三七三醇皂苷与脑缺血耐受对脑自体神经干细胞增殖的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：脑缺血耐受可促进大鼠脑梗死后海马区自体神经干细胞的增殖，但传统中药三七通舒对脑自体神经干细胞增殖的影响还未见报道。
目的：明确中药三七三醇皂苷、缺血预处理与大鼠脑梗死后7 d海马区自体神经干细胞增殖的关系，以及其对大鼠脑梗死后神经行为学评分的影响。
方法：50只SD雄性大鼠随机等分为假手术组、缺血组、预缺血对照组、预缺血组和三七三醇皂苷组，后4组采用改良的Zea-Longa法制备急性脑梗死模型，假手术组仅做颈部手术切口，预缺血组采用二次线栓法建立局灶-局灶性脑缺血耐受的动物模型，缺血对照组利用假手术代替预缺血。三七三醇皂苷组大鼠在造模前 7 d起，每天给予三七三醇皂苷100 mg/kg腹腔注射。
结果与结论：大鼠脑梗死7 d后，缺血组大鼠神经行为学评分和海马区中神经干细胞数量明显增加(P< 0.01)，而与缺血组相比，预缺血组和三七三醇皂苷组大鼠神经行为学评分下降(P < 0.01)，而海马区中神经干细胞数量增加(P < 0.01)，且两组差异无显著性意义(P > 0.05)，而预缺血对照组大鼠神经行为学评分和海马区中神经干细胞数量与缺血组接近(P > 0.05)。提示传统中药三七三醇皂苷可以发挥类缺血耐受作用，改善大鼠脑梗死后的神经功能缺损症状。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 三七三醇皂苷, 脑梗死, 大鼠, 缺血预处理, 缺血耐受, 海马, 自体神经干细胞, 大脑中动脉梗死

Abstract:

BACKGROUND: Cerebral ischemia tolerance can promote proliferation of autologous neural stem cells in the hippocampus of cerebral infarction rats, but panaxtrial saponins effects on the proliferation of autologous neural stem cells in the brain have not been reported.
OBJECTIVE: To explore the relationship of panaxtrial saponins, ischemic preconditioning and proliferation of endogenous neural stem cells in the hippocampus of rats at 7 days after cerebral infarction, and to observe the effect on neurobehavioral scores of rats after cerebral infarction.
METHODS: Fifty Sprague-Dawley rats were included and randomly divided into five groups: sham group, ischemia group, ischemic control group, ischemic preconditioning group, and panaxtrial saponins group. In the latter four groups, acute models of cerebral infarction were established using Zea-Longa method. In the sham group, only an incision was made on the neck. The focal-focal ischemic tolerance models were established with twice suture method in the ischemic preconditioning and panaxtrial saponins groups. Sham operation was instead of ischemic preconditioning in the ischemic control group. In the panaxtrial saponins group, rats were given intraperitoneal injection of 100 mg/kg panaxtrial saponins at 7 days before modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: After 7 days of cerebral infarction, the neurobehavioral score and the number of neural stem cells in the hippocampus were significantly increased in the ischemia group (P < 0.01); compared with the ischemia group, the neurobehavioral scores were lowered in the ischemic preconditioning and panaxtrial saponins groups (P < 0.01), while the number of neural stem cells in the hippocampus was increased (P < 0.01). However, there was no difference between the ischemic preconditioning and panaxtrial saponins groups (P > 0.05). In addition, differences in the neurobehavioral scores and the number of neural stem cells in the hippocampus were insignificant between the ischemic control group and ischemia group (P > 0.05). These findings indicate that panaxtrial saponins can play a role similar to ischemic tolerance, and thus improve neurologic impairment in rats with cerebral infarction.

全文链接：

Key words: panax notoginseng, ginsenosides, brain ischemia, infarction, middle cerebral artery

中图分类号:

R394.2

姜晓锋，张杰文，罗祖明. 三七三醇皂苷与脑缺血耐受对脑自体神经干细胞增殖的作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 6014-6018.

Jiang Xiao-feng, Zhang Jie-wen, Luo Zu-ming. Research about panaxtrial saponins on the relationship between cerebral ischemic tolerance and proliferation of endogenous neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 6014-6018.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] Brott T, Bogousslavsky J. Treatment of acute ischemic stroke. N Engl J Med. 2000;343(10):710-722.
[2] Antoine H, Roger S. Ischemic preconditioning: introduction. Stroke. 2004;35:2675.
[3] Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 1986;74(5):1124-1136.
[4] Kitagawa K, Matsumoto M, Kuwabara K, et al. 'Ischemic tolerance' phenomenon detected in various brain regions. Brain Res. 1991;561(2):203-211.
[5] Dempsey RJ, Sailor KA, Bowen KK, et al. Stroke-induced progenitor cell proliferation in adult spontaneously hypertensive rat brain: effect of exogenous IGF-1 and GDNF. J Neurochem. 2003;87(3):586-597.
[6] 王蘋,毕建忠.三七皂苷治疗脑血管病的研究进展[J].中国老年学杂志, 2006,26(2):275.
[7] 周俊英,刘小利,罗祖明,三七三醇皂苷增进大鼠脑缺血耐受的作用及对GFAP和bFGF表达的影响[J].华西药学杂志,2005,20(6): 489-492.
[8] 中华人民共和国科学技术部.关于善待实验动物的指导意见. 2006-09-30.
[9] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 1989;20(1):84-91.
[10] 郝玉曼,罗祖明,周东.局灶预缺血诱导脑缺血耐受的动物模型[J].中风与神经疾病杂志,2003;20(2):129-131.
[11] Ara J, De Montpellier S. Hypoxic-preconditioning enhances the regenerative capacity of neural stem/progenitors in subventricular zone of newborn piglet brain. Stem Cell Res. 2013;11(2):669-686.
[12] Jin K, Minami M, Lan JQ, et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(8):4710-4715.
[13] Wei L, Fraser JL, Lu ZY, et al. Transplantation of hypoxia preconditioned bone marrow mesenchymal stem cells enhances angiogenesis and neurogenesis after cerebral ischemia in rats. Neurobiol Dis. 2012;46(3):635-645.
[14] Dhodda VK, Sailor KA, Bowen KK, et al. Putative endogenous mediators of preconditioning-induced ischemic tolerance in rat brain identified by genomic and proteomic analysis. J Neurochem. 2004;89(1):73-89.
[15] Hong SJ, Li H, Becker KG, et al. Identification and analysis of plasticity-induced late-response genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(7):2145-2150.
[16] Sun Y, Jin K, Xie L, et al. VEGF-induced neuroprotection, neurogenesis, and angiogenesis after focal cerebral ischemia. J Clin Invest. 2003;111(12):1843-1851.
[17] Türeyen K, Vemuganti R, Bowen KK, et al. EGF and FGF-2 infusion increases post-ischemic neural progenitor cell proliferation in the adult rat brain. Neurosurgery. 2005;57(6): 1254-1263.
[18] Sakata H, Niizuma K, Yoshioka H, et al. Minocycline-preconditioned neural stem cells enhance neuroprotection after ischemic stroke in rats. J Neurosci. 2012;32(10):3462-3473.
[19] Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. N Engl J Med. 1995;333(24):1581-1587.
[20] Dharmasaroja PA, Pattaraarchachai J. Low vs standard dose of recombinant tissue plasminogen activator in treating East Asian patients with acute ischemic stroke. Neurol India. 2011;59(2):180-184.
[21] Cremer S, Berliner Y, Warren D, et al. Successful treatment of pediatric stroke with recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA): a case report and review of the literature. CJEM. 2008;10(6):575-578.
[22] Stemer AB, Huisa BN, Zivin JA. The evolution of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke, including a pooled analysis of NEST-1 and NEST-2. Curr Cardiol Rep. 2010; 12(1): 29-33.
[23] Saver JL. Novel end point analytic techniques and interpreting shifts across the entire range of outcome scales in acute stroke trials. Stroke. 2007;38(11):3055-3062.
[24] Wardlaw JM, Murray V, Berge E, et al. Recombinant tissue plasminogen activator for acute ischaemic stroke: an updated systematic review and meta-analysis. Lancet. 2012;379 (9834): 2364-2372.
[25] Naylor M, Bowen KK, Sailor KA, et al. Preconditioning-induced ischemic tolerance stimulates growth factor expression and neurogenesis in adult rat hippocampus. Neurochem Int. 2005;47(8):565-572.

引言

缺血性脑血管病具有发病率、患病率、致残率、死亡率和复发率高的特点，急性缺血性脑损伤是引起神经功能障碍最常见的原因^[1]，然而目前对它仍旧没有行之有效的治疗手段。近年来，国内外学者对内源性脑保护治疗的兴趣浓厚，其中以脑缺血耐受和脑自体神经干细胞最具代表性^[2]。

脑缺血耐受是指预先给予短暂、非致死性的脑缺血刺激，可提高脑组织对后续较严重缺血的耐受能力。而提前给予短暂的缺血性刺激则称为缺血预处理^[3]。这一现象最早由Murry等^[3]1986年在心肌研究中发现。Kitagawa等^[4]于1991年发现脑组织同样存在缺血耐受现象。

研究发现，在成年哺乳动物的中枢神经系统内广泛存在神经干细胞，而且主要存在于侧脑室的室管膜下区和海马齿状回的颗粒下层，在一定的生理和病理条件下可发生增殖，并可向神经元和胶质细胞分化^[5]。这表明中枢神经系统在受到损伤后具有自我修复、自我更新的潜能。有关脑缺血耐受和脑自体神经干细胞间关系的研究国内外鲜有报道。

近年来，中药在缺血性脑血管病治疗中的作用越来越引起重视。三七为伞形目五加科人参属多年生草本植物，具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效。三七有增加冠状动脉血流量，减慢心率，减少心肌氧消耗的作用，并能对抗因脑垂体后叶素所致的血压升高、冠状动脉收缩的作用；还能能缩短血液凝固时间，有止血作用；且对关节炎有预防和治疗作用。三七通舒胶囊的主要药物成分是三七三醇皂苷，是五加科人参属植物三七的主要有效活性成分, 具有活血化瘀、活络通脉之功效^[6]。研究发现，三七通舒胶囊具有增进SD大鼠缺血耐受作用，其机制可能与上调胶质纤维酸性蛋白、碱性成纤维细胞生长因子的表达有关^[7]。

实验拟采用改进的局灶-局灶性脑缺血耐受大鼠模型，运用免疫荧光方法检测其海马区BrdU标记阳性细胞数量，探索脑缺血耐受、三七三醇皂苷对大脑自体神经干细胞增殖的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2006年1月至2007年3月在四川大学华西医院消化外科实验室完成。

材料：

动物：健康成年清洁级雄性SD大鼠50只，鼠龄三四个月，体质量270-320 g，购自中国医学科学院成都分院动物饲养中心，合格证号：SYXK(川)2006-01，在温度在18- 26 ℃，相对湿度40%-70%，每日光照时间约12 h环境下喂养，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准^[8]。

药物：三七通舒胶囊(200 mg/粒，含三七三醇皂苷 100 mg/粒)(批号：050201)由成都华神集团股份有限公司制药厂提供，将胶囊以生理盐水溶解待用。

方法：

动物分组：采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术组、缺血组、预缺血对照组、预缺血组和三七三醇皂苷组，各10只。

大鼠脑梗死模型的制备：缺血组、预缺血对照组，预缺血组和三七三醇皂苷组大鼠采用改良的Zea-Longa法^[9]制备大脑中动脉梗死模型。

大鼠在造模前12 h禁食不禁水，10%的水合氯醛 (0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位，取颈正中部切口，暴露并钝性分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎颈外动脉远端、颈总动脉近心端，在颈总动脉近分叉处约 5 mm处剪一“V”型小口，将直径约0.235 mm的尼龙线轻轻插入颈总动脉，从颈总动脉分叉处计算，插入18-20 mm时停止，并结扎颈内动脉。遂建立模型。

假手术组大鼠仅行颈部手术切口，钝性分离颈前肌群，暴露出颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。

局灶-局灶性大鼠脑缺血耐受模型的制备：预缺血组大鼠采用作者所在课题组设计的改进的局灶性SD大鼠缺血耐受模型^[10]。栓线采用直径为0.235 mm的单股尼龙鱼线，一端轻轻靠近火焰，形成直径0.25-0.30 mm的光滑小球，再用剪刀将其截成长50 mm，并距头端18 mm处作一标记。乙醇清洁后置于1%肝素钠中备用。

大鼠在术前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，取仰卧位，四肢固定，颈部备皮，常规消毒，铺无菌手术洞巾。取颈部正中切口，钝性分离颈前肌群，暴露出左侧颈总动脉和分叉部，分离动脉分叉处的颈内动脉和颈外动脉，并分别预置3.0丝线备用。

将颈外动脉远心端结扎，近端预置丝线备用。将颈总动脉、颈内动脉的备用线轻轻提拉，以暂时阻断血流。距颈外动脉分叉处约5 mm处剪一“V”形小口，将预先准备好的鱼线，用肝素浸泡后从剪口处插入，轻轻旋转，使鱼线由颈外动脉入口经颈总动脉分叉部进入颈内动脉，向头端深入至分叉以上18-20 mm，直至有阻力时，即阻断大脑中动脉入口处，此时松开颈内动脉的提拉线，应无血流或极少量流出。

结扎颈外动脉近心端，10 min后从颈外动脉轻轻抽出拴线，结扎颈外动脉，形成第1次再灌注。消毒缝合皮肤，形成缺血预处理。3 d后再次麻醉SD大鼠，拆除皮肤缝线，找到颈外动脉的结扎端，重新剪口插线至18- 20 mm，再次造成大脑中动脉阻塞，结扎颈外动脉，将线尾留在皮外，缝合皮肤。2 h后抽出栓线，形成第2次再灌注。

预缺血对照组利用假手术代替预缺血，以普通饲料和自由水喂养。3 d后造成2 h大鼠脑梗死。

药物治疗：三七三醇皂苷组大鼠在造模前7 d起，每天给予三七三醇皂苷100 mg/kg腹腔注射，直至处死当日。

神经行为学评分：采用Zea-Longa评分方法进行评分^[6]，在SD大鼠再灌注后7 d由两位协作者分别盲法进行评分。

Zea-Longa评分标准如下：0分：无神经功能缺损症状；1分：轻度局灶性神经功能缺损(不能完全伸展右前肢)；2分：中度神经功能缺损(向右侧转圈)；3分，重度神经功能缺损(向右侧倾倒)；4分，不能自发行走，意识水平降低。

组织学标本采集：大鼠在处死前1 d予腹腔注射BrdU，共3次，4 h/次，每次50 mg/kg。造模后7 d，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mg/g)重度麻醉，打开胸腔、腹腔，夹闭腹主动脉，剪开右心耳，快速经心尖灌注生理盐水50 mL及 40 g/L多聚甲醛200 mL，整个过程在10-20 min内完成。快速开颅取脑，冠状切取前囟前1.0 mm至前囟后2.0 mm的脑组织，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h。标本经脱水行石蜡包埋，常规制备石蜡切片，片厚约5 μm。切片供免疫荧光染色测定。

免疫荧光染色测量大鼠海马区BrdU标记阳性细胞的数量：取前囟后3-6 mm脑组织，制成5 μm的石蜡切片，常规脱蜡至水；蒸馏水冲洗5 min×2次，PBS清洗30 min；体积分数3% H₂O₂去离子水室温避光孵育15 min，蒸馏水清洗5 min，PBS清洗5 min×2次；0.01 mol/L枸橼酸缓冲液微波中高火15 min；加入正常山羊血清工作液37 ℃孵育20 min，不洗；滴加小鼠抗BrdU 4 ℃过夜；PBS清洗 5 min×3次；滴加FITC标记山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h；PBS清洗5 min×3次；避光粘片，体积分数50%缓冲甘油封固。

每只大鼠的脑组织取2张切片，每张切片在缺血侧海马区随机取5个200倍视野，采用计算机图像分析系统软件(Image-pro plus 4.5)进行测定，计算每mm³阳性细胞数量，取平均值。

主要观察指标：大鼠缺血侧海马区BrdU标记阳性细胞数量。

统计学分析：运用SPSS 11.0统计软件(美国SPSS公司)进行数据分析，数据采用x(_)±s表示；多组数据间的比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett C法，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

实验结果表明，大鼠脑梗死可以引起大鼠海马区齿状回的颗粒下层自体神经干细胞的增殖；大鼠缺血预处理和三七三醇皂苷治疗均可促进大鼠脑梗死后海马区齿状回的颗粒下层自体神经干细胞的增殖，并能改善其神经功能缺损症状。

现已证实，缺血性或创伤性损伤可上调成年哺乳动物的内源性神经干细胞增殖和分化^[11]。急性缺血性脑卒中可以促进海马齿状回的颗粒下层神经干细胞的增殖，这些新生的细胞可以和BrdU结合，BrdU是胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞分裂过程中可进入复制过程的染色体，故可标记正在分裂的细胞^[12]。缺血诱导的神经干细胞增殖已经被证实在7-10 d达高峰，这些新生细胞可以分化，成熟为神经元，并迁移到大脑皮质的颗粒层^[12]。神经干细胞的增殖主要在海马区，这些新生的神经细胞只有很少的一部分可以存活，它们绝大部分在形成突触连接前死亡，表明在成年哺乳动物的大脑存在着一系列的内源性调节机制，是它阻止了巨大的、没有限制的神经元可塑性。

尽管脑缺血耐受的分子机制还没有完全明了，但最近有研究表明，阻断成年大鼠大脑中动脉10 min可激发几种神经保护和可塑性相关基因的表达，并能减小随后的1 h的大脑中动脉梗死所致的梗死体积^[13-15]。研究表明，在受损的脑组织，血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子2、类胰岛素生长因子、胶质细胞源性神经营养因子可以促进脑自体神经干细胞的增殖^[16-18]。由此推断缺血耐受促进脑自体神经干细胞增殖的机制可能与其促使神经生长因子相关。

作者发现三七三醇皂苷可促进脑自体神经干细胞的增殖，改善大鼠脑梗死后神经功能缺损症状。之前作者的研究已经证实三七三醇皂苷还可以有效地减小大鼠脑梗死后的梗死体积。有研究发现三七三醇皂苷具有增强预缺血诱导的脑缺血耐受作用，并上调胶质纤维酸性蛋白、碱性成纤维细胞生长因子的表达^[7]。而这些都有促进神经干细胞增殖、分化为神经元的作用。故推测三七三醇皂苷促进脑自体神经干细胞增殖的机制可能与其能够上调神经生长因子的表达有关。

由此推断缺血预处理促进脑自体神经干细胞增殖的机制可能与其促使神经生长因子相关。而三七三醇皂苷可能也是通过这一机制对脑自体神经干细胞的增殖发生影响的。

众所周知，脑组织对缺血缺氧是极其敏感的，即使是非常短暂的缺血也可使大量的神经元死亡，例如海马CA1区的神经元^[4]。自从重组血栓溶解制剂的问世，使阻塞血管再通并让缺血性脑卒中患者康复成为可能，而且已经被证实在发病3 h以内应用是完全有效的^[19-24]。然而，目前仍旧缺乏有效的手段去保护缺血缺氧的神经细胞。如果神经保护能够得以实现，它必将明显扩展脑缺血的治疗时间窗。于是，广大的神经科学研究者进行了大量的有关脑保护药物的临床试验。但遗憾的是，迄今为止，没有一种药物被证明是成功的。尽管试验设计方案可能是导致失败的一个因素，但试图去发现有效的外源性治疗途径的失败，使得学者们转而开始研究具有脑保护作用的内源性调节因子^[2]。而有关内源性的脑保护作用的研究，最具代表性的就是缺血耐受和神经发生^[25]。

综上所述，传统中药三七三醇皂苷可以发挥类缺血耐受作用，促进脑自体神经干细胞增殖，进而改善大鼠脑梗死后的神经功能缺损症状。