SK-N-SH神经母细胞瘤干细胞培养及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.009

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (45): 7260-7265.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.009

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SK-N-SH神经母细胞瘤干细胞培养及鉴定

谢艳¹，宿玉玺²，覃佳强²，南国新²，黄世峰³，王忠良²，蔡文全²

¹重庆市渝北区妇幼保健院检验科，重庆市 401120；²重庆医科大学附属儿童医院骨科；干细胞实验室；儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室；重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地，重庆市 400014；³重庆医科大学附属第一医院检验科，重庆市 400042

出版日期:2014-11-05 发布日期:2014-11-05
通讯作者: 宿玉玺，博士，主治医师，讲师，重庆医科大学附属儿童医院骨科；干细胞实验室；儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室；重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地，重庆市400014
作者简介:谢艳，女，重庆市人，2013年重庆医科大学毕业，硕士，主管检验师，主要从事肿瘤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81001197)；重庆市自然科学基金项目(2010JJ0267)；国家临床重点专科建设项目资助国卫办医函([2013]544)

Culture and identification of SK-N-SH neuroblastoma stem cells

Xie Yan¹, Su Yu-xi², Qin Jia-qiang², Nan Guo-xin², Huang Shi-feng³, Wang Zhong-liang², Cai Wen-quan²

¹Department of Clinical Laboratory, Maternal and Child Care Service Centre of Yubei District, Chongqing 401120, China; ²Department of Orthopedics, Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China; ³Department of Clinical Laboratory, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400042, China

Online:2014-11-05 Published:2014-11-05
Contact: Su Yu-xi, M.D., Attending physician, Lecturer, Department of Orthopedics, Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China
About author:Xie Yan, Master, Laboratorian in charge, Department of Clinical Laboratory, Maternal and Child Care Service Centre of Yubei District, Chongqing 401120, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81001197; the Natural Science Foundation of Chongqing, No. 2010JJ0267; National Key Clinical Specialist Construction Projects of China, No. (2013)544

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经母细胞瘤是儿童较为常见的实体瘤，儿童肿瘤受环境因素影响小，其与发育的关系紧密。而悬浮法是一种有效并可靠的获得肿瘤干细胞的方法。

目的：采用悬浮法培养人神经母细胞瘤SK-N-SH，获得具有干细胞特性的克隆球，并对其生物学特性进行鉴定。

方法：采用无血清悬浮培养的方法，获得具有克隆性增生的肿瘤球，免疫荧光鉴定克隆球细胞是否具有干细胞特性；通过荧光素酶标记SK-N-SH神经母细胞瘤，将所得克隆球与普通培养肿瘤细胞种植在裸鼠背部，活体成像监测细胞在裸鼠体内的增殖特性。

结果与结论：悬浮培养法可将SK-N-SH神经母细胞瘤培养成克隆球，将无血清培养的克隆球免疫荧光检测分子生物学标记，显示强阳性表达，将其种植于裸鼠背部皮下显示其具有较强增殖与转移的生物学特性。提示悬浮法培养的SK-N-SH神经母细胞瘤克隆球，分子生物学标记巢蛋白Nestin强表达，胶质原纤维酸性蛋白、特异性神经元管蛋白(Tuj-1)弱表达，具有神经干细胞的特性，在裸鼠体内具有较强的增殖性与转移侵袭性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 神经母细胞瘤, 悬浮培养法, 神经干细胞, 细胞培养, 裸鼠, 荧光素酶, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Neuroblastoma is a common solid tumor in children. Pediatric tumors are little affected by environmental factors, but closely related to child development. The suspension method is an effective and reliable method to harvest neoplastic stem cells.

OBJECTIVE: To culture the cell clones of human neuroblastoma cell line SK-N-SH and to assess the biological properties of the cell clones.

METHODS: Using the suspension method with no serum media, tumor cell clones were obtained. Immunofluorescence method was used to identify whether tumor cell clones exhibit stem cell properties. SK-N-SH neuroblastoma was labeled by luciferase, and tumor cell clones and tumor cells were seeded onto the back of nude mice to monitor cell proliferative properties in nude mice using in vivo imaging.

RESULTS AND CONCLUSION: Using the suspension culture method, SK-N-SH neuroblastoma cells could successfully develop into cloning balls. Under serum-free culture, cloning balls were immunofluorescently used to detect molecular markers that showed strong positive expression. Cloning balls subcutaneously implanted into nude mice showed the strong ability of self-renewal and differentiation as stem cells. The cell clones cultured by the suspension method strongly expressed Nestin, but weakly expressed glial fibrillary acidic protein, neuron-specific tubulin, possessing stem cell characteristics and strong proliferation and metastasis in nude mice.

全文链接：

Key words: neoplasms, neuroblastoma, neoplastic stem cells, neural stem cells

中图分类号:

R394.2

谢艳，宿玉玺，覃佳强，南国新，黄世峰，王忠良，蔡文全. SK-N-SH神经母细胞瘤干细胞培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(45): 7260-7265.

Xie Yan, Su Yu-xi, Qin Jia-qiang, Nan Guo-xin, Huang Shi-feng, Wang Zhong-liang, Cai Wen-quan. Culture and identification of SK-N-SH neuroblastoma stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(45): 7260-7265.

图/表（结果） 5

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞对比观察性实验。

时间及地点：细胞实验于2012至2013年在重庆医科大学附属第一医院完成，动物实验在美国芝加哥大学分子肿瘤实验室完成。

材料：

动物：裸鼠16只，8周龄，均为雄性，饲养于SPF清洁级，实验环境遵照美国芝加哥大学动物中心标准。

细胞：SK-N-SH细胞系，购自ATCC公司。

方法：

普通培养法：将SK-N-SH细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12作为基础培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养即为普通培养。

悬浮法培养：将SK-N-SH细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12作为基础培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，倾去培养基，0.25%胰酶+EDTA消化细胞，然后吹打成单细胞悬液，体积分数10%胎牛血清终止消化，计数8×10⁵细胞置于离心管，1 000 r/min离心 10 min，倾去上清液，培养于无血清培养基(含有DMEM/F12，1×B-27、20 μg/L人表皮细胞生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20 μg/L人白血病抑制因子)的六孔板内，置于培养箱内培养^[8-10^，^13-14]。普通光镜于12，24，36，48，72 h分别观察其生长状态。

神经母细胞瘤干细胞诱导分化及鉴定：SK-N-SH细胞株在悬浮培养下3-5 d，可见有细胞球形成，选取生长良好的细胞球，种植到放有小盖玻片(预先涂多聚赖氨酸)的六孔板中。其中一组用无血清培养基培养，另一组加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12。于接种后的4 h和7 d取出小盖玻片，用PBS小心漂洗2遍，吸净液体后，用40 g/L多聚甲醛固定约30 min，4 ℃保存备用。采用免疫荧光方法，对贴壁4 h的神经干细胞球和血清诱导分化的细胞进行nestin(神经干细胞标记蛋白)胶质原纤维酸性蛋白和特异性神经元管蛋白(Tuj-1)行免疫荧光，每张涂片加1滴或50 μL的非免疫性动物血清，室温下孵育10 min；每张涂片加1滴或50 μL鼠抗人第一抗体，室温下孵育1 h，荧光标记的羊抗鼠二抗体室温下孵育10-15 min。

神经母细胞瘤样干细胞在裸鼠体内成瘤性的检测：为了更好的示踪细胞在裸鼠体内的表达，芝加哥大学骨科中心分子肿瘤实验室将荧光素酶(luc)基因，通过反转录方式整合入SK-N-SH细胞株^[15]，获得SK-N-SH-luciferase细胞株，悬浮培养法与普通培养法分别培养上述细胞株，分别将悬浮法获得的克隆球细胞与普通培养的肿瘤细胞种植在裸鼠背部每只4个点，分4组，每组4只，细胞数量分别在1×10³，2×10³，4×10³，1×10⁴细胞数种植皮下，在第4，5，6，7周，采用荧光素显像仪对裸鼠活体内监测。

主要观察指标： 免疫荧光法和体内成瘤实验检测悬浮培养克隆球与普通培养法SK-N-SH的分子标记Nestin，GFAP，Tuj-1的表达及体内增殖情况。

统计学分析：免疫荧光及荧光素酶显像结果采用Image Pro Plus 6.0简体中文版软件，进行统计分析，统计结果采用t 检验，检验软件采用SPSS19.0(美国IBM公司)。

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讨论

近年来，肿瘤干细胞理论逐渐被接受，并且在越来越多的肿瘤中发现了肿瘤干细胞^[16]。目前肿瘤干细胞的鉴定分为两类^[17]：一类是分子标记，一类是功能鉴定。Singh等^[18]将CD133⁺标记的细胞富集后，发现CD133⁺细胞群，具有类干细胞的特性，故可将CD133作为肿瘤干细胞的标记；另一类则是从功能上筛选肿瘤干细胞，通过特殊培养方式得到肿瘤的亚克隆，若亚克隆具有自我增殖与定向分化的能力则认定该肿瘤细胞为肿瘤干细胞^{[4, 19-24]}。作者认为，干细胞的定义本就基于功能，即干细胞是具有自我更新与定向分化的细胞。因此，认为从功能上来分离鉴别肿瘤干细胞较分子标记更为贴切，这也是本实验所采用的方法^[17]。神经母细胞瘤作为儿童常见的肿瘤之一^[25-27]，若能将神经母细胞瘤的干细胞分离鉴别，这将改变人们对神经母细胞瘤的认识，给该肿瘤的治疗带来新思路，从而可能提高患儿的生存率与治愈率^[28]。该实验通过悬浮培养法分离得到肿瘤干细胞，悬浮培养法是经典的神经干细胞培养方法^[29-30]，需要无血清的DMEM/F12培养基，加入B-27、人表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，人白血病抑制因子等细胞因子抑制细胞分化，促进肿瘤干细胞自我增殖获得克隆球。为了鉴定所得克隆球细胞是否具有干细胞特性，对克隆球进行的分子用标记免疫荧光的方法发现：Nestin高表达，胶质原纤维酸性蛋白和Tuj-1低表达如图3。Nestin为神经上皮细胞的特异性抗原，属第Ⅳ类中间丝，在神经板上皮细胞即开始表达，当神经细胞的迁移基本完成后Nestin的表达量开始下降，并随神经细胞分化的完成而停止表达，已被广泛应用于神经干细胞的鉴定^[31]；胶质原纤维酸性蛋白和Tuj-1作为神经细胞中的星形胶质细胞的标记蛋白，免疫荧光证实所得克隆球具有干细胞特性。

众所周知，干细胞的界定是功能性的，干细胞必须具有自我增殖与定向分化的能力^[32-35]，该肿瘤球是否具有成瘤特性，需要进一步验证，裸鼠体内成瘤实验正是为验证该克隆球是否具有恶性变的生物学特性。将悬浮培养的肿瘤球细胞与普通培养的细胞(左侧)种植于裸鼠皮下，7周时，将裸鼠处死，增殖的肿瘤瘤取出称重测量，可见悬浮培养的肿瘤球细胞增殖较快；另外，本实验将肿瘤细胞注射于裸鼠背部皮下，其中克隆球肿瘤细胞注射于第1，2号裸鼠，普通肿瘤细胞注射于第3，4号裸鼠，在第1周时，观察到实验组与对照组并未见明显的增殖差异，在第4周时，这种差异仍不明显，但当在第5周和第6周时，实验组的肿瘤球细胞表现出明显的信号增强，表明悬浮培养的克隆球增殖迅速，具有很强的成瘤性。令人值得注意的是：在第8周时，当裸鼠不堪肿瘤重负，不得不终止实验，作者对裸鼠进行解剖，发现实验组细胞形成了明显的肺转移，而对照组并未见到此现象，此外从实验组与对照组裸鼠的存活率来看，实验组的裸鼠存活时间明显短于对照组。这说明悬浮培养的肿瘤球细胞，不仅具有很强的成瘤特性，更有较强的转移特性，并与存活率关系密切，以上实验表明悬浮法培养的克隆球细胞与肿瘤干细胞的特性相吻合，虽然肿瘤干细胞的概念极富争议^[15]，但本实验至少说明在SK-N-SH神经母细胞瘤中存在一小群细胞，它具有干细胞的分子标记，具有自我增殖能力、高转移能力，具有更强的恶性生物学行为。

临床上，在经历数次化疗、手术、放疗等综合治疗后，肿瘤仍然可以复发，复发与转移后肿瘤往往更具侵袭性，恶性程度更甚^[36-37]，是目前肿瘤治疗的难题^[38]，这促使作者思考，这些临床表现也许与肿瘤干细胞没有被彻底杀灭相关^[39-40]，若能有效针对肿瘤干细胞^{[38, 41-43]}，靶向治疗^[44-46]，可能对肿瘤的治疗提供新的思路与治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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