体外培养兔脂肪源性间充质干细胞的成骨成脂分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 6008-6013.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.019

• 脂肪干细胞 adipose-derived stem cells • 上一篇下一篇

体外培养兔脂肪源性间充质干细胞的成骨成脂分化

李受珉¹，吴子征²，王泽¹，李智³，张键¹

1复旦大学附属中山医院骨科，上海市 200032
2上海市第一人民医院宝山分院骨科，上海市 200940
3复旦大学附属中山医院青浦分院骨科，上海市 201700

修回日期:2014-08-04 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
通讯作者: 吴子征，硕士，副主任医师，上海市第一人民医院宝山分院骨科，上海市 200940
作者简介:李受珉，女，1985年生，韩国人，复旦大学在读博士，主要从事组织工程、创伤骨科方面的研究。
基金资助:
上海市卫计委资助项目(2010135)

Osteogenic and adipogenic differentiation of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro

Lee Soo-min¹, Wu Zi-zheng², Wang Zhe¹, Li Zhi³, Zhang Jian¹

1Department of Orthopedics, Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai 200032, China
2Department of Orthopedics, Baoshan Branch, Shanghai First People’s Hospital, Shanghai 200940, China
3Department of Orthopedics, Qingpu Branch, Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai 201700, China

Revised:2014-08-04 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
Contact: Wu Zi-zheng, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Baoshan Branch, Shanghai First People’s Hospital, Shanghai 200940, China
About author:Lee Soo-min, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai 200032, China
Supported by:
the grant from Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning, No. 2010135

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪源性间充质干细胞具有自我更新能力且在体外特定条件下具有多向分化潜能，在临床上具有广泛的应用前景。然而，脂肪源性间充质干细胞的分离培养仍存在诸多困难与不足。
目的：体外分离培养获得兔脂肪源性间充质干细胞，对其形态学、生物学特性进行观察，并鉴定其向成骨、成脂分化的潜能。
方法：切取兔颈背区皮下脂肪，用胶原酶消化法分离兔脂肪源性间充质干细胞，进行体外培养，流式细胞仪检测细胞表面标志物，CCK-8法检测细胞活性并绘制细胞生长曲线。第4代兔脂肪源性间充质干细胞向成脂、成骨诱导分化后进行油红O染色、茜素红染色、碱性磷酸酶染色，观察其成脂、成骨分化潜能。
结果与结论：兔脂肪源性间充质干细胞呈长梭形漩涡样贴壁生长，能稳定传代至第10代，增殖能力强；流式细胞仪检测可高表达CD29、CD90及CD44，而CD34和CD45表达较低；成脂诱导后的兔脂肪源性间充质干细胞油红O染色呈阳性；成骨诱导后的兔脂肪源性间充质干细胞碱性磷酸酶和茜素红染色均呈阳性，以上结果显示实验成功分离培养出兔脂肪源性间充质干细胞，获得的细胞生长稳定，增殖活跃，高表达间充质干细胞的表面抗原以及具有向成骨、成脂等多向分化的潜能，有望为骨组织工程提供理想的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 诱导, 脂肪源性间充质干细胞, 成脂分化, 成骨分化, 表面标志物

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells have the ability to self-renew and have pluripotent potential under specific conditions in vitro, which have broad application prospects in clinical practice. However, isolation and culture of adipose-derived mesenchymal stem cells still appear to have many difficulties and shortcomings.
OBJECTIVE: To isolate and culture rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro in order to study their morphology, cell surface markers and biological properties as well as to investigate the osteogenic and adipogenic potentials of adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro.
METHODS: Primary adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from the subcutaneous adipose tissue of posterior cervical region from New Zealand white rabbits and digested by 0.1% collagenase I. The cells were passaged and amplified by the trypsin digestion. The passage 4 adipose-derived mesenchymal stem cells were induced to differentiate after exposure to adipogenic or osteogenic medium. The oil red O staining, alkaline phosphatase and alizarin red staining were used to detect the results. The cell viability was detected by the cell counting kit 8 method to drawn the growth curve. Cell surface markers were examined using flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: The adipose-derived mesenchymal stem cells isolated from the subcutaneous adipose tissue of rabbits exhibited a fusiform adherent growth in a vortex pattern, and had a strong capability of proliferation that could be passaged stably to the 10th generation. Flow cytometry results showed that the cells highly expressed CD29, CD90, CD44, but lowly expressed CD45 and CD34. After adipogenic induction, the adipose-derived mesenchymal stem cells were positive for oil red O staining; after osteogenic induction, the cells were both positive for alkaline phosphatase and alizarin red staining. These findings suggest that the adipose-derived mesenchymal stem cells were successfully isolated and cultured from the subcutaneous adipose tissue of rabbits, and these cells are pluripotent with the potential to differentiate into adipocytes and osteoblasts, which are expected to be ideal seed cells for bone tissue engineering.

全文链接：

Key words: subcutaneous fat, mesenchymal stem cells, rabbits, adipogenesis

中图分类号:

R394.2

李受珉，吴子征，王泽，李智，张键. 体外培养兔脂肪源性间充质干细胞的成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 6008-6013.

Lee Soo-min, Wu Zi-zheng, Wang Zhe, Li Zhi, Zhang Jian . Osteogenic and adipogenic differentiation of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 6008-6013.

图/表（结果） 3

2.1 兔脂肪源性间充质干细胞的形态学观察 原代细胞4-6 h开始贴壁，24 h内多数已贴壁并开始伸展，细胞呈三角形、短梭形及椭圆形。7-10 d后细胞可达80%-90%单层融合，细胞呈长梭形，可见胞质突起，排列呈漩涡状，此时进行传代。传代后细胞增殖速度加快，细胞形态大小逐渐均一。经过多次传代细胞逐渐纯化，第4代细胞纯度较高，形态均一，呈长梭形，漩涡状排列，细胞仍然保持旺盛的增殖能力(图2)。

2.2 兔脂肪源性间充质干细胞的增殖活性 细胞生长曲线呈“S”型，传代后的3 d内，兔脂肪源性间充质干细胞处于生长适应期，4-7 d为对数生长期，7 d进入平台期，细胞生长开始明显减慢，而不同代数之间的增殖情况未见明显差异(图3)。提示体外培养的兔脂肪源性间充质干细胞具有强大稳定的增殖能力。

2.3 细胞表面标志物 应用流式细胞仪检测发现兔脂肪源性间充质干细胞表面CD29(99.54%)、CD44(99.62%)及CD90(81.12%)强阳性表达，而低表达CD34(2.58%)及CD45(4.98%)(图4)。

2.4 兔脂肪源性间充质干细胞成骨诱导分化 成骨诱导2周后，细胞形态发生变化，呈不规则形态或多角形，细胞体积略增大(图5A)。成骨诱导4周后，茜素红染色见红色矿化结节(图5B)，并进行钙钴法染色测定细胞内碱性磷酸酶的活性，细胞胞质中呈现灰黑色颗粒状或块状沉淀(图5C)。

2.5 兔脂肪源性间充质干细胞成脂诱导分化 脂肪源性间充质干细胞成脂诱导后，细胞体积逐渐变大，胞内产生脂滴(图5D)。成脂诱导2周后油红O染色显示细胞胞质内布满大小不一的红色脂滴颗粒(图5E)。

参考文献

[1] Gregory CA, Prockop DJ, Spees JL.Non-hematopoietic bone marrow stem cells: molecular control of expansion and differentiation.Exp Cell Res. 2005;306(2):330-335.
[2] Dragoo JL, Choi JY, Lieberman JR,et al.Bone induction by BMP-2 transduced stem cells derived from human fat.J Orthop Res. 2003;21(4):622-629.
[3] Nakao N, Nakayama T, Yahata T,et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells facilitate hematopoiesis in vitro and in vivo: advantages over bone marrow-derived mesenchymal stem cells.Am J Pathol. 2010;177(2):547-554.
[4] 王之发,翁雁鸣,刘彦普,等.兔骨髓干细胞和脂肪干细胞增殖和分化能力的比较[J].现代生物医学进展, 2013,13(11):2026-2030.
[5] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H,et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.Tissue Eng. 2001;7(2):211-228.
[6] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.Mol Biol Cell. 2002; 13(12): 4279-4295.
[7] Shigemura N, Okumura M, Mizuno S,et al. Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema.Am J Transplant. 2006; 6(11):2592-2600.
[8] Morizono K, De Ugarte DA, Zhu M,et al. Multilineage cells from adipose tissue as gene delivery vehicles.Hum Gene Ther. 2003;14(1):59-66.
[9] 余方圆,卢世璧,赵斌,等.脂肪干细胞与骨髓干细胞生物学性状的比较[J].中华实验外科杂志, 2009,26(3):396.
[10] 陈亮,吴柏霖,吴明珑,等.解剖部位差异对脂肪干细胞生物学行为及成骨分化能力的影响[J].华中科技大学学报(医学版), 2013, 42(5):564-568.
[11] Toyoda M, Matsubara Y, Lin K,et al. Characterization and comparison of adipose tissue-derived cells from human subcutaneous and omental adipose tissues.Cell Biochem Funct. 2009;27(7):440-447.
[12] 李玲慧,丁道芳,龚浩,等.大鼠腹腔脂肪干细胞的分离培养及诱导成骨[J].中国组织工程研究, 2013,17(23):4232-4239.
[13] Lee RH, Kim B, Choi I,et al.Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue.Cell Physiol Biochem. 2004; 14(4-6):311-324.
[14] 田方.大鼠脂肪来源干细胞的分离、培养及不同诱导液对其细胞状态的影响[D].遵义:遵义医学院, 2012.
[15] 宋小飞,傅强.纯化取材脂肪提高实验中干细胞培养的纯度[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(40):7529-7532.
[16] Rada T, Gomes ME, Reis RL.A novel method for the isolation of subpopulations of rat adipose stem cells with different proliferation and osteogenic differentiation potentials.J Tissue Eng Regen Med. 2011;5(8):655-664.
[17] Rada T, Reis RL, Gomes ME. Novel method for the isolation of adipose stem cells (ASCs).J Tissue Eng Regen Med. 2009; 3(2):158-159.
[18] 李俊宪,孙恒赟,袁捷,等.式细胞仪分选纯化人脂肪干细胞体外成骨活性的实验研究[J].组织工程与重建外科杂志, 2010,6(6): 311-314.
[19] Liu Y, Zhao Y, Zhang X,et al. Flow cytometric cell sorting and in vitro pre-osteoinduction are not requirements for in vivo bone formation by human adipose-derived stromal cells.PLoS One. 2013;8(2):e56002.
[20] Sterodimas A, de Faria J, Nicaretta B,et al.Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs): current and future applications.J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010;63(11): 1886-1892.
[21] De Ugarte DA, Morizono K, Elbarbary A,et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow.Cells Tissues Organs. 2003;174(3):101-109.
[22] Miyazaki M, Zuk PA, Zou J,et al.Comparison of human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for ex vivo gene therapy in rat spinal fusion model.Spine (Phila Pa 1976). 2008;33(8):863-869.
[23] Han C, Zhang L, Song L,et al.Human adipose-derived mesenchymal stem cells: a better cell source for nervous system regeneration.Chin Med J (Engl). 2014;127(2): 329-337.
[24] Gronthos S, Zannettino AC, Hay SJ,et al. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow.J Cell Sci. 2003;116(Pt 9): 1827-1835.
[25] Zhu Y, Liu T, Song K,et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC.Cell Biochem Funct. 2008;26(6):664- 675.
[26] 谢泽飞.不同年龄段、不同取材部位大鼠脂肪间充质干细胞生物学特性的对比研究[D].汕头:汕头大学医学院, 2013.
[27] 毕晓娟,马艳,江明.大鼠腹股沟脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及活体标记[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(14): 2512-2516.
[28] 雷蕙嘉,孙建军,彭本刚,等.大鼠脂肪干细胞的分离培养及鉴定的初步研究[J].中国实验诊断学, 2011,15(8):1245-1248.
[29] Vieira NM, Brandalise V, Zucconi E, et al. Isolation, characterization, and differentiation potential of canine adipose-derived stem cells.Cell Transplant. 2010;19(3): 279-289.
[30] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I,et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.
[31] 方小魁,李光早.种子细胞在骨组织工程中的研究进展[J].中华全科医学, 2012,10(4):608-609.
[32] Zanetti AS, Sabliov C, Gimble JM,et al. Human adipose-derived stem cells and three-dimensional scaffold constructs: a review of the biomaterials and models currently used for bone regeneration.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013;101(1):187-199.

引言

材料方法

设计：细胞学体外培养实验。

时间及地点：实验于2013年9月至2014年3月在复旦大学附属中山医院实验研究中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康新西兰大白兔2只，2月龄，体质量(2.0±0.2) kg，雌雄不限，均购自复旦大学附属中山医院动物实验中心。

试剂：低糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶、青-链霉素(美国Gibco)；Ⅰ型胶原酶、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、牛胰岛素、吲哚美辛、IMBX、二甲基亚砜、油红O(美国Sigma)；茜素红染液(赛业)；碱性磷酸酶染色试剂盒、CCK-8试剂盒(南京凯基)；Anti-rabbit CD90-FITC(英国Abcam)；Anti-human CD34-FITC，CD29-FITC，CD44-PE，Mouse IgG1 K Isotype control FITC，Rat IgG2b K Isotype Control PE，Flow Cytometry staining buffer(eBioscience)；Anti-human CD45-FITC(美国 BioLegend)。

实验方法：

实验用脂肪组织的获取：耳缘静脉注射10 mL空气处死动物。置动物于手术台，术区剪毛，常规消毒，取颈背部正中切口4 cm，取皮下脂肪组织(图1)，并迅速转移至含1%青-链霉素的PBS中。

兔脂肪源性间充质干细胞的分离与培养：在无菌操作台上取出脂肪组织，分离肉眼可见的血管、筋膜(图1C)，用无菌PBS冲洗3遍，用眼科剪将组织剪成糊状(图1D)，加入3倍体积浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶，在37 ℃的摇床上振荡消化40 min。1 200 r/min离心10 min，吸出上层脂肪及上清液，用含有体积分数为10%胎牛血清和1%青-链霉素的低糖DMEM培养液重悬细胞，用200目筛网过滤去除未消化的组织碎片，滤液接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的孵育培养箱进行原代培养。培养48 h后首次换液，去除未贴壁细胞，之后每两三天换液1次，待细胞生长融合至90%时，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化，将细胞以1∶3进行传代培养。在倒置显微镜下观察细胞形态及不同时期的细胞生长情况。

细胞表面标志物的检测：将第4代细胞消化，添加足量PBS，并多次吹打瓶底。将细胞悬液移入15 mL离心管中，于1 500 r/min离心5 min。弃上清液，加PBS重悬细胞，并多次吹打，再次于1 500 r/min离心5 min，弃上清液，PBS重悬细胞，调整细胞浓度至2×10⁹ L^-¹。按0.5 mL/检测管(约1×10⁶个细胞)分装细胞PBS溶液至管A、B、C、D、E和F，每管内添加Flow Cytometry staining buffer 100 μL，管A、B、C和D分别添加5 μL的FITC anti-human CD34、FITC anti-human CD45、FITC anti-human CD29和FITC anti-rabbit CD90，管C再添加5 μL的PE anti-human CD44，管E添加5 μL的Rat IgG2b K Isotype Control PE，管F添加5 μL的FITC mouse IgG1，并置于4 ℃的冰箱孵育。30 min后，每管加1 mL PBS多次吹打，于1 500 r/min离心5 min。弃上清液，重选细胞于500 μL的PBS即流式检测仪检测细胞表型，获取的数据用FlowJo软件分析。

CCK-8检测细胞增殖活性：分别取第3代细胞、第7代细胞和第10代细胞，按1×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于24孔板。每24 h分别加入100 μL CCK-8溶液孵育4 h后，从各孔内吸出混合液100 μL转入96孔板内，用酶联免疫检测仪测定在450 nm处的吸光度，绘制细胞生长曲线。

兔脂肪源性间充质干细胞的成脂诱导：取第4代细胞，加入成脂诱导培养液(含体积分数为10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX和0.2 mmol/L吲哚美辛^[6])进行成脂诱导培养，成脂诱导14 d后进行油红O染色，甘油明胶封固。另设置一对照组，不加入成脂诱导试剂培养。在倒置显微镜下观察两组细胞形态变化。

兔脂肪源性间充质干细胞的成骨诱导：取第4代细胞，加入成骨诱导培养液(含体积分数为10%胎牛血清、 0.1 μmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠^[6])进行成骨诱导培养，成骨诱导14，28 d后分别进行碱性磷酸酶、茜素红染色，甘油明胶封固。另设置一对照组，不加入成骨诱导试剂培养，在倒置显微镜下观察两组细胞形态变化。

主要观察指标：脂肪源性间充质干细胞形态、表面标志物、增殖活性、成骨成脂分化能力。

全文链接：

讨论

本实验的脂肪源性间充质干细胞从皮下脂肪组织中分离获取，有研究证明，皮下脂肪来源的间充质干细胞增殖速率快于肾周脂肪和大网膜脂肪来源的间充质干细胞，且皮下脂肪来源的原代细胞纯度较高^[10-11]，然而解剖研究发现兔皮下脂肪较少，在颈背区和腹股沟区皮下脂肪相对较多。由于腹股沟区属于污染区域，而且此处脂肪组织周围血管和淋巴结等组织相结合紧密，提取的细胞往往混杂了内皮、血、淋巴细胞等大量杂质^[12]，手术操作较颈背区不方便，因此采取颈背区皮下脂肪组织。自从Zuk等^[5]首先从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中分离得到多能干细胞以来，有些学者将分离脂肪源性间充质干细胞的方法进行修改，关于如何去除混杂的红细胞，可以通过加NH₄Cl红细胞裂解液的方式，但裂解液中的NH₄Cl对脂肪源性间充质干细胞有损伤，必须通过反复离心来去除。因此Lee等^[13]通过仔细去除血管，反复冲洗以及换液来清除混杂的红细胞，故可省去加NH₄Cl的步骤。田方^[14]研究发现，脂肪碎块的残留易导致脂肪源性间充质干细胞向脂肪细胞分化，筛网过滤能有效去除脂肪碎块，原代细胞贴壁均匀，显示较高的细胞纯度，所以本实验分离原代脂肪源性间充质干细胞也是使用筛网过滤这种方法。

目前最常用的干细胞纯化方法是细胞外基质差速贴壁培养法，是利用干细胞较其他细胞具有贴壁早、黏附力强的特点，通过在培养早期换液的方法纯化干细胞^[15]。本研究也采用该方法，传代的细胞24 h首次换液，弃去未贴壁的细胞。第4代细胞传代后24 h内，细胞基本完全贴壁，基本上未观察到悬浮的细胞。且第4代细胞进行流式细胞仪检测细胞表面标志物，间充质干细胞特异性标志物阳性率较高(CD44 99.62%、CD29 99.54%以及CD90 81.12%)，表明细胞传代至第4代后，细胞纯度较高。

为了进行稳定培养及纯化干细胞，还能利用细胞表面抗原的特异性分选细胞，主要有磁珠分选法和流式细胞仪分选法，磁珠分选原理是将特异的单克隆抗体与免疫磁珠连接，与细胞结合后置于磁场的过滤柱将其吸附，去掉磁场后得到纯化的细胞^[16-17]。流式细胞仪分选法的原理是利用待分选细胞结合荧光素标记抗体能力的差异或者利用外排荧光染料性质的差异，有研究证明采用CD105作为表面标志流式细胞分选出纯度高、增殖活性较强以及向成骨分化能力强的脂肪源性间充质干细胞^[18]。但是，目前还未完全确定脂肪源性间充质干细胞的特异性表面标志，有研究证明，通过流式细胞仪分选法分离的脂肪源性间充质干细胞与未经分选的脂肪源性间充质干细胞间的成骨分化能力差异无显著性意义^[19]，且由于采用流式细胞分选对细胞损伤较大，限制了其应用。通过各种方法分离获得的脂肪源性间充质干细胞，细胞呈成纤维细胞样形态，胞质内未见到脂肪细胞样的脂滴，研究中通常使用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM细胞培养基进行培养，在标准细胞培养瓶上待其贴壁生长后，运用胰酶消化法传代扩增^[20]。

很多研究已证明，脂肪源性间充质干细胞具有多向分化潜能^[6,21-23]，在体外特定的诱导条件下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞及神经细胞等多种细胞类型分化。并被认为它是比骨髓间充质干细胞更有前途的骨组织工程的种子细胞。本实验采用细胞完全培养基中加入低浓度地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和L-谷氨酰胺组成的混合液来诱导脂肪源性间充质干细胞向成骨细胞分化。诱导的脂肪源性间充质干细胞形态上表现出成骨细胞的特征。并且应用碱性磷酸酶染色以及茜素红染色鉴定，结果显示其具有成骨细胞的标志性特征。

Gronthos等^[24]研究发现，脂肪源性间充质干细胞与骨髓间充质干细胞之间存在非常相似的表面抗原标志，未分化的脂肪源性间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均能表达CD105、CD29、CD90、CD73、CD166、CD44、CD49e和CD49b，而不表达CD14、CD34、CD45、CD133、CD31、CD38和HLA-DR。只有CD106在两种细胞表面表达情况相反，骨髓间充质干细胞是CD106阳性，而脂肪源性间充质干细胞是阴性。其中，CD29在血管发育过程中起重要作用，CD44在新生细胞外基质生成过程中起重要作用。脂肪源性间充质干细胞不表达或低表达HLA-DR，提示脂肪源性间充质干细胞具有可用于异体移植的潜能^[13,25]。通常的研究中采用多种表面标志联合鉴定的方法鉴定间充质干细胞。本实验采用胶原酶消化及贴壁筛选获取兔脂肪源性间充质干细胞，流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CD45和CD90，其结果显示兔脂肪源性间充质干细胞高表达间充质干细胞的表面标志CD29，CD44，CD90，而低表达造血干细胞的表面标志CD34和白细胞表面抗原CD45，与Zuk等^[5]报道的人脂肪源性间充质干细胞表面标志一致，与大鼠和犬等其他动物的脂肪源性间充质干细胞表面标志也一致^[26-29]，提示实验所获得的脂肪源性间充质干细胞纯度较高，是一种区别于造血干细胞的另外一群处于未分化状态的非定向干细胞，并非血液循环中的细胞。表面抗原标记的检测对鉴定干细胞具有非常重要的作用，目前研究者们公认尚没有间充质干细胞的特异性表面抗原标志，主要是通过细胞形态、表型及多向分化潜能来进行综合鉴定。本实验体外分离培养的兔脂肪源性间充质干细胞贴壁生长、高表达间充质干细胞的表面标志以及具有多向分化的潜能，符合国际细胞治疗协会颁布的间充质干细胞定义标准^[30]。本研究体外成功分离培养兔脂肪源性间充质干细胞，取材容易，增殖能力强，并且明确了成骨分化的诱导条件，具有良好的成骨诱导活性，这些符合对种子细胞的要求^[31-32]，从而有望为骨组织工程提供理想的种子细胞。

结论：来源于兔颈背区皮下脂肪组织取材相对容易且组织量大，组织内细胞量充足，可简单体外分离培养；兔脂肪源性间充质干细胞在体外增殖速度快，能够稳定传代至第10代；具有分化成骨、成脂等多向分化的潜能，是组织工程骨理想的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

体外培养兔脂肪源性间充质干细胞的成骨成脂分化

Osteogenic and adipogenic differentiation of rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[5]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[6]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[7]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[8]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[9]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[10]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[11]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[12]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[13]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[14]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[15]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.