吻合，分别结扎距离吻合口上下约2 cm结肠系膜血管，缺血性肠道吻合模型建立完成。

细胞移植：40只SD大鼠随机分为对照4 d组，对照7 d组，骨髓间充质干细胞移植4 d组和骨髓间充质干细胞移植7 d组，每组10只。骨髓间充质干细胞移植4 d和7 d组分别接受骨髓间充质干细胞移植(肠道吻合口黏膜多点局部注射共0.5 mL，1×10⁷个细胞)，对照4 d和7 d组分别注射等量的胎牛血清。逐层关腹，术毕。实验动物12 h后供水，24 h后供食物。

主要观察指标：

吻合口爆破压(anastomotic bursting pressure，ABP)：充气使吻合口破裂时的最大肠管内压，多在术后早期检测，反映吻合口最薄弱部位^[20]。拆除大鼠腹部缝合线，切除吻合口上下各3 cm肠管，近端结肠行结肠造口术(置入16G硅胶管，2-0丝线结扎)，连接水银测压计，远端(置入16G硅胶管，2-0丝线结扎)连接气泵(流量4 mL/min)，吻合口破裂时水银计显示的最高压力即为吻合口爆破压。

羟脯氨酸含量：吻合口部位酸性水解酶后胶原蛋白含量。取吻合口上下各0.5 cm肠管，称质量后制备成组织匀浆，3 000×g/min离心10 min，取上清，用大鼠羟脯氨酸ELISA试剂盒测定其中羟脯氨酸含量。

骨髓间充质干细胞在肠黏膜归巢的检测：于术后第4天和第7天分别取骨髓间充质干细胞移植组大鼠吻合口部位结肠约1 cm固定于40 g/L多聚甲醛(含0.1%DEPC)，严格按SRY mRNA原位杂交试剂盒说明书操作。每张大鼠结肠病理切片任取10个视野，计数200个黏膜细胞中阳性细胞的比例，即骨髓间充质干细胞肠黏膜归巢率。

组织病理学特征：肠组织用体积分数为10%甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，主要观察肠绒毛坏死、上皮形成、炎症活动、成纤维细胞活性、新生血管形成等情况，并计分(分值范围0-3分：0分，阴性；1分，轻度；2分，中度；3分，重度)。Masson三色染色区别胶原纤维，同样对结肠组织中胶原蛋白沉积量计分(分值范围0-3分：0分，阴性；1分，轻度；2分，中度；3分，重度)。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，采用SPSS 17.0 软件处理，GraphPad Prism 5软件作图，组内比较采用配对样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

3.1 骨髓间充质干细胞移植参与胃肠道损伤的修复吻合口张力缝合和两端的过度断流常导致吻合的低灌注，持续低灌注造成吻合口肠黏膜坏死，最终导致消化道吻合口裂开，尽管在外科手术操作技术及医疗技术方面较之前有很大改善，但是吻合口瘘的发生率仍然很高，胃肠道缺血性损伤导致的组织低灌注仍是外科医生首要克服的难题^[21]。吻合口持续缺氧，缺血性伤口感染率明显升高，导致伤口愈合缓慢，甚至不愈合，预防或减少缺血性损伤是外科手术目标之一。充足的氧供是胶原蛋白合成所必需的，当氧分压低于5.32 kPa时，胶原蛋白的合成严重受阻，氧分压低于1.33 kPa时，各种生长因子、血管生成和上皮形成受损，吻合口瘘的发生率急剧增高^[22-23]。既往也有研究表明，充分的组织灌注，良好的心输出量是组织愈合的保证，即使血细胞比容水平低于正常15%以上，贫血并不会影响伤口

的愈合^[4]。大量研究表明组织缺氧可以通过使用高压氧逆转，高压氧治疗不仅逆转缺血造成的不利影响，同时促进了不同类型的伤口愈合^[24]。有关肠吻合口愈合的动物实验提出吻合口结合力的强度主要依赖于黏膜下层的胶原蛋白含量。1968年Crotrin等测定大鼠左侧结肠吻合口羟脯氨酸含量和破裂压，发现术后早期二者均明显下降；于术后第3天降至最低水平，此后迅速回升。前者在术后第10天接近正常，后者于术后第5-7天超过正常结肠，第14天达高峰^[25]。

本实验采用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基进行全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，经换液和传代等方法去除杂细胞，传至第3代时，可得到高纯度骨髓间充质干细胞，细胞形态为均一梭形，生长状态良好。大鼠骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形，符合正常细胞的生长特性。锥虫蓝拒染实验显示骨髓间充质干细胞活力良好，CCK-8法细胞增殖能力检测显示骨髓间充质干细胞生长状态良好，增殖能力较强。流式细胞鉴定细胞纯度较高，CD29、CD90表达率分别为97.58%，96.85%，CD45阳性表达率仅为6.11%。

已有研究表明，骨髓间充质干细胞移植主要经过以下两种途径参与了肠道损伤修复，一是注射于肠黏膜下层的骨髓间充质干细胞向肠黏膜隐窝基底部迁移、定值并分化为成熟肠上皮细胞^[26]。Y染色体示踪实验显示，在肠道黏膜固有层、肠黏膜上皮细胞层及肠黏膜下层均可见归巢的骨髓间充质干细胞，其中肠黏膜固有层居多。骨髓间充质干细胞移植后4 d和7 d归巢率分别为(9.62±2.57)%、(11.69±3.09)%。传统细胞移植途径，比如静脉注射细胞归巢率极低，一般在0.1%-2.7%，移植的骨髓间充质干细胞不能很好地起到损伤修复作用^[27]。本实验经局部黏膜下注射骨髓间充质干细胞方法可行、有效。组织病理学评分显示，成熟肠上皮形成评分在对照组与骨髓间充质干细胞移植组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，因此可以推测关于肠道缺血性损伤修复，骨髓间充质干细胞直接分化为成熟肠上皮细胞并不起主要作用。

骨髓间充质干细胞强大的旁分泌功能在肠道损伤修复方面扮演着不可替代的角色^[28-32]，其主要表现在以下3个方面：①抗炎作用。骨髓间充质干细胞可下调炎症因子白细胞介素1b、肿瘤坏死因子α、白细胞介素2、γ-干扰素等，上调抗炎因子白细胞介素10、转化生长因子β1和白细胞介素6，减少炎性反应对组织的损伤，促进受损组织的再生。②抗凋亡作用。骨髓间充质干细胞可分泌多种促生长因子，例如血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及成纤维细胞生长因子等，从而减少肠道自身干细胞的损伤，并促进其增殖、分化，加速缺血性损伤肠黏膜细胞的更替，降低肠黏膜的通透性，减少肠道菌群易位，最大程度上避免肠道受到的二次打击。③新生血管形成作用。胃肠道缺血性损伤导致的组织低灌注仍是外科医生首要克服的难题，骨髓间充质干细胞旁分泌的血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子等可促进微血管形成，改善吻合口血供。本实验经测定，移植前无血清培养上清中肝细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子β水平分别为(498.42±39.78)，(249.90±34.57)，(172.28±39.57) ng/L，证实了骨髓间充质干细胞的旁分泌功能。

机械参数是直观评价吻合口愈合好坏的主要指标，最常用的是吻合口爆破压。吻合口爆破压多在术后早期检测，反映吻合口最薄弱部位^[33]。本实验对照4 d组吻合口爆破压最低(8.25±2.54) kPa，骨髓间充质干细胞移植7 d组最高，为(26.6±2.94) kPa。对照7 d组、骨髓间充质干细胞移植7d组吻合口爆破压比对照4 d组、骨髓间充质干细胞移植4 d组有明显增高，差异均有显著性意义(P < 0.01)。羟脯氨酸是胶原蛋白特征性组分之一，而胶原蛋白是构成结缔组织中胶原纤维的主要成分，吻合口张力大小主要取决于肠黏膜下层胶原蛋白含量的多少。本实验中骨髓间充质干细胞移植组羟脯氨酸含量明显比对照组增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。以上两组研究结果均证明骨髓间充质干细胞移植对吻合口愈合有促进作用。

组织病理学指标，特别是新生血管生成是吻合口愈合过程最重要的使动因素，当四肢、视网膜、心肌组织等缺血性损伤时，骨髓间充质干细胞移植以及外周血液细胞均有促进血管形成作用^[34]。在缺血性心肌病模型中，骨髓间充质干细胞移植可以明显增大血液灌注量，降低缺血性损伤，增大心脏射血分数^[35]。本实验中上皮形成、炎症反应实验组和对照组无明显差异，黏膜坏死、新生血管形成、胶原蛋白沉积量及成纤维细胞活性评分骨髓间充质干细胞组移植组与对照组有明显区别，差异有显著性意义(P < 0.05)。

实验结果显示，肠黏膜下局部注射骨髓间充质干细胞能促进肠黏膜损伤修复，移植细胞归巢率高，损伤处骨髓间充质干细胞旁分泌肝细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子β等能促进肠上皮细胞增殖、分化，并成熟为有功能的肠黏膜上皮细胞，骨髓间充质干细胞移植组较对照组成纤维细胞活性增强，合成胶原蛋白量增加，新生血管形成量增加，加速缺血性损伤肠黏膜细胞的更替，促进吻合口愈合。骨髓间充质干细胞移植组吻合口爆破压等机械参数是最直接的证据。同时，移植细胞标记的成功与否往往关系到整个实验的成败，也是干细胞移植临床应用中的重要环节。本实验利用Y染色体标记技术，将来源于雄性供体含Y染色体的细胞移植入雌性动物体内，因Y染色体长臂末端带有一段特异的重复序列，针对此序列进行原位杂交可对移植细胞进行示踪。Y染色体标记技术简单，移植前无需进行标记；GFP、Lac-Z等基因的表达常常会受到真核表达载体表达效率和表达时限的限制，而Y染色体作为雄性个体的特异性基因结构，不受时间和细胞表型变化的影响，也不受组织类型的限制，稳定性及特异性均较高。研究结果证明骨髓间充质干细胞具有促进新生血管形成及促进缺血性吻合口愈合的作用，为后续充分认识组织再生修复工程中干细胞介导的生物学机制奠定了基础。
3.2 前景与展望在过去的5年中关于干细胞疗法治疗消化道疾病的实验研究数量增加了10倍之多，其中在克罗恩病、各种消化道瘘、肝衰竭等方面取得了突破性进展，有些已进入了三期临床研究阶段。研究表明对于难治性炎症性肠病，特别是肠瘘患者，进行骨髓间充质干细胞移植可以显著减轻患者痛苦，提高患者生活质量。对于胃肠道放射性损伤的修复，骨髓间充质干细胞能聚集于损伤部位，通过加速增生、抑制凋亡来修复损伤组织^[36-37]。

干细胞疗法在机体生长、发育及器官组织修复过程中已经表现出巨大的潜力，充分认识组织再生修复工程中干细胞介导的生物学机制是利用这一潜力的关键。尽管其在治疗肠道疾病方面的研究取得了较大进展，但干细胞的临床应用仍然缺乏足够的大动物模型及人体试验，其安全性和有效性有待进一步评估。

3.2.1 骨髓间充质干细胞跨胚层分化的机制研究表明骨髓间充质干细胞直接分化为胃肠上皮细胞参与肠黏膜修复作用甚微，因此，骨髓间充质干细胞本身生理特性的研究还需要进一步加深，如何诱导骨髓间充质干细胞直接分化为成熟的肠上皮，其跨胚层分化的信号转导机制和分子生物学基础显得尤为关键。

3.2.2 干细胞如何有效的、大规模的获取和存活率的保证环境改变影响了体外培养的干细胞的存活、自我复制、激活和增生。另外，体外培养的干细胞之间缺乏相互调节作用也降低了干细胞的存活能力。建立稳定高效的干细胞体外诱导平台，控制干细胞在体内的增殖分化，避免细胞增殖缓慢影响治疗效果或细胞分化过快对机体造成不良后果等是干细胞移植的基础。

3.2.3 骨髓间充质干细胞特异性诱导分化干细胞疗法最终目标是将干细胞定向诱导为特定的组织或者器官，以针对性地治疗某种疾病。研究表明，肿瘤干细胞具有干细胞的一些特性，例如可塑性、无限增殖潜能、相似信号调节通路和细胞表面标志和凋亡抵抗^[38]，如果发生畸形分化将导致严重后果。Peters等^[39]研究发现干细胞移植过程中实体肿瘤的发生率明显增加，肿瘤起源与异体移植的细胞有着密切联系。因此骨髓间充质干细胞移植的安全性需待进一步评估。

3.2.4 干细胞移植在恶性肿瘤中的应用在消化外科领域，消化道切除重建多见于肿瘤患者，已有研究提出了肿瘤起源于相应组织的干细胞成熟受阻。在干细胞基础研究中，移植的间充质干细胞对肿瘤的影响仍存在很大争议。肿瘤干细胞直接暴露于致癌环境中，不断被致癌因子破坏、增殖分化而耗竭，干细胞癌变理论提出骨髓间充质干细胞是补充耗竭的肿瘤干细胞的来源^[40]。间充质干细胞旁分泌作用能促进新生血管形成，使得间充质干细胞成为肿瘤基质细胞的前体。由于缺乏特异性表面标记物，不能明确胃癌模型中骨髓间充质干细胞分化方向以及其是否与上皮细胞融合，故其能否引起胃癌也需进一步验证^[41]。Studeny等^[42]研究发现，间充质干细胞移植在肿瘤中可能作为基质细胞的前体，同时可作为抗癌生物制剂的作用靶点。通过间充质干细胞移植可以在一定程度上克服抗癌药物严重的代谢毒性，为临床肿瘤治疗提供了新的方向和视觉角度。

3.2.5 其他干细胞移植体系的基本要素需要进一步的统一和完善，例如移植细胞数量、途径、输入方法及移植后细胞的示踪、功能评价等。

随干细胞移植研究的深入，一批创新性、突破性实验研究优化了骨髓间充质干细胞的确定、分离、体外培养的方法，加深了损伤修复过程中干细胞介导的生物学机制的理解。近年来，分子生物学、基因工程、材料科学、基础医学等多学科交叉渗透，加快了其步入临床应用领域的步伐。相信不久的将来，骨髓间充质干细胞会成为组织修复的种子细胞，并积极推动再生医学及组织工程学的发展。

骨髓间充质干细胞移植对结肠吻合口愈合的影响

Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on colon anastomotic healing

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