人脐带间充质干细胞联合番茄红素延缓比格犬的自然衰老

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：实验室前期已初步表明干细胞联合番茄红素对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用显著，且能明显改变衰老机体的免疫功能。

目的：观察人脐带间充质干细胞联合番茄红素对自然衰老比格犬的抗衰老作用。

方法：选用自然衰老的健康比格犬(6至7岁龄)16只，随机分为衰老对照组和衰老治疗组，以健康青年犬(3至4岁龄)作为青年对照组。衰老治疗组给予人脐带间充质干细胞和番茄红素联合治疗，其余两组给予等量的DMEM/F12细胞培养液和等量葵花籽油。治疗过程中定期观察各组犬的一般状况，测定血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛浓度及谷胱甘肽过氧化物酶活性。治疗24周后处死全部动物，观察各器官组织结构的病理变化。

结果与结论： ①治疗前，衰老对照组和衰老治疗组血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性均低于青年对照组，血清丙二醛浓度均高于青年对照组，差异有显著性意义(P均< 0.05)，而衰老对照组和衰老治疗组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。②衰老治疗组经24周治疗后，比格犬皮毛明显光滑，活动力加强，食欲较好；与治疗前和衰老对照组比较，血清中超氧化物歧化酶活性从治疗第8周起显著升高，谷胱甘肽过氧化物酶活性从第6周起显著升高(P均< 0.05)，血清丙二醛浓度从治疗第4周起显著降低(P均< 0.05)。③实验结束后，与衰老对照组比较，衰老治疗组各组织器官结构清晰，基本无炎性浸润，无明显坏死及纤维化病变，与青年对照组组织器官表现基本一致。以上结果表明脐带间充质干细胞联合番茄红素治疗能不同程度提高自然衰老比格犬血清抗氧化物酶的活性，降低丙二醛浓度，且能促进修复改善组织器官结构及功能，故具有明显的抗衰老作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 番茄红素, 人脐带间充质干细胞, 抗衰老, 超氧化物歧化酶, 丙二醛, 谷胱甘肽过氧化物酶, 比格犬

Abstract:

BACKGROUND: Previous tudies have shown that the anti-aging effects of stem cells with lycopene are more significant, and can also significantly improve the aging body immune function.

OBJECTIVE: To investigate the anti-aging effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with lycopene on the aging beagles.

METHODS: Sixteen aging beagles (6-7 years old) were randomly divided into two groups: aging control group and aging treatment group; young beagles (3-4 years old) were chosen as young control group. In the aging treatment group, human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with lycopene was given; while in the other two group, an equal amount of DMEM/F12 cell culture medium and sunflower oil was given. Each dog's general conditions were observed regularly during the whole progress. The changes of superoxide dismutase, malondialdehyde, glutathione peroxidase in the serum were detected at regular time of the whole process, and the structure changes of each organ were observed at 24 weeks of treatment.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Before treatment, the levels of superoxide dismutase and glutathione peroxidase in the aging control and treatment groups were lower than those in the young control group (P < 0.05), while the malondialdehyde content was higher than that in the young control group (P < 0.05). However, there was no significant statistical difference between aging control and treatment groups (P > 0.05). (2) For the aging treatment group at 24 weeks of treatment: the beagle fur became clearer and smoother, motility was strengthened, appetite became better; and the activity of superoxide dismutase in serum at 8 to 24 weeks of treatment increased significantly compared with before treatment (P < 0.05), the activity of glutathione peroxidase significantly increased from 6 weeks (compared with treatment before, P < 0.05), the malondialdehyde content decreased significantly from 4 weeks of treatment to the completion of the experiment (compared with before treatment, P < 0.05). (3) After the experiment, the microscopic observation showed that compared with the aging control group, the tissues and organ structures of the aging treatment group were all clear, had no inflammatory infiltrates, no obvious necrosis and fibrosis lesions. These results were mainly consistent with the observations of young control group. The above results show that umbilical cord mesenchymal stem cells combined with lycopene therapy on the natural aging beagles may enhance the activities of antioxidant enzymes, reduce malondialdehyde content, and their combination also can repair tissue structures and promote the functions, which has obvious anti-aging effects.

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Key words: umbilical cord, mesenchymal stem cell transplantation, aging, carotenoids

中图分类号:

R394.2

王琳琳，崔晓兰，时瀚，成雪，刘佳，申义，李倩倩，王意忠. 人脐带间充质干细胞联合番茄红素延缓比格犬的自然衰老[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(45): 7239-7245.

Wang Lin-lin, Cui Xiao-lan, Shi Han, Cheng Xue, Liu Jia, Shen Yi, Li Qian-qian, Wang Yi-zhong. The anti-aging study of human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with lycopene treatment in the aging beagles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(45): 7239-7245.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 22只比格犬均进入结果分析，中途无脱失。

2.2 比格犬一般情况治疗前，衰老对照组和衰老治疗组毛色暗淡、活动力差、动作迟缓、反应迟钝、食欲差。衰老治疗组经治疗后毛色变亮泽、食欲较好、活动力加强，肌肉结实程度较以前明显改善。衰老对照组随时间的延长，食量减少，体毛色泽性更差，行动更加迟缓，精神状态差。

2.3 人脐带间充质干细胞鉴定结果如图1所示，流式细胞术检测干细胞表面CD44(99.92%)、CD73(99.80%)、CD105(99.70%)高表达，CD34(2.25%)、CD45(0.79%)均呈低表达，符合人脐带间充质干细胞表面标志表达^[13]。

2.4 联合治疗方法对比格犬血清超氧化物歧化酶活性的影响如表1所示，治疗前，衰老对照组和衰老治疗组超氧化物歧化酶活性显著低于青年对照组，组间统计学分析差异有显著性意义(P < 0.05)，显示出自然衰老机体的抗氧化能力下降，机体氧自由基增多。

治疗8周以后，衰老治疗组超氧化物歧化酶活性逐渐升高，与治疗前、治疗2，4，6周比较，差异有显著性意义 (P < 0.001)；同期各时间点衰老治疗组超氧化物歧化酶活性高于衰老对照组，与衰老对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，与青年对照组比较，差异无显著性意义 (P均> 0.05)。由此可见，干细胞组联合番茄红素治疗可以显著改善自然衰老比格犬的抗氧化能力，提高超氧化物歧化酶活性。

2.5 联合治疗方法对比格犬血清丙二醛浓度的影响如表2所示，治疗前，衰老对照组和衰老治疗组的丙二醛浓度高于青年对照组，组间统计学分析差异有显著性意义(P < 0.001)，显示出自然衰老机体脂质过氧化产物增多。

治疗4周开始，随着治疗时间延长，衰老治疗组丙二醛浓度逐渐下降，与治疗前、治疗2周比较，差异有显著性意义(P均< 0.05)；同期各时间点衰老治疗组丙二醛浓度低于衰老对照组，差异有显著性意义(P均< 0.05)，与青年对照组比较，差异无显著性意义(P均> 0.05)。由此可见，干细胞组联合番茄红素治疗可以显著改善自然衰老比格犬的脂质代谢及过氧化产物的状况，降低丙二醛浓度。

2.6 联合治疗方法对比格犬血清谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响如表3所示，治疗前，衰老对照组和衰老治疗组谷胱甘肽过氧化物酶活性均低于青年对照组，组间统计学分析差异有显著性意义(P < 0.05)，显示出自然衰老机体的抗氧化能力下降，抗氧化物酶活性降低。

治疗6周以后，衰老治疗组谷胱甘肽过氧化物酶活性逐渐升高，与治疗前、治疗2，4周比较，差异有显著性意义

(P均< 0.05)；同期各时间点衰老治疗组谷胱甘肽过氧化物酶活性高于衰老对照组，差异有显著性意义(P均< 0.05)，与青年对照组比较，差异无显著性意义(P均> 0.05)。由此可见，干细胞组联合番茄红素治疗可以显著改善自然衰老比格犬的抗氧化能力，提高谷胱甘肽过氧化物酶活性。

2.7 比格犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺组织病理学形态 24周后各组比格犬组织病理切片显示：衰老对照组肝脏弥漫性空泡病变；脾脏红髓内见较多炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主；部分肺泡融合，肺间隔增宽，支气管上皮增生；偶见肾小球部分增大，余未见明显异常。而衰老治疗组和青年对照组中各组织结构轮廓清晰、正常，均未发生坏死、明显的纤维化(图2，3)。

2.8 比格犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺中CM-Dil标记细胞分布情况对3组比格犬心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织进行连续大量冰冻切片，于荧光显微镜观察：衰老治疗组可见CM-Dil标记的干细胞在心、肝、脾、肺、肾、胰腺组织中均有不同数量的分布，其中心、肝、脾、肾等组织较多(图4)。

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引言

机体的衰老是一种复杂的生理现象，是由许多因素共同作用导致的。人们对于衰老的诸多机制进行了广泛的研究，其中干细胞减少导致衰老的假说逐渐成为研究的热点。干细胞的衰老学说从根源上解释了衰老的发生^[1-2]，即衰老应该定义为细胞在生长的连续过程中，其细胞潜能逐渐丢失^[3]，因此干细胞抗衰老具有很大的潜力；而目前对于“自由基学说”进行的抗氧化研究发现^[4]，减少氧化损伤对衰老延缓也起到了一定的作用。本文旨在利用干细胞联合抗氧化剂番茄红素进行抗衰老研究，为衰老的预防和治疗寻求一种更健康有效的方式。课题组前期进行了人脐带间充质干细胞及番茄红素对D-半乳糖致衰老模型小鼠抗衰老的研究^[5-6]，实验结果显示，干细胞、番茄红素、干细胞联合番茄红素均具有不同程度的抗衰老作用，且干细胞联合番茄红素抗衰老作用优于二者单独应用。本文为了进一步有效验证前期实验结果，首次采用大中型哺乳动物自然衰老的比格犬作为研究对象，其进化程度比啮齿类动物高，更贴近人类的生理特征，且比格犬是国际上通用的标准实验犬，性情温顺、易稳定，匀质性好、血液生理生化指标稳定^[7]，在国家二类以上新药的研究中明确规定^[8]，必须应用比格犬进行实验。另外，自然衰老的比格犬更能模拟衰老人群的特征，可排除前期实验中人为、药物等导致的衰老干预因素，避免造模产生的误差，为干细胞联合番茄红素逐步过渡到临床抗衰老研究提供更坚实的实验理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年5月至2014年6月在中国中医科学院中药研究所完成。

材料：

实验动物：3-7岁龄健康比格犬，体质量10-15 kg，均购自北京芳元缘养殖场，动物许可证号：SCXK京2009-0014，实验过程中对动物处置符合动物实验处理的“3R”原则^[9]。

人脐带间充质干细胞：由北京大学航天临床医学院中心实验室提供。

方法：

实验动物分组：随机挑选健康青年(3至4岁龄)比格犬6只，雌雄各半，作为青年对照组；自然衰老比格犬(6至7岁龄)16只，雌雄各半，适应性喂养1周，随机分为衰老对照组(6只)、衰老治疗组(10只)。

人脐带间充质干细胞流式鉴定^[10]：取第2或3代人脐带间充质干细胞，PBS洗涤2次后重悬细胞，细胞浓度调整为1×10⁶ L^-¹。取出上述细胞悬液50 μL加入玻璃管中，向每管分别加入流式单抗，包括抗人CD44-FITC、CD105-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE及同型对照抗体IgG1-FITC、IgG1-PE，常温避光静置15 min，PBS洗涤2次后，流式细胞仪进行鉴定^[11]。

CM-Dil标记人脐带间充质干细胞^[12]：CM-Dil溶于二甲基亚砜中制成1 g/L保存液。将保存液稀释到生理盐水中制成质量浓度为1 mg/L工作液。取细胞悬液(1×10⁹ L^-¹)每毫升加5 μL CM- Dil工作液，37 ℃孵育5 min，4 ℃冰箱放置15 min，PBS洗2遍，生理盐水重悬细胞，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-¹。

人脐带间充质干细胞的输注：衰老治疗组经下肢静脉推入CM-Dil标记的第2代或第3代人脐带间充质干细胞悬液，每只5 mL(细胞数量2×10⁶/kg)。每4周输注1次，共输注4次。其余两组则于下肢静脉静推等量DMEM/F12细胞培养液。

动物给药：衰老治疗组喂养以葵花籽油溶解番茄红素的动物饮食，给药量按照人的等效剂量换算157 mg/(kg•次)，2次/d，连续喂养16周。青年对照组和衰老对照组喂以等量葵花籽油。动物每周称1次体质量，根据体质量变化调整药量。

样本采集： ①治疗前，治疗后2，4，6，8，12，16，20，24周于下肢小隐静脉处采静脉血入促凝管，3 500 r/min离心15 min，分离血清。②组织采集：移植后第24周，将犬用3%戊巴比妥钠麻醉，迅速取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织各2份，一份置于50 mL离心管中，组织固定液固定，用于病理切片；另外一份迅速置于液氮中，用于冰冻切片的制备。

血清学指标检测： ①超氧化物歧化酶活性：采用WST-1法检测，按照试剂盒说明书进行，酶标仪450 nm波长处测定。②丙二醛浓度：采用硫代巴比妥酸法，按照试剂盒说明书进行，酶标仪532 nm波长处测定。③谷胱甘肽过氧化物酶活性：采用酶促反应速率测定酶活性，按照试剂盒说明书进行，酶标仪412 nm波长处测定。

组织病理形态学观察：大体观察各组织的形态变化，然后将3组犬心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胰腺组织用固定液固定，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，4 μm切片，进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察上述脏器组织的形态学变化。

CM-Dil荧光示踪观察：取3组心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胰腺组织即刻行连续冰冻切片，片厚10 μm。制成冰冻切片后，用含DAPI的抗淬灭剂封固，标染各组织细胞核。3-5 min后荧光显微镜下观察CM-Dil标记的干细胞在组织中的分布情况。

主要观察指标： ①比格犬血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛浓度以及谷胱甘肽过氧化物酶活性。②比格犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺组织形态学变化。③人脐带间充质干细胞在主要组织器官的分布情况。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s表示，采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

一般情况下，机体衰老表现为自身功能减退，内环境稳定能力与应激能力下降，结构、组分逐步退行性变。干细胞衰老学说认为^[14]：造成上述表现的原因是由于随着年龄的不断增长，干细胞的数量逐渐减少，其分化潜能逐渐减弱，因此机体血细胞和其他细胞的再生能力下降^[15-16]，凋亡的细胞不能得到及时补充，组织器官结构发生异常以致表观性状改变、功能减弱，最终逐渐衰老死亡。实验中可以看到自然衰老对照组的表现：犬皮毛暗淡，食欲差，行动迟缓；脾、肺、肾等组织出现不同程度的衰老病理结构改变。而Parekkadan等^[17]研究发现间充质干细胞具有组织器官修复再生的保护作用。正常情况下，间充质干细胞在体内的作用就是分化产生新的间质组织^[18]，修复替代受损、老化及病变的细胞组织。例如Mei等^[19]研究指出，间充质干细胞可以使肺损伤小鼠肺组织炎性细胞浸润减少、增厚的肺泡间隔变薄、肺间质水肿减轻。同时文献表明间充质干细胞不仅在肺损伤中发挥作用，还可以改善认知能力，延缓老年痴呆^[20]、延缓神经肌肉萎缩^[21-22]、改善老年性关节症状，促进骨发育等^[23-24]。本实验中，衰老治疗组的一般状况得到明显改善：肌肉结实有力、行动能力明显提高，食欲好，皮毛色泽光亮；病理切片结果显示：与衰老对照组比较，衰老治疗组肺脏肺泡无明显融合，炎性细胞减少；脾脏未发现明显的炎性细胞浸润；肾小球基本正常，其余组织结构均得到明显改善，并且与青年对照组比较无明显异常。实验结果充分表明人脐带间充质干细胞具有修复损伤，促进组织功能恢复的作用。

同时免疫荧光结果显示，衰老治疗组心、肝、脾、肺、肾、胰腺中均发现CM-Dil荧光标记的脐带间充质干细胞。由此推测：外源性间充质干细胞经血液输入后，受趋化因子等作用定向“归巢”到损伤的组织器官中^[25-26]，通过分化修复替代途径，在体内特定条件下分化或跨胚层分化为各组织器官等，与宿主细胞共同组成活力旺盛的成熟器官，使得组织器官的结构功能得到明显改善，从脏器组织学、结构学、功能学上，延缓了衰老的进程。

间充质干细胞具有低免疫原性^[27]，细胞移植后不会产生免疫排斥反应。同时通过下调固有免疫细胞和获得性免疫细胞的活性抑制机体的免疫反应^[28-29]，调节体内促炎因子和抗炎因子生成，为干细胞在体内植入和作用的发挥提供良好的免疫微环境。同时Ponte等^[30]发现，间充质干细胞还具有营养作用，可分泌各种营养生长因子如神经生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素生长因子、碱性成纤维生长因子等^[31-32]，这为后期比格犬一般状况的改善，组织器官和细胞生长又提供了极大的营养和支持作用。

番茄红素是一种很强的抗氧化剂^[33-34]，具有抑制脂质过氧化，消除自由基的生物效应，它能诱导提高某些内源性抗氧化酶，比如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性^[35-37]。实验发现，治疗前衰老对照组和衰老治疗组血清学检测显示反映机体抗氧化应激能力的血清抗氧化物酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶)活性降低，丙二醛浓度增加。实验干预后，与衰老对照组比较，衰老治疗组比格犬机体抗氧化物酶活性逐渐提高，氧化损伤反应产物丙二醛浓度减少。后期衰老治疗组血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性甚至超过青年对照组的水平，而丙二醛浓度逐渐降低，甚至也低于青年对照组水平，说明机体的抗氧化能力提高，自由基被分解，氧化损伤减少，起到保护细胞组织的作用。外源性输入体内的干细胞恢复机体组织器官的年轻态，氧化自由基生成减少，从根源上减少氧自由基对机体的损伤，而且间充质干细胞在体内外通过直接分泌超氧化物歧化酶3，发挥神经保护作用^[38]。王宏兰等^[39-40]研究表明，间充质干细胞也能提高抗氧化物酶的活性，减少机体损伤产物的生成，二者共同维护氧自由基的平衡，预防和延缓衰老的发生。

同时，Ahn等^[41]运用人脐带间充质干细胞改善小鼠肺功能实验中表明，未在小鼠心、肝、脾等组织中发现异常。Zhang等^[42-43]实验发现，脐带间充质干细胞在临床治疗中是安全的。本实验中通过CM-Dil荧光跟踪发现^[44-45]，间充质干细胞输入到犬体内，在体内各组织中均有出现，且各组织病理切片结果也表明并无明显坏死，纤维化等出现，说明干细胞联合番茄红素的治疗在一定程度上是安全有效的。

综上所述，通过多次低剂量的干细胞输注，衰老损伤的组织器官得到修复替代和营养支持，从而也减少了氧自由基的产生；番茄红素的抗氧化疗效使得各种抗氧化酶的活性提高，分解过多的自由基使氧化损伤产物减少，二者共同作用发挥了显著的抗衰老作用，这对抗衰老治疗方式的新突破具有指导意义。