不同培养条件下脂肪干细胞与成骨细胞的共培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：成骨细胞与骨髓干细胞共培养后可以诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化，成骨细胞与脂肪干细胞共培养是否也能诱导向成骨细胞分化呢？
目的：观察脂肪干细胞与成骨细胞共培养后能否向成骨细胞分化。
方法：分离新西兰大白兔脂肪干细胞和成骨细胞，待脂肪干细胞生长至3代，成骨细胞生长至2代时，进行共培养。根据培养时血清浓度不同分为10%胎牛血清共培养组和5%胎牛血清共培养组，共培养14 d。
结果与结论：共培养7 d后，2组脂肪干细胞均出现部分变圆。14 d后，脂肪干细胞高度分化与成熟成骨细胞相似，碱性磷酸酶染色阳性、茜素红染色阳性，其Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达均增高，以10%胎牛血清培养组更为明显。提示脂肪干细胞与成骨细胞经过共培养后可以向成骨细胞分化，高浓度血清培养可以促进诱导作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 成骨分化, 共培养, 细胞培养, 胎牛血清

Abstract:

BACKGROUND: After co-culture with osteoblasts, bone marrow stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts. Whether adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts or not?
OBJECTIVE: To observe whether adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts.
METHODS: Adipose-derived stem cells and osteoblasts were isolated from New Zealand white rabbits. Then, passage 3 adipose-derived stem cells were co-cultured with passage 2 osteoblasts in 10% or 5% fetal bovine serum for 14 days.
RESULTS AND CONCLUSION: After 7 days of co-culture, some adipose-derived stem cells became round in the two groups. After 14 days of co-culture, adipose-derived stem cells highly differentiated and differentiated cells were similar to mature osteoblasts that were positive for alkaline phosphatase staining and alizarin red staining. The mRNA expression of type I collagen and osteocalcin increased in both two group, especially in the 10% fetal bovine serum group. These findings indicate that adipose-derived stem cells co-cultured with osteoblasts can differentiate into osteoblasts induced by high-concentration serum culture.

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Key words: adipocytes, osteoblasts, cell differentiation, cell culture techniques

中图分类号:

R394.2

张扬，刘大诚，杨效宁. 不同培养条件下脂肪干细胞与成骨细胞的共培养[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 6003-6007.

Zhang Yang, Liu Da-cheng, Yang Xiao-ning. Co-culture of adipose-derived stem cells and osteoblasts under different conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 6003-6007.

图/表（结果） 2

2.1 分离培养的脂肪干细胞 首次分离的细胞形态呈小圆形，培养24 h后开始贴壁，未贴壁细胞为椭圆形红细胞，大部分贴壁细胞呈梭形、多角形，细胞首次换液后，未贴壁细胞被去除。随培养时间的延长，细胞数量增多，形态为典型的长梭形，呈集落式、团簇状生长。细胞融合达80%-90%。3代细胞呈“漩涡状”生长，并能长期稳定培养(图1A，B)。免疫荧光染色法检测显示，细胞表面抗原CD44呈阳性表明这种细胞为间充质干细胞；而CD45呈阴性证明所检测细胞并非来源于血液循环中的干细胞(图1C，D)。综上可以初步鉴定所分离的细胞为脂肪干细胞。

2.2 共培养后的脂肪干细胞的形态学变化 细胞共培养 7 d后，部分脂肪干细胞变成多角形、圆形及不规则形状，增殖速度减慢，其中以10%胎牛血清组改变最为明显(图2A，B)。共培养14 d后，10%胎牛血清共培养组脂肪干细胞形态学表现与成骨细胞最为接近，5%胎牛血清共培养组也有成骨细胞形态，但是细胞有老化表现(图2C，D)。

2.3 成骨细胞分化后脂肪干细胞的碱性磷酸酶染色及茜素红染色鉴定 成骨诱导14 d时，2组细胞碱性磷酸酶染色均为阳性，倒置相差显微镜下可见大量细胞核为深蓝色，胞浆为蓝黑色，但10%胎牛血清共培养组的阳性细胞数量明显较5%胎牛血清共培养组多。成骨诱导14 d时，2组细胞茜素红染色均呈阳性，镜下可见10%胎牛血清共培养组细胞中钙结节明显较5%胎牛血清共培养组多且体积大(图3，表1)。

2.4 脂肪干细胞成骨分化后I型胶原和骨钙素mRNA的表达 反转录PCR检测显示，成骨诱导7，14 d后，2组细胞均检测到Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达，且从灰度上观察两组表达均随时间越来越强，从组别来看实验组改变更为明显，从表达产物上观察Ⅰ型胶原mRNA的表达更丰富，从同一时间点观察实验组Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达均强于对照组(图4)。

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学对比观察。

时间及地点：于2012年7月至2013年1月在徐州医学院附属医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：3月龄清洁级健康新西兰大白兔2只，雌雄不拘，体质量2.5-3.5 kg，由徐州医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK(苏)2005-0005，实验过程中对动物的处置符合2006年科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定^[6]。

方法：

兔脂肪间充质干细胞的获取：以2 mL/kg的10%水合氯醛麻醉兔，取腹股沟区，暴露腹股沟脂肪垫，并完整取出。清除包膜、结缔组织和小血管，PBS清洗去除红细胞。眼科剪将组织剪成1.0-2.0 mm³组织块，加入3-5倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃消化60 min后，加入等体积含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基终止消化，过滤收集滤液，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬浮细胞，将细胞收集并调整浓度为1×10⁹ L^-¹接种至含培养基培养瓶中。置于饱和湿度恒温培养箱培养24 h换液。以后每3 d换液1次，于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，待细胞生长融合达80%-90%后进行纯化并首次传代^[7-8]。

兔脂肪干细胞的鉴定：取第3代细胞以1×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于预置盖玻片的6孔板，每孔加入1.5 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度恒温培养箱培养至细胞达80%-90%融合。用预温的PBS洗3次，每次5 min；40 g/L多聚甲醛固定30 min；PBS洗3次，每次5 min；0.2%Triton X-100透化2-5 min；PBS洗3次，每次5 min；体积分数5%山羊封闭血清并室温孵育30 min，弃封闭液；加入鼠抗兔CD44，CD45抗体反应液，4 ℃孵育过夜；弃一抗，PBS洗3次，每次5 min；加入FITC荧光素标记的二抗37 ℃避光孵育30 min；PBS洗3次，每次5 min；95%甘油封固，荧光显微镜下观察染色情况^[9-10]。

兔成骨细胞的提取、培养及传代：2 mL/kg的10%水合氯醛经耳缘静脉注射麻醉新西兰白兔，分离颅骨，清除杂质、骨膜、结缔组织及血管，PBS冲洗3次，将颅骨剪成1 mm×1 mm大小，加入0.25%胰酶，37 ℃水浴消化，震荡，15 min后弃消化液，加入5 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶，37 ℃水浴中消化并震荡，40 min后弃消化液，PBS冲洗3次，将骨粒放入25 cm²培养瓶中，加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱内培养。待成骨细胞部分贴壁，用PBS轻轻吹打清洗2次，去掉不贴壁的杂质细胞，加入完全培养基培养。每3 d换液1次。第6天清除骨片，继续培养。待细胞已铺满瓶底达80%以上，进行传代培养。

成骨细胞与脂肪干细胞共培养：将脂肪干细胞与成骨细胞以1∶1的比例混合，细胞接种终浓度为5.0×10¹⁰ L^-¹，分别种植于6孔板和25 mL培养瓶中。将细胞分为10%和5%胎牛血清共培养组。2组均每2 d换液1次，倒置相差显微镜下观察脂肪干细胞形态变化。分别于培养7和14 d后，胰酶终止消化，将共培养诱导后的脂肪干细胞种植于培养瓶和培养皿中以便爬片和提取RNA。

碱性磷酸酶染色：诱导14 d后分别取出2组6孔板中盖玻片。分别于诱导7，14，21，28 d时取出两组细胞，每组4孔，离心收集细胞至96孔板，加入0.2 mL 1%的TritonX-100于4 ℃过夜，然后按照碱性磷酸酶测试盒说明书进行操作。

茜素红染色：诱导14 d后分别取2组6孔板中盖玻片，用40 g/L多聚甲醛固定 30 min，PBS漂洗后加入2%茜素红染色液1 mL，室温孵育20 min，倒置相差显微镜下观察。

反转录PCR检测细胞中I型胶原和骨钙素mRNA的表达：于成骨诱导7，14 d终止培养，先用55 mmol/L柠檬酸钠溶解复合载体，经离心后收集所有细胞，Trizol试剂进行细胞裂解，提取细胞总RNA并进行纯度鉴定，用RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，最后进行PCR扩增。

PCR条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s， 52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行30个循环，再72 ℃延伸10 min。PCR产物经电泳、DNA吸光度扫描检测，与β-actin内参条带的比值为mRNA表达水平参数。

主要观察指标：①脂肪干细胞形态变化。②脂肪干细胞与成骨细胞共培养后形态。③脂肪干细胞成骨诱导分化。④观察诱导后7，14 d细胞中骨钙素及Ⅰ型胶原酶mRNA的表达。⑤成骨细胞碱性磷酸酶活性。

统计学分析：应用SPSS 13.0软件分析。数据以x(_)±s表示，两组比较采用配对样本t 检验和单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨缺损修复的传统治疗方法包括自体骨、异体骨及人工骨移植等，均取得了一定的疗效。但因自体骨来源不足，额外取骨会给患者带来痛苦；异体骨和人工骨具有抗原性，免疫排斥反应会导致重建失败，以及存在交叉感染、病毒传染等风险使其应用受限^[11]。随着骨组织工程学发展，也为骨缺损的修复重建提供了新思路。骨组织工程采用组织工程学的原理与方法来研制具有修复骨缺损、促进骨再生能力的骨替代物，所得到的组织工程骨能够避免传统治疗的缺点，具有良好的生物相容性、足够的机械性能以及生物稳定性，利用骨组织工程培养的人工骨不仅可修复大面积的骨缺损，而且可按需塑形及大量制备，是一种理想的创伤修复及功能重建的材料，近年来取得了显著的发展，但仍然没有一种结构、性能均理想的、成熟的骨替代物被研制出来。组织工程骨、转基因工程骨等修复骨缺损研究也取得了一定进展^[2-4,12]。目前骨组织工程研究最多的种子细胞就是骨髓干细胞，但骨髓干细胞取材受到限制，不能满足实验研究及临床应用的需要。脂肪干细胞同骨髓干细胞一样起源于中胚层，因此有学者假设脂肪干细胞是否与骨髓干细胞同样存在具有多向分化潜能。而作为新型的种子细胞脂肪干细胞的生物学特性与骨髓间充质干细胞相似^[13]。Zuk等^[14]在2001年从人脂肪组织中获取了有多向分化潜能的基质干细胞，认为它可以向成骨细胞、软骨细胞、及成纤维细胞分化的能力。此外脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞相比具有以下优点：①来源丰富，取材方便，损伤小。②细胞贴壁能力强，易于体外培养。③培养条件简单，体外扩增快。④干细胞含量丰富，获取效率高。⑤细胞表型稳定、衰老缓慢，高增殖活性。⑥不涉及伦理道德问题^[15]。因此，脂肪干细胞很有可能替代骨髓间充质干细胞而成为新的组织工程种子细胞来源。组织工程技术主要包括种子细胞、诱导因子和支架载体。脂肪干细胞已经成为新型的种子细胞。目前已成为骨、软骨组织工程研究的焦点。共培养的方法的优点就是在没有诱导因子的条件下，使脂肪干细胞向成骨细胞分化，这种方法可能更为经济有效。

实验中采用免疫荧光染色法检测脂肪干细胞表面分子显示，细胞表面抗原CD44呈阳性，表明这种细胞为间充质干细胞；而CD45呈阴性，证明所检测细胞并非来源于血液循环中的干细胞。综上可以初步鉴定所分离的细胞为脂肪干细胞。成骨细胞的主要功能是合成、分泌骨基质并促进骨基质矿化形成骨组织。钙离子在成骨细胞分泌的碱性磷酸酶作用下沉积在胶原上，完成基质的矿化过程，因此，目前将碱性磷酸酶的检测作为成骨细胞鉴定和评价其功能状态的主要指标。共培养诱导14 d后两组细胞的碱性磷酸酶、钙化结节染色均阳性，通过对诱导7-28 d的碱性磷酸酶浓度和钙离子浓度变化进行分析发现，碱性磷酸酶7-14 d递增，此后逐步下降；而钙离子7-28 d成递增趋势；且降钙素基因相关肽诱导组均显著高于对照组。与对照组相比，实验组钙化结节数量多、体积大。实验组诱导7，14 d成骨细胞标志性蛋白Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达的反转录PCR检测结果均强于对照组，由此证明实现了脂肪干细胞向成骨细胞的诱导分化，同时也说明成骨细胞具有促进脂肪干细胞向成骨细胞分化的作用。细胞外基质的钙化是成骨细胞分化晚期的特征性标志。在体外培养条件下，成骨细胞产生钙化是鉴定成骨细胞的重要依据。茜素红是体外观察钙结节形成的主要方法，其能与结节中的钙离子鳌合，显示钙沉积的部位。碱性磷酸酶的表达与成骨细胞的分化、成熟呈正相关。Ⅰ型胶原是构成骨基质的主要成分之一，能通过蛋白激酶使靶蛋白磷酸化，增加细胞蛋白质的合成，另外可活化Na⁺/H⁺交换系统，促进成骨细胞的粘附、增殖和分化，并可促进新骨形成^[16-17]。骨钙素由成骨细胞合成并分泌，是反映成骨细胞活性的特异而敏感的标志物。有研究发现骨钙素提高了糖类代谢，可能是导致骨修复是一个高能量的过程的原因^[18]。

综上所述，本实验虽在体外成功利用成骨细胞与脂肪干细胞共培养诱导兔脂肪干细胞向成骨细胞分化，但诱导后的成骨细胞能否在支架载体上进行良好的生长，能否在体内进行培养，还有待进一步开展其在修复骨缺损方面的动物实验研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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