酪氨酸羟化酶修饰人脐血间充质干细胞移植帕金森病大鼠纹状体内的多巴胺含量

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，干细胞治疗比药物治疗更接近于恢复患者的生理模式，细胞移植治疗已逐渐成为一种趋势。

目的：观察酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞移植后帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量的变化。

方法：将酶切鉴定后的新构建质粒pEGFP-C2-TH经电穿孔法转染第3代脐血间充质干细胞，注射到帕金森病大鼠右侧脑室，对照组注入PBS。观察移植细胞在大鼠脑组织内的迁移情况，高效液相色谱仪检测大鼠纹状体内多巴胺的含量。

结果与结论：质粒pEGFP-C2-TH转染的脐血间充质干细胞移植后8周，细胞逐渐向脑室转移，12周时迁移至皮质，可表达酪氨酸羟化酶抗原，且实验组多巴胺含量明显高于对照组(P < 0.05)。结果表明酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞经脑室移植对帕金森病大鼠具有明显的治疗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 多巴胺, 脐血来源间充质干细胞, 帕金森病, 大鼠, 酪氨酸羟化酶

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell therapy is superior to drug therapy for recovery of patient’s physiological mode, and cell transplantation therapy is becoming a trend.

OBJECTIVE: To observe the changes in dopamine content in the stratum of Parkinson’s disease rats after transplantation of tyrosine hydroxylase-modified human umbilical cord blood mesenchymal stem cells.

METHODS: After identification by enzyme digestion, pEGFP-C2-TH plasmid was transfected into the fourth generation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells by electroporation method, and then transfected cells were injected into the right cerebral ventricle of Parkinson’s disease rats (experimental group). PBS injection was performed in the control group. Migration of dopamine in the brain tissue of rats was observed, and the content of dopamine was detected by high performance liquid chromatography．

RESULTS AND CONCLUSION: At 8 weeks after cell transplantation, the cells gradually migrated to the ventricles; after 12 weeks, the cells migrated to the cortex, and expressed tyrosine hydroxylase antigen. Meanwhile, the content of dopamine was significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). These results reveal that the intraventricular transplantation of tyrosine hydroxylase-modified human umbilical cord blood mesenchymal stem cells has obvious therapeutic effect on Parkinson’s disease rats.

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Key words: cord blood stem cell transplantation, Parkinson disease, tyrosine 3-monooxygenase, dopamine

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量 32只实验大鼠，造模成功的28只全部进入结果分析。

2.2 脐血间充质干细胞的分离和纯化接种后第1天，细胞基本呈圆形，悬浮状；4 d后贴壁，原代细胞呈细长型，圆锥状，散在分布，数目稀少，消化后继续传代培养，10 d后，细胞生长达85%融合，多数脐血间充质干细胞呈长梭形，贴壁牢固，排列紧密，取第3代细胞备用(图1)。

2.3 质粒pEGFP-C2-TH的酶切鉴定电泳结果中，质粒pEGFP-C2-TH在双酶切后表达的目的片段及质粒pGEMTH-3经PCR扩增后的DNA片段与质粒pGEMTH-3酶切下释放的TH基因(1.77 kb)大小一致(图2)。

2.4 质粒pEGFP-C2-TH转染脐血间充质干细胞后的表达转染5 h后，细胞开始贴壁，细胞生长达70%左右瓶底覆盖率时，计算转染率为(57.3±7.1)%，TH细胞免疫组化计算表达率为(89.1±6.0)%(图3，4)。

2.5 细胞移植后纹状体内多巴胺含量的变化移植前，进行高效液相色谱-电化学检测显示帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量约为20 ng/g。移植后8周，对照组多巴胺含量为(19.61±0.92) ng/g，与移植前差异无显著性意义(P > 0.05)，实验组多巴胺含量为(26.77±3.01) ng/g，明显高于对照组和移植前，统计学结果显示与对照组和移植前比差异均有显著性意义(P < 0.05)。移植后12周，对照组多巴胺含量为(19.85±0.53) ng/g，变化不大，实验组多巴胺含量为(29.32±0.12) ng/g，继续增多，且明显高于对照组，统计学结果显示差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 TH修饰的脐血间充质干细胞在大鼠脑内的迁移情况移植8周时，可见植入的细胞逐渐向外迁移，分布于脑室前1.8 mm、脑室后3.2 mm，以及脑室膜下(2.8±0.3) mm范围内，呈带状分布(图5A)。12周时见向皮质迁移(图5B)，免疫组化显示移植的细胞TH表达阳性(图6)。实验组健侧和对照组均未发现间充质干细胞。

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引言

帕金森病的病因尚未明确，可能与包括遗传在内的多种因素有关^[1]，其病理特征为黑质致密部的色素脱失和多巴胺神经元的大量丧失及路易体的出现^[2]，好发于中老年人，平均始发年龄为57岁，大于60岁的患病率达1%-2%。目前，据统计世界上约有500万帕金森病患者^[3]，而在中国约有170万患者^[4]。随着人口的老龄化，帕金森病的患病率和发病率呈明显的增长趋势^[5]。虽然近年来在药物治疗方面的研究进展使得帕金森病的症状得到有效控制^[6]，但仍有许多问题亟待解决，比如：药物不良反应，药效降低，痴呆、平衡障碍等症状的进行性恶化^[7]。帕金森病的外科治疗主要包括苍白球损毁术、脑深部电刺激等，但是它们的应用受到手术适应证、手术技术、并发症^[8]、昂贵的医疗价格等方面的限制。目前，干细胞移植和基因治疗帕金森病成为了一个新的研究方向^[9-11]，帕金森病也是公认的适合进行细胞移植和基因治疗的病种之一^[12-15]。研究表明，干细胞治疗比药物治疗更接近于恢复患者的生理模式，主要包括胚胎干细胞^[16]、成人神经干细胞、骨髓间充质干细胞等。但是它们面临道德伦理、来源受限、免疫排斥等棘手问题，在临床方面的研究发展受到极大地限制。脐血又称胎盘血或脐带血，是胎儿出生时脐带内和胎盘近胎儿一侧血管内的血液。脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞^[17]，是近几年来发现的一类具有与骨髓干细胞相同的多向分化潜能的原始祖细胞，并且其来源丰富，免疫排斥低等特点受到广泛关注。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)是儿茶酚胺类神经递质即多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素生物合成过程所需的限速酶，也是多巴胺能神经元的标志酶，它以四氢生物喋呤啶为辅酶，催化酪氨酸的羟化而生成多巴。

本实验将大鼠酪氨酸羟化酶基因修饰的人脐血来源间充质干细立体定向注射到帕金森病大鼠脑室内，观察其在大鼠脑内的存活、迁移情况，以及移植后纹状体内多巴胺含量的变化，旨在为进一步的实验和临床移植途径的选择提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年3至10月在郑州大学医学院干细胞研究中心完成。

材料：

实验动物：健康雄性SD大鼠32只，体质量180-420 g，购自河南省实验动物中心。实验过程中对动物的处理符合伦理学标准。

实验方法：

pEGFP-C2-TH构建：将pGEM-TH-3在引物1：5’-TAC TTG AGC GCC CAC CCC-3’，引物2：5’-GTG TCT ACT TAA TGG CAC TCA-3’扩增后的酪氨酸羟化酶基因与pEGFP-C2连接，引入XhoⅠ和Sa Ⅱ双酶，行酶切电泳检测。

帕金森病模型的建立：用35 g/L水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠后，将大鼠固定于立体定向器上，以前囟为零点，参照包新民等^[18]的《大鼠脑立体定位图谱》，确定大鼠右侧前脑内侧束和中脑腹侧被盖区两点坐标(前脑内侧束为前囟后4.0 mm，矢状缝右侧1.8 mm，颅骨下7.9 mm；中脑腹侧被盖区为前囟后4.6 mm，矢状缝右侧 1.4 mm，颅骨下7.9 mm)。向每点用微量进样器注射新鲜配置的6-羟基多巴胺溶液6 μL(3 g/L，溶于含2 g/L抗坏血酸的生理盐水中)，注射速度为0.5 μL/min，留置空针 10 min，以1 mm/min的速度缓慢退针。1周后腹腔注射阿扑吗啡(1.0 mg/kg)以诱发旋转实验，随机将28只造模成功大鼠分成实验组与对照组，每组14只。

pEGFP-C2-TH转染脐血间充质干细胞：脐血来源于郑州市妇幼保健医院产科，参照文献[19]分离并纯化脐血间充质干细胞，取第3代脐血间充质干细胞，在Nucleofector^TM细胞核转染仪A=31程序下进行转染，然后继续培养3 d，进行TH免疫组化染色，计算转染率和融合蛋白表达率。

脐血间充质干细胞的移植：将细胞浓度调整为2.0× 10⁶ L^-¹，造模成功后即刻进行细胞移植。将帕金森病模型大鼠麻醉后固定于立体定位器上，以前囟为零点，定位右侧纹状体2个移植点：前囟前1.2 mm，矢状缝右2.8 mm，颅骨下5.2 mm；前囟前1.2 mm，矢状缝右2.8 mm，颅骨下7.2 mm。实验组每点注射6 μL脐血间充质干细胞，注射速度0.5 μL/min，注射完毕后留针10 min，以1 mm/min的速度缓慢退针。对照组按上述方法和坐标，注入6 μL PBS。

主要观察指标： ①移植后8，12周取脑制作冰冻切片(每组每个时间点2只)，用荧光显微镜观察脐血间充质干细胞的存活与迁移情况。②在移植前，移植后8周和12周(每组

每个时间点2只)，动物麻醉后迅速断头取脑置于冰上取右侧纹状体，标本按3 mL/g加0.05 mol/L高氯酸溶液，研磨后于4 ℃，12 000 r/min，离心20 min，取上清，同样条件下再离心10 min，取上清25 μL进样，在高效液相色谱-电化学检测仪上检测多巴胺的含量。

统计学分析：数据以均数±标准误表示。采用SPSS 11.0版软件包对脐血间充质干细胞移植前后帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量行重复测量数据的方差分析，检验水准α=0.05。

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讨论

帕金森病是一种与年龄相关的神经变性疾病，主要是黑质纹状体区的多巴胺能神经元的减少或消失^[20-21]。目前，干细胞生物学的研究与应用日益受到关注，其中骨髓间充质干细胞研究较多^[22-24]，有实验表明，骨髓间充质干细胞在体外纯化后，移植入帕金森病大鼠脑内，可在脑内分化为多巴胺能神经元，明显增加多巴胺含量^[25]，可改善症状，但脐血来源间充质干细胞较少报道。脐血作为一种新的可靠干细胞来源，有自身的很多优点，尤其是脐血来源间充质干细胞在适当条件下具有向神经细胞、成骨细胞、肝细胞等组织细胞的多项分化潜能^[26-29]，并且脐血来源间充质干细胞容易获取、能有效表达外源基因。体外研究中，脐血来源间充质干细胞可在多种因子的共同诱导下表达酪氨酸羟化酶^[30]，而酪氨酸羟化酶阳性的表达正是多巴胺能神经元的基本特征，在体内定向分化的报道不是很多。与其他来源干细胞相比，脐血来源广泛，脐血中淋巴细胞的免疫功能不够成熟，免疫原性较弱，移植物抗宿主病发生率较低^[31]，且脐血中间充质干细胞易于分离^[32]。本研究以脐血间充质干细胞为种子细胞，为进一步的实验及临床应用奠定基础。质粒pEGFP-C2-TH修饰后的脐血间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶及增强型绿色荧光蛋白。酪氨酸羟化酶是多巴胺合成的限速酶，在帕金森病患者脑内酪氨酸羟化酶蛋白质含量与细胞内酪氨酸羟化酶mRNA含量是同步降低的，而当在纹状体内导入外源性基因提高酪氨酸羟化酶的表达后，可显著提高中脑内多巴胺的含量^[27]，因此，表达酪氨酸羟化酶基因，使脐血间充质干细胞具有多巴胺能神经细胞的部分特征；另一方面，共表达增强型绿色荧光蛋白作为指示剂，是酪氨酸羟化酶基因表达及移植细胞迁移的客观观察指标，本研究中酪氨酸羟化酶和增强型绿色荧光蛋白的共表达率为89.1%，使脐血间充质干细胞移植后的追踪及酪氨酸羟化酶的表达更为直接和可视化。

本研究移植酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞后，荧光显微镜下观察显示8周时，开始向周围迁移，12周时迁移至皮质周围。帕金森病组模型大鼠多巴胺含量与对照组相比，在8周时，增加了约36.8%，统计显示差异有显著性意义(P < 0.05)，12周时，增加了约52.6%，差异有显著性意义(P < 0.05)，与荧光显微镜下观察及免疫组化结果相一致。镜下观察提示脐血间充质干细胞可以在室管膜下沿脑室呈带状分布。由此可以初步认为脐血间充质干细胞可以穿过血脑屏障而在脑组织内存活，与此前研究中发现骨髓源及胎源干细胞可以通过血脑屏障相类似^[9]，但是其通过血脑屏障机制尚不清楚。现对于单纯的脐血间充质干细胞脑内移植治疗帕金森病^[33]，经基因酪氨酸羟化酶修饰的间充质干细胞活动范围更大，存活时间更长。

酪氨酸羟化酶基因修饰的脐血间充质干细胞可以通过脑室移植途径对帕金森病大鼠起到一定的治疗作用，为基础研究和临床治疗提供了依据，脐血间充质干细胞虽然在脑内可以表达酪氨酸羟化酶抗原，但是否能分泌多巴胺，是否能分化为其他相关神经递质类细胞，如肾上腺能、胆碱能神经元等，都有待进一步的研究。