Let-7d慢病毒载体体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.008

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (41): 6603-6608.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.008

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Let-7d慢病毒载体体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞

徐小隔，张静，龚哲，赵绍云，何霞，王天舒，焦淑洁，滕军放，贾延劼

郑州大学第一附属医院神经内科，河南省郑州市 450052

修回日期:2014-09-02 出版日期:2014-10-01 发布日期:2014-10-01
通讯作者: 贾延劼，博士后，教授，郑州大学第一附属医院神经内科，河南省郑州市 450052
作者简介:徐小隔，女，1988年生，河南省许昌市人，汉族，硕士，主要从事miRNAs在神经系统疾病中的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(骨髓间质干细胞神经命运决定中的自噬现象及其mTOR信号通路的作用/81071114、Lin28/Let-7调控的骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验研究/81371385)

Let-7d lentiviral vector induces the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into neurons in vitro

Xu Xiao-ge, Zhang Jing, Gong Zhe, Zhao Shao-yun, He Xia, Wang Tian-shu, Jiao Shu-jie, Teng Jun-fang, Jia Yan-jie

Department of Neurology, the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China

Revised:2014-09-02 Online:2014-10-01 Published:2014-10-01
Contact: Jia Yan-jie, M.D., Professor, Department of Neurology, the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
About author:Xu Xiao-ge, Master, Department of Neurology, the First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071114, 81371385

摘要/Abstract

摘要：

背景：微小RNA在生命体生长、衰老的过程中起着重要的作用，了解微小RNA let-7d家族成员对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以对干细胞移植起促进作用。

目的：探讨let-7d慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。

方法：①构建大鼠慢病毒载体并感染大鼠骨髓间充质干细胞；实验分为未转染组、阴性对照组(感染空白慢病毒)、转染上调组(感染let-7d-LV)、转染下调组(感染let-7d-inhibition-LV)。②采用法舒地尔诱导转染后大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞，以免疫细胞化学染色检测NSE、MAP-2的表达变化；RT-PCR检测MAP-2 mRNA的表达变化；MTT法检测细胞存活率。

结果与结论：倒置荧光显微镜下观察let-7d慢病毒载体转染成功。法舒地尔可以诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，其中转染上调组的诱导效率与阴性对照组相比升高，NSE、MAP-2表达率上升(P < 0.05)；转染下调组的诱导效率与阴性对照组相比下降，NSE、MAP-2表达率下降(P < 0.05)。结果表明let-7d慢病毒载体可以促进骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化，通过控制let-7d的表达可以影响骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化效率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, let-7d, 法舒地尔, 神经元, 诱导分化, 慢病毒, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: MicroRNA plays an important role in the process of growth and aging of living body. To know the role of let-7d in inducing bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into neurons can promote the stem cell transplantation.

OBJECTIVE: To investigate the role of let-7d in inducing bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into neurons.

METHODS: (1) The lentiviral vector of let-7d was constructed and transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells. The cells were divided into non-transfected group, negative control group (transfected with FU-RNAi-NC-LV), transfected enhancement group (transfected with let-7d-LV), transfected inhibition group ( transfected with let-7d-inhibition-LV). (2) Rat bone marrow mesenchymal stem cells were treated with fasudil as an inducer for triggering the cells to differentiate into neurons. The expression of neuron-specific markers, neuron-specific enolase and microtubule-associated protein 2, were measured by immunocytochemical method. The mRNA expression of microtubule-associated protein 2 was detected by RT-PCR. The viability of bone marrow mesenchymal stem cells was determined by MTT method.
RESULTS AND CONCLUSION: Under inverted fluorescence microscope, the cells were successfully transfected with let-7d. Fasudil induced bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into neurons. The transfection efficiency and expression levels of neuron-specific enolase and microtubule-associated protein 2 in transfected enhancement group were higher than those in the negative control group (P < 0.05); while in the inhibition group, they were lower than those in the negative control group (P < 0.05). These findings indicate that let-7d can promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neurons induced by fasudil, and by controlling the expression of let-7d we can influence the differentiation efficiency from bone marrow mesenchymal stem cells to neurons.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, lentivirus, neurons

中图分类号:

R394.2

徐小隔，张静，龚哲，赵绍云，何霞，王天舒，焦淑洁，滕军放，贾延劼. Let-7d慢病毒载体体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6603-6608.

Xu Xiao-ge, Zhang Jing, Gong Zhe, Zhao Shao-yun, He Xia, Wang Tian-shu, Jiao Shu-jie, Teng Jun-fang, Jia Yan-jie. Let-7d lentiviral vector induces the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into neurons in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(41): 6603-6608.

图/表（结果） 2

2.1 let-7d过表达和抑制慢病毒载体的构建 pFU-GW- iRNA载体经测序结果证明大鼠let-7d慢病毒载体构建成功。经293T细胞包装后，let-7d-LV滴度为6×10⁸ TU/mL，let-7d-inhibition-LV滴度为3×10⁸ TU/mL，空白病毒滴度为8×10⁸ TU/mL。

2.2 let-7d慢病毒载体感染情况 倒置荧光显微镜观察发现，慢病毒载体感染骨髓间充质干细胞2 d后，部分细胞脱落死亡，而且转染5 d时慢病毒载体自身携带的绿色荧光蛋白表达最为理想，随时间延长，荧光减弱(图1)，转染慢病毒载体的各组荧光表达无明显变化。

2.3 MTT法观察细胞存活率 转染前各组骨髓间充质干细胞的MTT结果比较差异无显著性意义(P > 0.05)；转染24 h，转染组细胞存活率显著下降，与未转染组细胞存活率比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，转染各组之间相比细胞存活率差异无显著性意义(P > 0.05)。转染各组转染120 h后细胞存活率虽较24 h有所上升(P < 0.05)，但与未转染组细胞存活率比较差异仍有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 法舒地尔体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞情况 未转染组骨髓间充质干细胞诱导3 h，部分细胞出现神经细胞改变，胞体收缩成圆形，突起细长，有多个分支，部分在局部形成网络。转染上调组诱导后，细胞形态变化更为迅速和显著，诱导3 h后多数细胞胞体收缩成圆形，细胞突起细长，交织成网，形成较典型的神经细胞结构。感染下调组诱导后，细胞形态变化更为缓慢，诱导3 h后少量细胞出现神经细胞改变，胞体收缩呈圆形，未见网络形成(图2)。

2.5 免疫细胞化学染色法观察神经元标记物 转染上调组诱导3 h后，NSE和MAP-2蛋白表达率分别为(92.1± 1.5)%、(89.4±2.5)%，显著高于未转染组[(65.3±1.2)%，(63.7±2.3%)]和阴性对照组[(64.7±2.1)%，(62.9±1.7%)] (P < 0.05)。转染下调组诱导3 h后，NSE和MAP-2蛋白表达率分别为(49.0±1.2)%、(47.0±1.6)%，显著低于未转染组和阴性对照组(P < 0.05)，见图3。

2.6 RT-PCR检测MAP-2的表达 4组分别诱导分化3 h均表达MAP-2 mRNA，未转染组和阴性对照组比差异无显著性意义，转染上调组表达MAP-2 mRNA较未转染组和阴性对照组明显增多，差异有显著性意义(P < 0.05)。转染下调组表达MAP-2 mRNA较未转染组和阴性对照组明显减少，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

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引言

间充质干细胞作为阿尔茨海默病的供体细胞具有几个优势：相对易获取；体外培养能迅速增殖；具有免疫耐受性或免疫无反应性；能长期存活并能与宿主脑内结构相整合；易被稳定转染以及作为基因载体能长期表达外源性基因。但是局部微环境异常严重影响了间充质干细胞移植物的存活、神经分化和迁移。如干细胞生存“巢穴”(niche)中发出的维持干细胞活力的信号，随着年龄增长而丢失，结果导致niche中活跃的干细胞数量下降^[1]，使移植入的间充质干细胞也难以维持长期存活。而且淀粉样前体蛋白信号通路参与干细胞神经分化的调节，高浓度的淀粉样前体蛋白促进干细胞向神经胶质细胞分化，这样会导致移植的干细胞耗竭，分化的神经元相对减少，降低了移植效果。因此，Sugaya等^[2-3]认为，维持脑内淀粉样前体蛋白的正常水平，不仅可以显著减少干细胞的神经胶质分化，而且有助于干细胞移植后的神经新生，是阿尔茨海默病细胞移植治疗的必要条件。为此设想，如果通过调节MicroRNAs (miRNAs)的表达可以改善细胞微环境，促进移植干细胞的存活率，将使阿尔茨海默病的治疗进一步发展。

MicroRNAs在间充质干细胞生物学行为中的重要调控作用逐渐显现。microRNAs可以通过转录水平、转录后水平、表观遗传学水平和异染色质形成等方式调控基因组的表达，参与间充质干细胞重要的生物学进程，包括增殖、分化、信号转导、死亡等^[4-6]。

已经证实Let-7家族成员在脑组织和神经细胞中有表达，并在神经系统中呈现明显的组织表达特异性。如Let-7在小鼠胚胎发育第9.5天出现中枢神经系统表达，并随着神经系统的发育、分化进程表现出上升趋势^[7]。Marson等^[8]对比不同细胞的microRNA表达差异，发现Let-7家族在胚胎干细胞中表达甚微，但是在神经前体细胞中急剧增长，成为主导地位。

Let-7家族在细胞分化过程中极其重要，自然也受到非常严格的调控。Lin28，被认为是大型RNA调控网络枢纽蛋白^[9]，具有靶向性下调Let-7的功能，Lin28介导pre-let-7 的末端尿苷化，从而阻断了Dicer的处理过程及Let-7的成熟。另一方面，Lin28作为Let-7的靶基因，能被Let-7下调，形成了双负反馈的信号通路，即Lin28/Let-7轴^[10-12]。Lin28/Let-7作用广泛，参与调控干细胞发育、分化、凋亡、免疫应答、肿瘤发生及转移等多种生理、病理过程^[13]。本文通过let-7d慢病毒载体的构建来探讨其在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：2014年3至10月在郑州大学第一附属医院医药科学研究院完成。

材料：

实验动物：SPF级SD大鼠2只，雌雄不限，6-8周龄，体质量150-200 g，由郑州大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养：从大鼠股骨和胫骨中分离培养大鼠骨髓间充质干细胞^[14-15]，每3 d换液1次，倒置显微镜动态观察骨髓间充质干细胞生长情况。

let-7d慢病毒载体的构建：根据miR-Base数据库获得let-7d的序列，合成双链DNA oligo和Pfu-GW-iRNA载体，再将双酶切慢病毒载体和克隆好的双链DNA oligo进行连接；构建后的pGC-LV载体与慢病毒包装质粒载体pHelper 1.0、pHelper 2.0通过Lipofectamine 2000共转染至293T包装细胞，产生病毒液并采用孔释法测定滴度。最后将制备好的慢病毒载体放至-80 ℃冰箱冻存备用。

转染复数(multiply of infection，MOI)值测定：取培养6代以上的大鼠骨髓间充质干细胞，以2×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种至24孔板，培养2 d至细胞融合度达到30%-50%，每种慢病毒载体均取MOI值为1，10，20，50，100 5个不同梯度，在完全培养基中加入不同的慢病毒载体上清，以及终质量浓度为5 mg/L的凝聚胺(polybrene)。共感染12 h左右，更换新鲜培养基。感染后每天倒置荧光显微镜下观察各组细胞绿色荧光蛋白表达情况，判断转染效率。结果发现MOI为20时，细胞的荧光表达量最高，细胞存活率最高。

大鼠骨髓间充质干细胞转染及实验分组：取let-7d-LV-inhibition、let-7d-LV、阴性慢病毒以最适MOI值为20转染大鼠骨髓间充质干细胞，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内孵育，根据转染情况将同时点的骨髓间充质干细胞分为4组：未转染组(不转染慢病毒)、转染上调组(转染let-7d-LV)、转染下调组(转染le-7d-inhibition-LV)、阴性对照组(转染阴性慢病毒)。在倒置显微镜下观察荧光表达情况，评价细胞感染效率。

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞：取转染后培养4 d的各组细胞进行诱导实验。去除DMEM完全培养基，PBS洗3次，加入含有法舒地尔(终浓度为200 μmol/L)的完全培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内培养3 h。倒置荧光显微镜下观察细胞诱导情况。

MTT比色法：将转染LV-rno-let-7d、LV-rno-let-7d- inhibition和阴性对照慢病毒前后各时点(转染后24，48，72，96，120，144 h)的骨髓间充质干细胞移入96孔培养板，加入MTT(5.0 g/L)50 μL/孔，置于培养箱孵育4 h，弃上清，加入二甲基亚砜200 μL，采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度，评价细胞存活率。

免疫细胞化学染色法：将各组细胞用PBS洗之后， 40 g/L多聚甲醛固定，于4 ℃过夜，0.2%TritonX-100处理10 min，并用封闭液封闭1 h。然后分别用NSE抗体 (1.0 mg/L)、MAP-2抗体(1.0 mg/L)4 ℃孵育24 h。PBS洗3遍后，用Cy3标记山羊抗兔IgG(1∶500)在室温下进行染色标记，通过显微镜(用×10或×20)摄取细胞图像，每组独立的实验都会采集超过30个区域的细胞，而且，在明视野下所采集的每幅图像都尽量包含相同细胞数目，应用Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件分析各实验组荧光图片单个细胞的累积吸光度值，进行统计学分析。

RT-PCR：采用康为试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。参照oligo试剂盒实验操作说明进行RT-PCR，反转录条件为：室温10 min，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。扩增反应条件为：95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。55个循环。然后取 RT-PCR产物10.0 μL，加上样缓冲液2.0 μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，70 V 40 min，凝胶图像成像系统拍摄保存实验结果，凝胶图像分析系统(GelProAnalyzer 3.0)分析各目的基因与β-actin基因条带吸光度值。

主要观察指标：细胞转染效率，法舒地尔诱导后神经元标记物表达情况。

统计学分析：用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据均采用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。

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讨论

慢病毒基因转导载体包容量大，能感染任何类型的神经细胞，其携带的目的基因可整合到宿主细胞基因组使外源基因获得长期稳定表达，且不编码病毒蛋白，在中枢神经系统中也不会引起免疫反应^[16]。Solomon等^[17]报道Notch信号在Let-7异时通路的上游或平行位置，两者之间存在交叉对话。Zhu等^[18]在研究Lin28/Let-7调节葡萄糖代谢时发现，Let-7能够通过多个环节抑制Insulin-PI3K- mTOR通路，后者参与了干细胞的增殖、神经分化和自噬。此外，部分研究发现，Ras的3'-UTR含有数个Let-7的结合位点，下调Let-7 可以上调Ras蛋白的表达，对Ras-ERK/MAPK通路进行负性调控^[19]。据此，本研究采用CV159载体、pHelper 1.0和pHelper 2.0构建慢病毒载体，建立let-7d体外过表达和抑制模型，并探讨其在间充质干细胞诱导分化为神经细胞中的作用提供依据。

近年来，骨髓间充质干细胞移植作为一种治疗中枢神经系统疾病的方法越来越引起大家的重视，已经有骨髓间充质干细胞治疗多发性硬化^[20-21]、脊髓损伤^[22-23]、青光眼等的报道。海马组织的神经干细胞是TLX敏感型，在成年大鼠中有助于学习和记忆的形成^[24]，然而这些细胞在脑室下区则相对沉默^[25]。TLX在调节成人神经干细胞的维持和自我更新方面起着重要的作用^[26-27]。Zhao等^[28]发现let-7d通过与TLX 3’UTR区结合而减少神经干细胞中TLX的表达水平，从而抑制神经干细胞的增殖，增加神经元分化。

本实验通过采用let-7d过表达和抑制慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞，观察其向神经细胞分化中的作用。结果发现：①慢病毒载体转染细胞后细胞的存活率与未转染组相比显著下降，但阴性转染组以及转染上调组和转染下调组之间细胞存活率无明显差异，因此虽然慢病毒载体可以影响细胞存活率，但是以转染空白慢病毒作为对照，可以实现阴性对照。②盐酸法舒地尔诱导后30 min细胞开始出现胞体收缩，细胞间隙增宽。诱导后120 min，形态变化最为理想，表现为胞体收缩成球形或锥形，折光性增强，部分细胞周围有光晕，有较多长突起，并连接成网状。继续延长诱导时间，神经元样细胞明显增多，但有少量细胞脱落、死亡，其机制为盐酸法舒地尔抑制了Rho激酶的活性，从而导致细胞骨架重建，启动细胞分化的过程，同时通过干扰ROCK信号通路与其他信号传导通路之间本来相对平衡稳定的内环境，关闭或激活下游途径中与细胞分化相关的基因，从而促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化^[29]。③转染上调组中NSE和MAP-2的表达较阴性对照组明显升高，而转染下调组中NSE和MAP-2的表达较阴性对照组下降，说明过表达let-7d的骨髓间充质干细胞与正常的骨髓间充质干细胞相比，在法舒地尔诱导时，更加容易向神经元细胞分化，诱导分化的成功率增加，而抑制let-7d的表达则不利于其向神经元细胞的分化，表明let-7d在骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化中起着重要的作用，干预let-7d的表达可以影响骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。

至于let-7d是通过哪种途径来促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞的分化，需要进一步的研究。体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化的过程涉及多条信号通路，常见的有Notch、Sox、Wnt 等信号通路。通过抑制Notch1后，再进行盐酸法舒地尔的诱导，可以显著提高分化效率高，减少诱导时间、神经元形态典型，轴突及树突细长，NSE、NF-M 表达上调^[30]。通过靶基因检索(mirbase)发现小鼠let-7d的靶基因中包含Notch1以及Notch通路下游基因Hes5等，因此推断let-7d可能通过抑制Notch信号通路来影响骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化，需要进一步的试验来证明。

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