骨髓间充质干细胞膜片复合自体髂骨移植修复牙槽嵴裂

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.013

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (50): 8108-8112.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.013

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骨髓间充质干细胞膜片复合自体髂骨移植修复牙槽嵴裂

沈悦，马海英，张彦升，王娟，时炳正

沧州市人民医院口腔分院，河北省沧州市 061001

收稿日期:2014-11-11 出版日期:2014-12-03 发布日期:2014-12-03
通讯作者: 张彦升，硕士，副主任医师，沧州市人民医院口腔分院，河北省沧州市 061001
作者简介:沈悦，男，1980年生，河北省沧州市人，硕士，主治医师，主要从事固定矫正治疗，功能矫形治疗，牙体、颅面部三维结构形态对牙齿排列影响等方面的研究。
基金资助:
河北省科技支撑计划项目(1213078ZD)，项目名称：单侧完全性唇腭裂患者上颌骨矫正后稳定性分析及治疗程序研究

Bone mesenchymal stem cell sheet transplantation combined with autologous iliac bone for repair of alveolar cleft

Shen Yue, Ma Hai-ying, Zhang Yan-sheng, Wang Juan, Shi Bing-zheng

Dental Branch of Cangzhou People’s Hospital, Cangzhou 061000, Hebei Province, China

Received:2014-11-11 Online:2014-12-03 Published:2014-12-03
Contact: Zhang Yan-sheng, Master, Associate chief physician, Dental Branch of Cangzhou People’s Hospital, Cangzhou 061000, Hebei Province, China
About author:Shen Yue, Master, Attending physician, Dental Branch of Cangzhou People’s Hospital, Cangzhou 061000, Hebei Province, China
Supported by:
the Science and Technology Supporting Plan of Hebei Province, No. 1213078ZD

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床上使用自体髂骨移植方法修复牙槽嵴裂，常常不能获得稳定的治疗效果，移植骨吸收率因人而异，受到许多因素的影响。
目的：观察骨髓间充质干细胞膜片复合自体髂骨松质骨块移植修复牙槽嵴裂术后的骨吸收情况。
方法：制备实验犬双侧牙槽嵴裂模型，采用自体对照的办法，在实验犬上颌骨两侧的裂隙分别植入骨髓间充质干细胞膜片复合犬自体髂骨骨块(实验组)和单纯犬自体髂骨骨块(对照组)。通过颌骨CT及micro CT对植骨区的骨吸收率、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁分离度、骨密度进行比较。
结果与结论：术后3，6个月时实验组的骨吸收率明显低于对照组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)；术后6个月实验组骨体积分数、骨密度均高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组骨小梁分离度低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，而骨小梁厚度两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明骨髓间充质干细胞膜片复合髂骨骨移植可减少植骨术后骨吸收率，同时可以促进新骨的生成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 细胞膜片, 骨髓间充质干细胞, 自体髂骨移植, 牙槽嵴裂, 骨吸收率

Abstract:

BACKGROUND: Autogenous iliac bone graft for repair of alveolar cleft often cannot achieve a stable therapeutic effect, and the graft resorption rate varies with each individual that is influenced by many factors.
OBJECTIVE: To observe the bone resorption after bone marrow mesenchymal stem cell sheet transplantation with autogenous iliac cancellous bone for alveolar cleft repair.
METHODS: Bilateral alveolar cleft models were prepared in dogs. Using the self-control method, bone marrow mesenchymal stem cell sheet combined with autogenous iliac bone (experimental group) and autogenous iliac bone alone (control group) were respectively implanted into the bilateral alveolar clefts. Mandible CT and microCT were used to compare the bone resorption rate, bone volume fraction, trabecular thickness, trabecular separation, and bone mineral density.
RESULTS AND CONCLUSION: The bone resorption rate was significantly lower in the experimental group than the control group at 3 and 6 postoperative months (P < 0.01); while, the bone volume fracture and bone mineral density of the experimental group were significantly higher than those in the control group at postoperative 6 months (P < 0.05), but the trabecular separation of the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05). In addition, there was no difference in the trabecular thickness between the two groups (P > 0.05). These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cell sheet transplantation combined with autogenous iliac bone graft can reduce bone resorption rate and meanwhile, promote new bone formation.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, ilium, bone transplantation, transplantation, autologous, maxillofacial abnormalities

中图分类号:

R394.2

沈悦，马海英，张彦升，王娟，时炳正. 骨髓间充质干细胞膜片复合自体髂骨移植修复牙槽嵴裂[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8108-8112.

Shen Yue, Ma Hai-ying, Zhang Yan-sheng, Wang Juan, Shi Bing-zheng. Bone mesenchymal stem cell sheet transplantation combined with autologous iliac bone for repair of alveolar cleft[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8108-8112.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞形态学观察原代培养细胞呈成纤维形态或小的椭圆形形态，贴壁生长，呈漩涡状排列、放射性生长。经过两三次传代后则变为纺锤形、多角形、长梭形。细胞胞核明显，伸出长短不一、粗细不均的突起，一些密集的细胞排列成漩涡状、放射性生长(图1)。

2.2 骨髓间充质干细胞鉴定结果取第3代犬骨髓间充质干细胞进行流式细胞仪分析，结果显示98.2%细胞表达CD29，3.4%细胞表达CD34，92.9%细胞表达CD44，95.7%细胞表达CD90(图2)。实验检测到骨髓间充质干细胞表面高表达CD29、CD44、CD90分子，而CD34分子阴性，实验结果与文献报道一致^[11]。

2.3 实验动物数量分析所有动物均成活，手术后2周创口愈合良好，术后4周时，实验组及对照组骨缺损区即可观察到部分骨凹陷，说明少许移植材料吸收，饲养12周后，大体标本见裂隙两端变圆钝，直至处死时，术区创口无红肿、裂开、化脓、炎症现象。

2.4 移植骨骨吸收率比较在术后3个月及6个月时的三维重建图上可明显观察到对照组比实验组有更明显的骨吸收，术后3个月时实验组的骨吸收率为(12.65±1.47)%，对照组的骨吸收率为(24.10±4.14)%，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，术后6个月时实验组的骨吸收率为(17.76± 2.42)%，对照组的骨吸收率为(27.82±4.76)%，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。3个月后骨吸收速度趋于平稳，实验组术后6个月时相对于3个月时的骨吸收率为(5.24± 1.47)%，对照组为(4.07±1.21)%，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 microCT分析

骨体积分数：实验组为(39.11±2.02)%，对照组为(36.32±1.36)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明实验组的骨小梁结构更多。

骨小梁分离度：实验组为(0.174±0.013) μm，对照组为(0.217±0.014) μm，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明实验组的骨小梁结构更加密集。

骨小梁厚度：实验组为(0.122±0.011) μm，对照组为(0.119±0.010) μm，差异无显著性意义(P > 0.05)，说明实验组与对照组骨小梁结构厚度无差异。

骨密度：实验组为(397.71±136.87) Hu，对照组为(321.67±98.12) Hu，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明实验组骨骼强度优于对照组。

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引言

牙槽嵴裂是唇腭裂常见的伴发畸形，表现为牙槽突骨质缺损、牙弓完整性丧失、口鼻瘘以及由于鼻翼基底部缺乏骨组织支持而出现鼻翼塌陷等畸形。牙槽突裂植骨术(alveolar bone graft，ABG)是将植入骨充分地充填到牙槽突裂间隙内以及邻近的骨质缺损区，是充分恢复牙槽骨连续性、牙弓完整性、保证恒牙萌出的必要条件。临床上常应用自体髂骨骨松质移植修复牙槽嵴裂，但是临床上发现不少患者植入骨量不足或植入不到位，难以达到预期的效果^[1-2]。

临床尝试应用及研发骨修复材料，此类材料除了具备良好的生物相容性和生物力学性能之外，至少还应具备骨生成、骨诱导和骨传导这3种能力其中之一。

骨生成能力是指植骨材料中含有能形成新骨的细胞，如成骨细胞或骨髓干细胞。骨诱导能力是指植骨材料中的某些因子(如骨形态发生蛋白)能诱导植骨床邻近宿主结缔组织中未分化的骨祖细胞分化、增殖为成骨细胞，从而形成新骨。骨传导能力是指植骨材料形成支架，利于植骨床邻近宿主骨表面和骨髓中的成骨细胞进入植骨材料，为新生的血管、骨前体提供支撑结构，形成新骨。目前尚无一种人工骨替代材料具有自体骨的这3种能力^[3-4]。另外众所周知骨髓间充质干细胞具有多项分化潜能，正确的诱导作用下可以分化为骨组织，促进组织骨愈合^[5-7]，但细胞与骨组织直接复合的方法存在细胞利用率低等缺点。

近年来研究表明，细胞膜片技术可保护细胞自分泌的细胞外基质、细胞-基质连接以及细胞-细胞连接等结构不被破坏，而这些结构对于细胞分化、特异性表型维持、分泌组织形成等功能起着非常重要的作用^[8]，另外细胞膜片不仅可以提高种子细胞的种植效率，还可以很好地解决细胞流失的问题^[9]。本研究选用来源丰富、容易获取、体外扩增速度快、安全实用、无伦理学争议的骨髓间充质干细胞作为种子细胞来构建细胞膜片，同时选择自体髂骨松质骨作为支架材料进行实验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：自体对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2014年6月在河北医科大学口腔医院河北省口腔医学重点实验室完成。

材料：

实验动物：6-12月龄比格犬6只，雌雄不限，体质量8-15 kg；1至2月龄比格犬2只，体质量1-3 kg，均由河北医科大学实验外科提供。

骨髓间充质干细胞膜片复合自体髂骨移植修复牙槽嵴裂实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
α-MEM培养基	Gibco，美国
胎牛血清	杭州四季青，中国
细胞总RNA提取试剂盒	Takara，日本
胰蛋白酶	Amresco，美国
鼠抗犬 CD29、CD90、CD34、CD44	eBioscience，美国
RT-PCR试剂盒	Takara，日本
real time PCR仪器	Applied biosystems，美国
二氧化碳恒温孵箱	Thermo Forma，美国
超净工作台	泰斯特仪器有限公司，中国

实验方法：

骨髓间充质干细胞分离培养：1至2月龄幼犬， 0.1 mL/kg速眠新肌注麻醉，0.5%碘伏消毒双侧腔骨上端的皮肤，表面用2%盐酸利多卡因局部浸润麻醉，用18号无菌髓针(先用肝素钠润湿针管内壁)穿刺腔骨，10 mL肝素钠润湿的注射器抽取骨髓3.0-4.0 mL，分别注入真空采血管置于冰上待用。将真空釆血管中的骨髓移入10 mL EP管中，加入等量的0.01 mol/L PBS混匀，1 500 r/min离心5 min。弃上清，用3 mL含体积分数为15%胎牛血清的低糖DMEM培养基将细胞沉淀轻轻吹打成单细胞悬液，接种于50 mL带滤膜的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中静置培养。每两三天更换培养液，细胞融合至80%-90%则可传代。

骨髓间充质干细胞的鉴定：取培养扩增后的第3代骨髓间充质干细胞，经2.5 mL胰酶消化后，用含10 g/L牛血清白蛋白的PBS洗涤、重悬细胞，制成单细胞悬液，分别加入Eppendorf管中，每管200 μL (1×10⁶细胞)，再分别加入鼠抗犬CD29、CD34、CD44、CD90各2 μL和同型对照流式抗体，4 ℃避光孵育60 min，用含体积分数为3%胎牛血清的PBS清洗3遍并重悬细胞(注：4 ℃，1 000 r/min，5 min)。流式细胞仪检测，Cell-Quest软件分析。

骨髓间充质干细胞膜片构建：将培养获得的生长力旺盛的第3代骨髓间充质干细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液，调整细胞浓度，按1×10⁶细胞的量接种在6 cm培养皿中，加入2.0-3.0 mL含体积分数为15%胎牛血清低糖培养基，添加维生素C，调整维生素C的质量浓度为 50 mg/L，轻柔晃动培养皿使细胞均匀铺于培养皿底，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂恒温箱中孵育，隔日换液，连续培养(不进行传代)8-10 d后，培养皿底部可见半透明的白色膜样物质，当边缘细胞有褶皱时，说明细胞膜片已经成熟，用细胞刮刀将细胞膜片从培养皿边缘褶皱处向中心小心完整刮下，使膜片与培养皿完全分离，获得完整的细胞膜片。

牙槽嵴裂模型的建立：参照 Matsui等^[10]实验中单侧牙槽突裂即刻植骨模型的制备方法：6-12月龄犬头面部及口内以 0.5%碘伏消毒，铺洞巾，以利多卡因浸润麻醉双侧尖牙之间的颊侧及腭侧牙龈，测量双侧上颌尖牙牙尖间距离，沿上唇系带自龈缘至前庭沟底切开黏膜至骨面，再沿龈缘切开，范围为双侧尖牙之间，形成倒T形的切口，翻起颊侧黏膜至鼻底部，显露出上颌骨，同理切开腭侧龈缘，翻起黏膜瓣显露腭部骨质，暴露犬鼻腭孔。

以骨钻磨切，生理盐水冲淋降温，先于尖牙近中处，沿牙体长轴方向、犬颅骨冠状面方向做一个截骨面，上至鼻底，深达鼻腭孔，再于第一侧切牙近中沿牙体长轴方向犬颅骨近似矢状面制备一个截面，上至鼻底，内达鼻腭孔，保护临近牙牙根。在确认鼻底及鼻腭孔处黏膜完整的情况下，用咬骨钳将骨段连同第一、二侧切牙一同截下，得到于鼻腭孔处断开、形状近似梯形的骨缺损；该缺损长 1.2-1.5 cm，宽约1 cm。两侧以同样方法制备，即得到了双侧牙槽嵴裂骨缺损模型，术后给予全流饮食，肌注抗生素控制感染。

移植骨的制备：将6-12月龄实验犬髂部备皮侧后肢的固定解开，使犬下半身呈侧卧位，将髂部皮肤先向下绷紧，沿髂前上嵴外侧缘行长约5 cm切口切开皮肤至骨面，剥离附着于髂骨上的肌肉，暴露出髂前上嵴。在冷水冲淋下，以骨钻实施髂前上嵴处开窗，暴露深面的松质骨。用挖匙用力挖出松质骨并予以捣碎，用湿的生理盐水垫保存。将取下的髂骨松质骨以组织剪剪碎，制备成碎骨块，直径为2.0-3.0 mm。

采用自体对照方式，实验组(左侧)将骨髓间充质干细胞膜片包裹髂骨骨碎块后植入犬牙槽突缺损内严密缝合伤口，对照组(右侧)植入单纯髂骨骨碎块。

术后处理：术后进流食，每日观察口内、髂部伤口情况；术后连续3 d肌注青霉素，每日剂量约为 4×10⁴ U/kg；髂部伤口每日换药，14 d后拆除缝线。

主要观察指标：于术后当天、术后3个月、术后6个月在麻醉状态下拍摄犬上颌骨CT，将CT数据导入三维重建软件(Mimics10.01)，重建出植骨区，测量新骨体积，并计算植骨区骨吸收率。

骨吸收率=(术后当天骨体积-术后某时间点骨体积)/术后当天骨体积。

术后6个月时相对于3个月时的骨吸收率=1-(术后6个月时骨体积/术后3个月时骨体积)。

术后6个月处死实验动物，将植骨区长成的新骨截下，固定在MicroCT(电压80 kV，电流500 μA)载物台以360°扫描角度获得扫描图像。扫描完成后在主机上选出生长板下长为5 mm，宽为5 mm，高为5 mm的立方体为感兴趣区域，进行骨小梁三维图像重建，利用西门子公司的配套软件分析骨小梁微观三维结构并获得了骨体积分数(bone volume relative to tissue volume，BV/TV)、骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁厚度(trabecula thickness Tb.Th)等骨小梁的空间结构参数，以观察新生骨块在微观结构上的差异。同时应用美国GE公司PIXImu2对各区域骨密度进行测量。

统计学分析：选用SPSS 15.0统计软件包进行数据处理，采用配对样本t 检验对实验组及对照组数据进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

牙槽突裂为一种先天性发育畸形，表现为形态复杂的骨缺损，临床上使用自体髂骨移植的方法修复牙槽突裂，不存在免疫排斥的问题，其中的活性成骨细胞具有骨诱导的能力，便于新骨的形成，同时松质髂骨中还有间充质干细胞，可以向成骨细胞分化^[12]；具有骨传导的作用，植入骨块的本身就具有支架的作用，便于血管的长入及新骨的生成；还具有骨形成作用，髂骨松质骨内含有骨原细胞，植入受区后就可以开始长成新骨。其次是因为相较于其他部位，髂骨的体积较大，可以获得更多的松质骨，但是因植骨治疗的特殊性，植骨材料无法避免遭到吸收以及牙槽嵴裂植骨修复术存在一定的失败率，常常不能获得稳定的手术效果，移植骨的吸收率因人而异，受到许多因素的影响^[13]。

研究表明骨髓间充质干细胞对骨生成具有良好的促进作用^[14]，传统的组织工程构建方法是在扩增细胞之后，将其接种于骨组织或材料上，然后进行培养或者体内移植实验，融合的细胞在种植于支架前通常需要经过胰酶消化成悬浮细胞，这样细胞的表型及生化成分发生改变，细胞活性受到损伤，分泌的胞外基质也被破坏^[5]，并存在细胞利用率较低、细胞的接种密度和分布不均匀等问题。细胞膜片技术有效地保护了细胞间的蛋白连接，最大限度的保留了细胞分泌的细胞外基质、细胞-细胞间的联系、细胞表面蛋白(受体、离子通道、细胞连接等)等，使得细胞的生物学特性得到充分发挥^[15-16]。但是膜片同时也存在一定的不足之处如：单层的细胞膜片内细胞外基质含量有限，物理机械性能也不是很理想，可操作性相对较差，所含细胞量较少，成骨能力较差。

多层细胞膜片由于富含基质蛋白，就会易于收缩，成熟后膜片会发生卷曲、折叠或堆积，难以保持特有的形态，若不及时将膜片刮下，成熟后膜片将自动收缩成团，目前有很多研究采用将膜片复合于一些生物性支架上改善膜片的这些缺点。但支架也存在着一些缺点限制了其应用，如材料会降解，会在一定程度上阻碍营养物质渗入，不利于组织的再生和修复^[17]。本实验采用骨髓间充质干细胞膜片依附自体骨有效的提高了干细胞成骨分化能力。

本实验研究表明实验组3个月及6个月时骨吸收率明显低于对照组，表明骨髓间充质干细胞膜片促进了新骨的形成或减少了骨质吸收；3个月时植骨区无骨块状的影像，已长成连续的骨松质结构，统计3个月到6个月两组骨吸收率无明显差异，表明3个月时新骨的形成已大体完成，植骨区的状况就已经开始接近稳定；本实验利用Micro-CT检查骨小梁结构的性质、密集性、骨小梁结构的厚度及骨质密度等方面，结果显示实验组的骨体积分数大于对照组，说明骨髓间充质干细胞膜片参与下实验组的植骨区长成了更多的新骨，同时实验组的骨小梁分离度小于对照组，说明实验组的骨小梁更加密集，也意味着有更多的新骨生成。研究表明细胞膜片既可以保存细胞外基质，又可以进行细胞的正常生理活动^[17]，同时膜片中的骨髓间充质干细胞仍然具有向成骨细胞分化及增殖的潜能，可用于后续生物输送盘的构建，可以与冻干骨复合后使种子细胞产生成骨因子表达，促进新骨的形成。细胞膜片/自体髂骨充填骨缺损后，一方面引导骨床的骨组织长入，另一方面细胞膜片中的成骨细胞自膜片中游离出来，向髂骨骨松质内迁移并成骨，被吸收的骨质遗留的空间由新生的骨组织充填，缺损得到完全性的骨修复^[18]。

本实验首次将骨髓间充质干细胞膜片引入牙槽突裂植骨手术这一领域，在动物实验上取得了较理想的结果，但其作用机制尚不明确，需要进一步探索。

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Bone mesenchymal stem cell sheet transplantation combined with autologous iliac bone for repair of alveolar cleft

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