富血小板纤维蛋白释放转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (45): 7233-7238.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.004

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富血小板纤维蛋白释放转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

陈诚，李淑慧，张文丽，李一鸣，周晶，吴佩玲

新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830063

出版日期:2014-11-05 发布日期:2014-11-05
通讯作者: 吴佩玲，硕士，主任医师，新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830063
作者简介:陈诚，女，1988年生，湖北省大冶市人，汉族，主要从事口腔基础研究与牙体牙髓病学的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区青年基金(2013211B53

Effect of platelet-rich fibrin released transforming growth factor beta 1 on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Chen Cheng, Li Shu-hui, Zhang Wen-li, Li Yi-ming, Zhou Jing, Wu Pei-ling

Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Online:2014-11-05 Published:2014-11-05
Contact: Wu Pei-ling, Master, Chief physician, Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Chen Cheng, Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Youth Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2013211B53

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞是组织修复的理想细胞，能否提高其体外增殖的能力是促进组织修复的关键因素。
目的：观察转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响。
方法：兔耳中央动脉抽血，离心制备富血小板纤维蛋白，置于新鲜的DMEM培养液中，分别于37 ℃下静置7，14，21，28 d，收集富血小板纤维蛋白析出液，检测析出液中转化生长因子β1质量浓度。抽取兔骨髓进行体外培养骨髓间充质干细胞，将收集的富血小板纤维蛋白析出液配制成条件培养液作用于骨髓间充质干细胞，观察其对骨髓间充质干细胞增殖的影响。
结果与结论：转化生长因子β1质量浓度随着时间的递增而增高，21-28 d是质量浓度增长最快阶段，在28 d时达到高峰；同一刺激浓度下，骨髓间充质干细胞增殖在0至1 d降低，1至2 d明显升高，2至3 d为平缓期，骨髓间充质干细胞增殖速度最快的是150 ng/L组。实验证实了富血小板纤维蛋白析出液中转化生长因子β1的质量浓度随着时间的增加而增高，含有不同质量浓度转化生长因子β1的条件培养基对骨髓间充质干细胞增殖起到不同的促进作用，骨髓间充质干细胞在含有质量浓度为150 ng/L转化生长因子β1的条件培养基中培养两三天时，增殖速度为最快。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 富血小板纤维蛋白, 细胞因子, 转化生长因子β1, 增殖, 牙槽骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are the ideal cells for tissue repair. Whether the ability of in vitro proliferation can be enhanced is a key factor to promote tissue repair.
OBJECTIVE: To observe the effect of transforming growth factor β1 on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.
METHODS: Blood samples were taken from the central artery of rabbits to prepare platelet-rich fibrin by centrifugation method which was then placed into fresh DMEM at 37 ℃ for 7, 14, 21, 28 days to collect exudates. The mass concentrations of transforming growth factor-β1 in the exudates of platelet-rich fibrin were detected. Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were collected and cultured in the conditioned medium made by the exudates of platelet-rich fibrin, and the proliferation of cells was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Concentration of transforming growth factor β1 was increased with time increasing, increased fastest at 21-28 days, and peaked at 28 days. Under the same stimulus concentration, the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells was reduced at 0-1 day, increased obviously at 1-2 days, and entered into a steady phase at 2-3 days. Under 150 ng/L transforming growth factor β1, bone marrow mesenchymal stem cells proliferated fastest. Experimental findings indicate that with the increase of time, the concentration of transforming growth factor β1 in the exudates of platelet-rich fibrin increase gradually, and the conditioned media containing different concentrations of transforming growth factor β1 play different roles in promoting the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in the conditioned medium containing 150 ng/L transforming growth factor β1 for 2-3 days can proliferate fastest.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, transforming growth factor beta1

中图分类号:

R394.2

陈诚，李淑慧，张文丽，李一鸣，周晶，吴佩玲. 富血小板纤维蛋白释放转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(45): 7233-7238.

Chen Cheng, Li Shu-hui, Zhang Wen-li, Li Yi-ming, Zhou Jing, Wu Pei-ling. Effect of platelet-rich fibrin released transforming growth factor beta 1 on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(45): 7233-7238.

图/表（结果） 5

2.1 转化生长因子β1的质量浓度 ELISA方法检测富血小板纤维蛋白析出液中各时间点转化生长因子β1质量浓度，结果见表1。使用重复测量的方差分析，P < 0.001，可以认为时间对富血小板纤维蛋白析出液中转化生长因子β1浓度变化起主要效应。绘制浓度曲线图，根据表1及图3所示，富血小板纤维蛋白析出液中转化生长因子β1质量浓度变化趋势为浓度随着时间增加而增大，至28 d时，富血小板纤维蛋白中转化生长因子β1质量浓度达到最高值。

2.2　富血小板纤维蛋白析出液对骨髓间充质干细胞增殖的影响骨髓间充质干细胞在不同质量浓度及不同时间作用下MTT吸光度值比较结果见表2。

不同质量浓度转化生长因子β1干预0-3 d对骨髓间充质干细胞增殖的影响：见图4。各组刺激浓度培养下，骨髓间充质干细胞增殖均表现为0至1 d降低，1至2 d明显升高，2至3 d趋于平缓。时间对指标变化的主效应差异有显著性意义(P < 0.001)。且通过图4可以证明，在骨髓间充质干细胞增殖出现明显增高的阶段，骨髓间充质干细胞增殖速度最快的是150 ng/L质量浓度组。

转化生长因子β1刺激不同时间后对骨髓间充质干细胞增殖的影响：见图5。0 d组骨髓间充质干细胞增殖随质量浓度的增高总体呈现下降的趋势，期间有小幅度的上升，效果不明显，至150 ng/L时出现上升；1 d组骨髓间充质干细胞增殖随质量浓度的增高总体呈现不断下降的趋势；2 d组与3 d组均出现了骨髓间充质干细胞增殖随浓度的增高而不断上升，至150 ng/L刺激浓度时达到峰值，随后下降。通过表2计算，浓度对指标的主效应不显著(P=0.740 > 0.05)。

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引言

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是一种将自体血液加工的血液制品，它富含浓缩血小板和各种生长因子，在临床上用于补充血小板、促进创口愈合、加速成骨等^[1]。然而有学者提出，富血小板血浆的骨再生作用对于植入早期阶段有效，而相对于远期结果的影响并不明显^[2-3]。自2001年由Choukroun等科学家提出富血小板纤维蛋白这一概念以来，关于血液制品修复骨缺损的研究进入了一个新的阶段。富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是血液经过离心而得到的血小板浓缩物，经浓缩的血小板激活后可以释放多种细胞因子^[4-6]，如转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等。转化生长因子β作为一种趋化因子可以刺激成骨细胞和前成骨细胞的增殖，抑制破骨细胞的形成和骨的吸收，促进损伤组织纤维化、血管化，合成胶原^[7]。富血小板纤维蛋白主要是由纤维蛋白形成的疏松三维立体网状结构^[8]。这一纤维蛋白结构可以将释放的生长因子以化学键与血小板相结合，达到缓慢释放、延长生长因子作用时间的目的^[9]。骨髓间充质干细胞具有自我更新的能力和多向分化的潜能，在一定的条件下体外培养可向成骨、肌肉、脂肪、软骨等细胞分化，且具有较强的增殖能力^[10-12]。自1976年首先报道关于间充质干细胞在一定条件下可向成骨分化以来，近30年间，间充质干细胞结合相关材料支架已在临床中应用于骨损伤的修复^[13]。骨髓间充质干细胞在成骨诱导分化的过程中需要附着支架，然而在支架上进行增殖、分化，相比普通的培养而言，条件更高，要求更加严格，因此需要多种因子促进干细胞的体外增殖、分化^[14-16]。目前阶段，关于口腔种植领域骨组织缺损修复的研究，尚处于单纯应用自体骨移植、骨替代材料如羟基磷灰石或者富血小板纤维蛋白等血液制品进行骨组织的修复^[17]，这些方法有一定的缺点。自体骨移植对患者而言需要承受取骨时的第二次手术创伤。骨组织替代材料一方面降解时间难以控制，另一方面在制备过程中难以保证材料孔隙率，从而影响骨组织的愈合^[18]。富血小板纤维蛋白具有调节成骨活动的能力，但其作用相对缓慢，组织修复时间较长。既往的研究只是将富血小板纤维蛋白单独应用于骨缺损的研究^[19-20]，或者将富血小板纤维蛋白与骨组织替代材料如Bio-oss骨粉相结合^[21]，研究其对牙槽骨缺损修复的影响及作用。在以往的研究基础上，本实验将含有转化生长因子β1的富血小板纤维蛋白析出液与骨髓间充质干细胞相结合，观察其对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响，探讨其在拔牙窝愈合和牙槽骨缺损修复方面的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2014年3至9月在新疆医科大学科技楼干细胞实验室完成。

材料：

实验动物：2周龄新西兰大耳白兔1只，体质量3.2 kg，由新疆医科大学实验动物中心提供。实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求^[22]。

主要试剂与仪器：低糖DMEM培养液、PBS(美国Gibco公司)，青霉素/链霉素溶液、胎牛血清、胰蛋白酶、谷氨酰胺(Hyclone公司)，5 g/L MTT、二甲基亚砜、转化生长因子β1 ELISA试剂盒(美国cloud-clone公司)，倒置相差显微镜(德国莱卡公司)，37 ℃细胞培养孵箱(力康生物医疗有限公司)，96孔板(美国CORNING-COSTAR公司)，酶标仪(Thermo公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)。

实验方法：

富血小板纤维蛋白析出液的制备：无菌条件下抽取兔耳中央动脉血5 mL，3 000 r/min离心10 min，即可见到兔血分为3层，上层为贫小血板血浆，底层为红细胞层，中间即为富血小板纤维蛋白凝胶^[23]，见图1。将制备好的富血小板纤维蛋白凝胶置于含5 mL新鲜DMEM培养液的离心管中，将其置于37 ℃孵育箱中静置孵育，分别于7，14，21，28 d时收集富血小板纤维蛋白析出液，在每一个时间点取出析出液后，再于离心管中加入5 mL新鲜的DMEM培养液，以备下一个时间点收集析出液。每个时间点收集析出液后，按照ELISA试剂盒的说明，检测每个时间点析出液中转化生长因子β1的质量浓度，绘制质量浓度曲线。

根据ELISA检测法结果，选择转化生长因子β1在4个时间点的质量浓度最高时的析出液，按照质量守恒定律，在质量浓度最高的析出液原液基础上，分别加入一定量的低糖DMEM培养基稀释原液浓度，制备成质量浓度为50，100，150 ng/L的条件培养基。

兔骨髓间充质干细胞的培养：

抽取骨髓：兔经耳缘静脉缓慢注射麻醉剂戊巴比妥钠 1 mL/kg，常规无菌消毒后，于双侧胫骨近端作骨髓穿刺，穿刺成功后，用含有肝素钠盐水的注射器抽取骨髓4.0-5.0 mL。

骨髓间充质干细胞分离与培养：参照宋明艳等^[24]全骨髓贴壁法进行分离培养。将抽取的骨髓转移至离心管中，以1∶2的比例加入PBS洗涤，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入完全培养基重悬后接种于培养皿中，于37 ℃、体积分数为5% CO₂的孵育箱中培养。24-48 h观察细胞， 48 h进行细胞换液。

骨髓间充质干细胞消化传代：倒置显微镜下观察细胞长满培养皿底80%时开始传代。吸出原培养基，5 mL PBS清洗细胞表面2次，加入1.0-1.5 mL胰蛋白酶消化细胞1.0-2.0 min，显微镜下观察细胞胞质回缩即可终止消化，反复吹打贴壁细胞，形成细胞悬液，将细胞悬液置于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入少量培养基吹打混匀细胞并计数，按比例接种于新的培养皿中，24 h观察细胞生长状况。

富血小板纤维蛋白析出液中细胞因子对骨髓间充质干细胞的影响：使用MTT法检测不同质量浓度的细胞因子对骨髓间充质干细胞的影响。

选取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞(图2)，以每孔5 000个细胞密度接种于96孔板中，加入新鲜培养基，培养于37 ℃、体积分数为5% CO₂的孵育箱中，24 h后观察细胞，细胞长满孔底60%时即可开始MTT实验。

对各组细胞使用无血清的培养基饥饿2 h，按分组将含有不同质量浓度转化生长因子β1的条件培养基加入相应的孔中，使其刺激骨髓间充质干细胞的生长，分别在0，1，2，3 d时加入MTT液，37 ℃下温育4 h，吸去孔内培养基，加入二甲基亚砜150 μL，37 ℃温育10 min，酶标仪490 nm波长下检测吸光度值，记录并绘制曲线。

主要观察指标： ①富血小板纤维蛋白析出液中转化生长因子β1的质量浓度。②不同质量浓度转化生长因子β1培养下骨髓间充质干细胞的增殖情况。

统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。统计学方法选择重复测量方差分析，检验水准为α=0.05，样本用x(_)±s表示。

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讨论

牙齿被拔除后，牙槽骨便会出现吸收，造成牙槽嵴高度下降，宽度变窄。如何加快拔牙窝的愈合及减少牙槽嵴的吸收仍是难以解决的问题^[25]。牙槽骨损伤的修复逐渐开始往组织工程学这一新的途径发展^[26]。骨髓间充质干细胞是Friedenstein等最早发现的一类中胚层来源的干细胞^[27]，其具有高度增殖性、低免疫原性和多向分化性^[28-29]。研究表明，在一定诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以向软骨、骨、脂肪等多种细胞分化，是组织修复的理想细胞来源^[30-31]。王善正等^[32]研究发现，富血小板血浆能够诱导兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化。目前培养骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、流式细胞仪法、全骨髓贴壁筛选分离法与免疫磁珠分离法^[33]。何种条件下，骨髓间充质干细胞增殖并向成软骨细胞分化能力最佳，是目前骨组织工程学研究的方向之一^[34]。本实验依据骨髓间充质干细胞具有贴壁这一特点，采用全骨髓贴壁筛选分离法，在每次传代及换液过程中去除未贴壁的细胞，从而达到纯化骨髓间充质干细胞的目的。有研究证实，在细胞培养的早期阶段，骨髓中各种细胞(如红细胞)的存在对保持骨髓间充质干细胞生长有益^[35]。富血小板纤维蛋白作为新型的生物制剂一直是研究人员讨论的热点。研究发现富血小板纤维蛋白相比于传统的富血小板血浆，其疗效相对稳定，制作方法更为简便^[36]。大量研究发现，富血小板纤维蛋白中含有多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子以及胰岛素样生长因子^[37]。这些生长因子之间发挥着协同作用，对组织的愈合起着良好的促进作用^[38]。相关研究表明，富血小板纤维蛋白可以持续释放生长因子长达28 d^[39-40]。富血小板纤维蛋白中的细胞因子还可通过富血小板纤维蛋白的纤维支架作用，更好的发挥对组织的修复作用，从而被广泛应用于组织修复的临床治疗中^[41-42]。将骨髓间充质干细胞作为种子细胞与富血小板纤维蛋白这一支架材料复合之后移植到创伤部位，是一种修复骨缺损的良好方法^[43]。张卫兵等^[44]学者研究发现较高剂量的富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖作用更为明显。

转化生长因子β1是富血小板纤维蛋白中对骨形成起调节作用的一种重要生长因子，转化生长因子β1可以通过多种途径对骨组织细胞功能起调节作用，它对于前成骨细胞有较强的选择性，可刺激间充质干细胞的增殖与分化。转化生长因子β1具有多重生物学效应，它是间充质干细胞增殖的主要生长因子之一，并且对于多种炎性介质的生物活性起到抑制作用，它还是一种强的免疫抑制剂，基于转化生长因子β1这些特点，使得同种异体细胞移植更为安全^[45]。

本次实验通过检测富血小板纤维蛋白析出液中转化生长因子β1的质量浓度，发现富血小板纤维蛋白析出液中转化生长因子β1释放的规律，即随着时间的增加，转化生长因子β1质量浓度在不断增高，至28 d时达到峰值，且在21-28 d时间段中转化生长因子β1质量浓度迅速增加。通过对骨髓间充质干细胞使用特定条件培养基进行培养，并使用MTT法检测骨髓间充质干细胞的吸光度值，可以得出以下结论：①骨髓间充质干细胞增殖呈现出先降低，再迅速增殖，后进入平缓期的趋势。②条件培养基中转化生长因子β1质量浓度在150 ng/L时对骨髓间充质干细胞的增殖起到最佳的促进作用。③骨髓间充质干细胞在使用条件培养基两三天时增殖最快。

目前，富血小板纤维蛋白已逐渐被应用于口腔的临床治疗当中，其中细胞因子的作用也越来越被专家和学者们关注。转化生长因子β是能诱导软骨新生的一种生长因子，在骨及软骨组织中，以转化生长因子β1的表达为主^[46]。而骨髓间充质干细胞是组织修复的理想来源，转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞的增殖起着促进作用，为拔牙窝牙槽骨的修复提供了新的思路和研究方向。

富血小板纤维蛋白释放转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

Effect of platelet-rich fibrin released transforming growth factor beta 1 on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

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