新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞的效果

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.39.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (39): 6316-6322.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.39.015

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新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞的效果

徐振东^1，2，汪国栋¹，刘曦明¹，蔡贤华¹，许建中³

¹解放军广州军区武汉总医院骨科，湖北省武汉市 430070；²湖北中医药大学，湖北省武汉市 430060；³解放军第三军医大学西南医院骨科、全军矫形外科中心，重庆市 400038

出版日期:2014-09-17 发布日期:2014-09-17
通讯作者: 刘曦明，博士，副主任医师，硕士生导师，广州军区武汉总医院骨科，湖北省武汉市 430070
作者简介:徐振东，男，1988年生，土家族，湖北省人，湖北中医药大学在读硕士，主要从事骨创伤与骨组织工程的研究。
基金资助:
国家高技术研究发展计划(863计划)重大攻关课题(2006AA02A122)；湖北省自然科学基金(2008CDB215)；武汉市科技局科研项目(2013060501010160)

Effect of a new-type enriched material on enriching bone marrow stem cells by selective cell retention

Xu Zhen-dong ^{1, 2}, Wang Guo-dong¹, Liu Xi-ming¹, Cai Xian-hua¹, Xu Jian-zhong³

¹Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China; ²Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430060, Hubei Province, China; ³Department of Orthopedics, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

Online:2014-09-17 Published:2014-09-17
Contact: Liu Xi-ming, M.D., Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China
About author:Xu Zhen-dong, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China; Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430060, Hubei Province
Supported by:
the National High Technology and Development Program of China (863 Program), No. 2006AA02A122; Natural Science Foundation of Hubei Province, No. 2008CDB215; Research Project of Wuhan Science and Technology Bureau, No. 2013060501010160

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓干细胞富集材料是目前研究热点，制备并筛选一种新型骨髓干细胞富集材料对于组织工程学发展及临床应用至关重要。
目的：制备并筛选一种骨组织工程新型骨髓干细胞富集材料，应用选择性细胞滞留技术观察其富集骨髓细胞的效果。
方法：用预先制备的人脱钙骨基质与不同体积分数(0.01%，0.05%，0.1%，0.5%，1%)的多聚左旋赖氨酸复合制备多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质材料，应用选择性细胞滞留技术富集骨髓干细胞进行实验。激光显微共聚焦拉曼光谱分析、红外光谱分析鉴定材料成分；三维视频显微镜、扫描电镜观察富集材料孔径、孔隙率、表面及横断面超微结构；对富集前后骨髓有核细胞、纤维母细胞集落形成单位和血小板进行计数分析。
结果与结论：多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质富集材料孔隙率高，孔隙内部有大量孔隙相互连通，材料内外表面有乳白色均匀致密的多聚左旋赖氨酸涂层覆盖，并在天然孔隙内形成更小、孔径较均匀的网孔结构。体积分数0.1%多聚左旋赖氨酸制备的富集材料对人骨髓有核细胞、纤维母细胞集落形成单位和血小板的浓度富集倍数分别为(3.18±0.31)、(5.25±1.40)和(3.88±0.68)倍，相应的黏附率分别达(53±12)%，(73±13)%和(34±10)%，对纤维母细胞集落形成单位的选择率为1.41±0.34。结果证实，实验制备并筛选的经多聚左旋赖氨酸修饰的脱钙骨基质具有天然骨海绵状支架网孔结构，对骨髓细胞的选择性滞留率高，是一种较理想的骨髓干细胞富集材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 人脱钙骨基质, 骨髓干细胞, 多聚左旋赖氨酸, 新型骨髓干细胞富集材料, 选择性细胞滞留技术, 湖北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Enriching material for bone marrow stem cells is a current research hotspot. Preparation and screening of a new type of bone marrow stem cells-enriched material is crucial for the development of tissue engineering and clinical applications.
OBJECTIVE: To observe the surface character and effect of a new type of bone marrow stem cells-enriched material on enriching bone marrow stem cells of decalcified bone matrix decorated with poly-L-lysine by selective cell retention technology.
METHODS: Decalcified bone matrix was decorated with poly-L-lysine as the scaffold material. Bone marrow mesenchymal stem cells were collected by using selective cell retention technology. Control group was decalcified bone matrix and experimental groups were Decalcified bone matrix decorated with poly-L-lysine at different concentrations (0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%) with freeze-drying method. Material components were analyzed by Raman spectrum and infrared spectrum. Pore size, porosity, surface and cross section were observed under three-dimension video microscope and scanning electron microscope. The number of bone marrow nucleated cells, fibroblast colony-forming units and platelets were counted pre- and post-enrichment.
RESULTS AND CONCLUSION: Decalcified bone matrices were covered with well-distributed and dense poly-L-lysine. The poly-L-lysine/decalcified bone matrix had a high porosity with much more internally connected pores. After enrichment with enriched material prepared by 0.1% poly-L-lysine, the number of bone marrow nucleated cells, fibroblast colony-forming units and platelets were increased (3.18±0.31), (5.25±1.40) and (3.88±0.68) times, respectively; the binding efficiency were (53±12)%, (73±13)% and (34±10)%, respectively; the selective rate of fibroblast colony-forming units was 1.41±0.34. The new constructed poly-L-lysine/decalcified bone matrix has good three-dimension space with high selective retention. It is an effective enriching material for bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: tissue engineering, lysine, bone matrix, stents

中图分类号:

R318

徐振东，汪国栋，刘曦明，蔡贤华，许建中. 新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞的效果[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(39): 6316-6322.

Xu Zhen-dong, Wang Guo-dong, Liu Xi-ming, Cai Xian-hua, Xu Jian-zhong. Effect of a new-type enriched material on enriching bone marrow stem cells by selective cell retention[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(39): 6316-6322.

图/表（结果） 2

2.1 新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞拉曼光谱检测结果 3 330 cm^-¹是脱钙骨基质特征性的VN-H(氮氢伸缩振动峰)，1 680 cm^-¹是多聚左旋赖氨酸特征性的酰胺VC=O(碳氧伸缩振动峰)，富集材料同时具备3 330 cm^-¹和1 680 cm^-¹两个峰，表明材料内外表面任一位点由脱钙骨基质和多聚赖氨酸构成，见图1B-a。

2.2 新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞红外光谱检测结果 1 034 cm^-¹是脱钙骨基质的磷酸VP-O(磷氧伸缩振动峰)，1 657 cm^-¹是多聚左旋赖氨酸含酰胺的VC=O(碳氧伸缩振动峰)，故脱钙骨基质+多聚左旋赖氨酸中 1 657 cm^-¹处峰增强，1 034 cm^-¹处峰不变。表明材料整体由脱钙骨基质和多聚赖氨酸构成，见图1B-b。

2.3 新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞孔径、孔隙率、表面及横断面超微结构变化 单纯脱钙骨基质具有透明天然骨海绵状三维网孔结构，孔隙率及孔隙相互连通率高，且孔隙内部有大量小孔隙相互连通.

多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质除上述特点外，还可见材料及孔隙表面有厚度为2-7 μm的乳白色多聚左旋赖氨酸覆盖，且在孔隙中形成更小的，其孔径为20-65 μm的网孔结构。

多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质与脱钙骨基质孔径均在200-500 μm之间分布较多，多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质孔径(412.73±160.29) μm，大部分孔与孔之间有100 μm左右小孔贯通，见图1C。

2.4 新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞中骨髓有核细胞、血小板检测结果 通过SCR技术，骨髓中有核细胞由(9.31±2.07)×10⁹ L^-¹浓缩至(30.28±12.34)×10⁹ L^-¹；血小板由(213±115)×10⁹ L^-¹浓缩至(915±446)×10⁹ L^-¹。与无多聚左旋赖氨酸修饰的脱钙骨基质比较，体积分数0.1%多聚左旋赖氨酸修饰的富集材料对人骨髓有核细胞浓度富集倍数为(3.18±0.31)倍，黏附率达(53±12)%；对人骨髓血小板富集倍数为(3.88±0.68)倍，黏附率达(34±10)%，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。 2.5 新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞中纤维母细胞集落形成单位计数结果 与无多聚左旋赖氨酸修饰的脱钙骨基质比较，体积分数0.1%多聚左旋赖氨酸修饰的富集材料对人骨髓干细胞即纤维母细胞集落形成单位浓度富集倍数为(5.25±1.40)倍，黏附率达(73±13)%(P < 0.05)，选择率达1.41±0.34，具体细胞计数结构见图1D，表1。

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引言

材料方法

设计：随机对照，动物实验。

时间及地点：于2008年1月至2013年7月在解放军第三军医大学西南医院实验中心、广州军区武汉总医院实验中心完成。

材料：

骨髓标本来源：20-40岁健康志愿者，性别不限，用于骨髓标本采集，术前已取得患者及家属的知情同意。

实验方法：

制备骨髓干细胞富集材料多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质：脱钙骨基质参照Maddox等^[11]的方法实验前制备完成，参照刘曦明等制备多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质的方法^[12-13]：无菌条件下，用体积分数0.01%，0.05%，0.1%，0.5%和1%的多聚左旋赖氨酸浸泡脱钙骨基质(脱钙骨基质质量：多聚左旋赖氨酸体积=1 g∶5 mL) 15 h，然后负压抽滤5 h至无气泡溢出，再冷冻干燥48 h后封装，⁶⁰Co-γ射线灭菌，置于-20 ℃冰箱保存。

骨髓标本的采集：健康志愿者取俯卧位，于髂后上棘或椎体，采用无菌标准单孔穿刺骨髓抽吸技术，抽取 60-80 mL肝素化骨髓(含1 mL∶6 250 U肝素钠溶液)，摇匀后过300目滤网以清除骨髓中的脂肪细胞、凝血块与骨屑，振匀备用。

SCR技术快速构建组织工程骨：无菌台上，先用1 mL肝素钠溶液润滑富集器内腔，将多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质称质量后置于CELLECT富集器植骨块放置斗，再注入骨髓(1块脱钙骨基质∶5 mL骨髓)，富集操作5-10 min构建组织工程骨(图1A)；将组织工程骨称质量并计算出其中的骨髓滞留液体积，收集骨髓流出液待测。

有核细胞单细胞悬液的制备：将采集的骨髓加入液和流出液各取2 mL，用淋巴细胞分离液离心2 000 r/min× 20 min分离，取云雾状有核细胞层用PBS 5 mL漂洗，离心1 000 r/min×5 min，弃上清，加入DMEM/F12培养基2 mL反复轻柔吹打制成单细胞悬液，并计数备用。用细胞自动分析仪进行检测。

分组：实验分6组，以单纯脱钙骨基质为对照组，实验组为不同体积分数(0.01%，0.05%，0.1%，0.5%，1%)的多聚左旋赖氨酸通过冷冻干燥方法制备的多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质，再经SCR技术所构建的组织工程骨。

拉曼光谱分析：对材料内外表面任一位点进行成分鉴定，激发光波长为633 nm，频率范围100-600 cm^-¹。分别取脱钙骨基质、多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质材料，用激光显微共聚焦拉曼光谱仪对材料内外表面任一位点进行成分鉴定，激发光波长为633 nm，频率范围100-600 cm^-¹。

红外光谱分析：分别取脱钙骨基质、多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质材料研磨成粉末状后KBr压片法制样，用Nexus型付立叶变换红外光谱仪在4 000-500 cm^-¹间扫描，KBr涂膜制样，对材料整体面进行成分鉴定。

三维视频显微镜、扫描电镜观察：取脱钙骨基质、多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质材料，材料表面真空喷金后，用JSM-5610LV扫描电镜观察孔径、表面及横断面超微结构，孔隙及连通孔情况。取多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质与脱钙骨基质材料HIROXKH-1000型三维视频显微镜动态观察多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质与脱钙骨基质材料三维孔状结构，孔隙均匀度及其相互连通情况。

骨髓有核细胞(nucleated cells，NCs)、血小板(platelets，PLTs)检测：骨髓加入液与骨髓流出液各取1 mL，用细胞自动分析仪检测，得到通过富集器前后骨髓细胞数及其浓度。计算公式如下^[10]：

骨髓加入液中细胞数=骨髓加入液体积×骨髓加入液细胞浓度；

组织工程骨滞留液细胞数=(骨髓加入液-流出液)中细胞数；

组织工程骨滞留液细胞浓度=滞留液细胞数/滞留液体积；

细胞浓度富集倍数α=滞留液细胞浓度/骨髓加入液细胞浓度；

SCR对细胞的黏附率β=滞留液细胞数/骨髓加入液细胞数。

纤维母细胞集落形成单位(fibroblast colony forming unit，CFU-F)计数：参照Hernigou等^[14]的方法，纤维母细胞集落形成单位即指骨髓干细胞，将骨髓加入液及流出液的有核细胞单细胞悬液分别取2×10⁶个细胞接种到25 cm²组织培养瓶中培养10 d，每隔3 d更换培养液，培养10 d时Giemsa染色并在直视及镜下放大40倍进行计数。集落中纤维母细胞数> 50个为1个集落，用每10⁶个骨髓细胞中含有的纤维母细胞集落形成单位的平均数目进行评定。计算公式同上并得到^[10]：

SCR对CFU-F的选择率=CFU-F的黏附率βCFU-F/ NCs的黏附率βNCs。

主要观察指标：材料内外表面任一位点、整体面进行成分鉴定；观察孔径、孔隙率、表面及横断面超微结构；骨髓有核细胞(NCs)、血小板检测结果；纤维母细胞集落形成单位数量。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，应用SPSS 11.0统计学软件进行数据分析，对正态分布数据的均数比较采用单因素方差分析和配对t 检验，对非正态分布的变量采用符号秩和检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

脱钙骨基质是目前为止较为满意的支架材料^[15-16]，是一种修复骨缺损的天然材料，含有多种骨生长因子，其诱导成骨作用早在1965年已被Urist证明^[17]。其天然网孔符合人体正常生理需求，材料可随成骨的进展逐步被降解吸收，而且在降解过程中不产生对成骨有害的酸性代谢产物^[18]；骨髓干细胞可以在脱钙骨基质材料内表面迅速贴壁、扩增，成为骨组织工程种子细胞较为理想的支架材料之一^[19]。但支架材料必须荷载足够数量的种子细胞才能保证所构建的组织工程骨在体内成骨，这要求细胞能高效即时黏附在支架材料上，并能正常增殖和分化。由于细胞对新环境的适应性、细胞与支架亲和力及重力等多方面因素的影响，使得种子细胞与支架材料的黏附率难以提高。如何提高接种效率、改善细胞在支架中分布状况以促进工程化组织成熟是尚未很好解决的技术难题。经多聚赖氨酸修饰后的脱钙骨基质，其结构特性在成骨方面发挥着重要的作用；多聚赖氨酸是由赖氨酸单体构成的多价阳离子聚合体，相对分子质量为30 000-300 000，是免疫组化试验中的常用黏片剂。有学者报道经多聚赖氨酸处理的细胞培养支架、骨组织工程支架表面细胞黏附力大、细胞种植效率高，是良好的表面修饰方法。用多聚赖氨酸包被培养器皿观察其对骨髓干细胞生长的影响，结果显示多聚赖氨酸组细胞贴壁时间明显缩短，细胞伸展较早，原代细胞只需培养七八天即可铺满瓶底，培养4 d即可传1代，而且细胞轮廓清晰、饱满，表明适宜浓度的多聚赖氨酸能促使骨髓干细胞贴壁伸展，使细胞较早进入生长期^[20]。以多聚赖氨酸包埋聚羟基乙酸，发现包埋后的复合材料对细胞吸附性明显增强，且细胞合成基质增多，说明多聚赖氨酸包埋的支架除对细胞有良好的细胞吸附性外，还有促进细胞发挥正常功能的作用^[21]。

实验以多聚赖氨酸修饰脱钙骨基质制作富集材料，拉曼光谱和红外光谱显示两者能均匀混合，三维视频显微镜和扫描电镜表明富集材料不仅具有脱钙骨基质的天然骨海绵状支架网孔结构，而且能在脱钙骨基质孔隙中形成更小的、孔径较均匀的网孔结构。其孔径在100-400 μm之间分布较多，孔隙率60%-80%，大部分孔与孔之间有100 μm左右小孔贯通，大孔可以为骨组织生长提供空间，小孔利于体液交换，加速材料的溶解，连通孔的数量和尺寸则制约骨组织向材料深处生长，孔之间的连通性在成骨方面发挥重要作用。对富集效果的研究显示，骨髓通过富集材料后，滞留骨髓血中有核细胞、血小板和纤维母细胞集落形成单位均明显浓缩，提示多聚左旋赖氨酸可以改善材料的表面活性、促进细胞的黏附与生长。推测多聚左旋赖氨酸增加细胞黏附的机理在于^[22]：①赖氨酸残基固定在材料表面带正电荷，可增强带负电荷细胞的黏附能力。②多聚赖氨酸通过其胺基，与细胞表面的蛋白多糖结合，促进细胞黏附。③在脱钙骨基质孔隙中形成更小的微孔网状结构，增加了表面积，并利于选择一定大小的细胞黏附。④富集器操作使骨髓多次通过材料，通过机械物理作用促进细胞黏附。⑤可以促进细胞发挥正常功能。

多数骨组织工程技术都是采用自体红骨髓作为种子细胞的来源，红骨髓中含大量的成骨前体细胞，在骨折的修复过程中发挥重要作用。自体红骨髓经皮注射在临床治疗骨缺损已取得一定的成功^[23-25]，但局部骨髓干细胞密度低、容易流失，影响其疗效。研究表明，骨髓成骨量及快慢、钙质沉积率与骨髓细胞浓度有关，骨髓浓缩后可增加成骨活性细胞的克隆形成能力^[26]，基于上述的启示，骨髓干细胞富集技术孕育而生，并在骨缺损修复和脊柱融合术中获得了与自体骨移植相接近的效果^[3^，¹⁰^，¹⁴^，^27-28]。

选择性细胞滞留技术是骨髓干细胞富集技术之一^[3^，¹⁰^，²⁷^，^29]，其原理是通过基质材料适当的网孔结构和良好的表面黏附性能，使骨髓流经时选择性滞留利于成骨的干细胞及促成骨因子等成分，从而使其得以富集。骨髓中的间充质干细胞或成骨前体细胞等成骨活性细胞数量很少，尽管利用SCR技术难以将干细胞数提高到构建组织工程骨所接种的间充质干细胞的数量级，但在SCR过程中骨髓会释放如血小板源性生长因子和转化生长因子等促成骨因子，在体内可促进干细胞的增殖与成骨分化；另外富集的骨髓其他干细胞如造血干细胞等，也可通过促进骨修复材料的血管化等而发挥协同作用。因此，SCR技术构建的组织工程骨之所以具有较高的成骨活性，实验设想不单是骨髓干细胞单独的作用，而是多种成骨因素(包括血小板等)协同作用的结果。国外学者相继通过选择性细胞滞留技术促进骨愈合^[5^，¹⁰^，^29]，获得较好结果。

SCR技术的核心在于构建高富集能力的材料, 提高对骨髓有效成骨成分的黏附效果。Muschler等^[10]利用SCR技术将富集骨髓干细胞的脱钙皮质骨粉基质用于促进犬的脊柱融合，富集技术使基质所含的细胞总数增加了2.3倍，干细胞数增加了5.6倍；该组动物脊柱融合评分、融合范围较其他组显著增高。Brodke等^[27]在犬节段性骨缺损模型中，将利用SCR技术制备富集骨髓干细胞和血小板血浆的脱钙骨基质-CC移植到骨缺损区，于16周时获得了与自体骨移植物(髂骨)完全相同的骨愈合率，显著优于单纯脱钙骨基质-CC组及脱钙骨基质-CC+骨髓组，并提出增加骨缺损局部PLT浓度就是增加生长因子浓度，富集血小板血浆可促进成骨。Youssef等^[30]在临床脊柱融合术中应用SCR技术使基质中的干细胞浓度增大(3.6±0.4)倍，有核细胞滞留率(47±12)%，干细胞滞留率为86%，干细胞选择率达1.9±0.5，促进了脊柱融合。实验也显示，与无或较低浓度多聚左旋赖氨酸修饰的脱钙骨基质比较，体积分数0.1%多聚左旋赖氨酸修饰的富集材料对人骨髓有核细胞浓度富集倍数为(3.18±0.31)倍，黏附率达(53±12)%，对血小板富集倍数为(3.88±0.68)倍，黏附率达(34±10)%，对骨髓干细胞即纤维母细胞集落形成单位的浓度富集倍数为(5.25±1.40)倍，黏附率达(73±13)%，选择率达1.41±0.34，材料富集前后骨髓有核细胞、血小板和纤维母细胞集落形成单位的富集倍数和黏附率明显增高，明显增加了骨髓成骨的有效成分，提高了SCR快速构建的组织工程骨的成骨活性，有望获得较佳的成骨效果，这已在近期的动物实验中得到了初步验证。

脱钙骨基质作为一种较理想的生物支架材料^[15-16^，^31-45]，该实验将经多聚赖氨酸修饰的脱钙骨基质与SCR相结合，通过术中的简单操作，基质材料适当的网孔结构和良好的表面黏附性能使骨髓中的干细胞、血小板及成骨因子等选择性保留；更有利于复合材料成骨，且术中即刻构建，无需细胞体外培养和冻存，从而能大大缩短组织工程骨的构建时间，克服了技术与伦理学的困难，可随取随用、安全微创、成本低廉，能较顺利的应用于临床，有较广阔的临床应用前景，可满足创伤、骨病及急诊骨缺损对骨修复治疗技术和骨移植物的需求；总之，多聚左旋赖氨酸-脱钙骨基质材料是一种较理想的骨髓干细胞富集材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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新型骨髓干细胞富集材料富集骨髓细胞的效果

Effect of a new-type enriched material on enriching bone marrow stem cells by selective cell retention

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