分阶段添加细胞诱导因子诱导豚鼠脂肪间充质干细胞定向分化内耳毛细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5998-6002.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.017

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分阶段添加细胞诱导因子诱导豚鼠脂肪间充质干细胞定向分化内耳毛细胞

王晓燕¹，李兵兵²，张恩峰³，毕晓娟³，刘立中⁴

新疆医科大学第一附属医院，¹耳鼻咽喉科，³医学研究中心，⁴干部保健特诊科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²莆田市第一医院骨科，福建省莆田市 351100

修回日期:2014-08-17 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
通讯作者: 刘立中，博士，主任医师，新疆医科大学第一附属医院干部保健特诊科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:王晓燕，女，1985年生，甘肃省张掖市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事耳科组织工程与干细胞治疗方面的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2011211A060)

Adipose-derived mesenchymal stem cells differentiate into inner ear hair cells in guinea pigs induced by progressive addition of cytokines

Wang Xiao-yan¹, Li Bing-bing², Zhang En-feng³, Bi Xiao-juan³, Liu Li-zhong⁴

¹Department of Otorhinolaryngology, ³Medical Research Center, ⁴Department of Cadre, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Orthopedics, First Hospital of Putian, Putian 351100, Fujian Province, China

Revised:2014-08-17 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
Contact: Liu Li-zhong, M.D., Chief physician, Department of Cadre, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wang Xiao-yan, Studying for master’s degree, Department of Otorhinolaryngology, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211A060

摘要/Abstract

摘要：

背景：感音神经性耳聋主要是由内耳毛细胞的缺失或受损造成，用脂肪间充质干细胞来再生修复内耳毛细胞是治疗听力损失的有效方法。
目的：探讨体外定向诱导豚鼠脂肪间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的可行性。
方法：体外分离培养豚鼠脂肪间充质干细胞至第3代，流式细胞仪检测细胞免疫表型，分阶段加入表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、全反式维甲酸、脑源性神经营养因子、神经营养因子3，观察诱导分化的效果。
结果与结论：豚鼠脂肪间充质干细胞体外培养呈梭形，漩涡状贴壁生长，第3代细胞表面标记CD29与CD44表达呈现阳性，CD34与CD45表达呈现阴性。应用细胞因子诱导后细胞早期nestin和GFAP表达阳性，继续诱导10 d后表达毛细胞特异性标记物MyosinⅦa和Math1，说明细胞因子可定向诱导豚鼠脂肪间充质干细胞向内耳毛细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 毛细胞, 脂肪间充质干细胞, 豚鼠, 细胞因子, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Sensorineural hearing loss is mainly caused by missing or damaged hair cells in the inner ear. Application of adipose-derived mesenchymal stem cells to regenerate inner ear hair cells is an effective treatment for hearing loss.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of in vitro inducing adipose-derived mesenchymal stem cells to differentiate into inner ear hair cell-like cells in guinea pigs.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells from guinea pigs were isolated and cultured to the 3rd generation. Cell phenotype was detected using flow cytometry. Cytokines were added for induction and differentiation by stages, including epidermal growth factor, basic fibroblast growth factor, insulin-like growth factor-1, all-trans retinoic acid, brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin 3.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived mesenchymal stem cells of guinea pigs cultured in vitro were fusiform and showed a swirled adherent growth. Passage 3 cells were positive for CDCD29 and CD44, but negative for CD34 and CD45. After induction, the cells were positive for nestin and GFAP positive at early stage;after 10-day continuous induction, the cells expressed Myosin VIIa and Math1, specific markers of hair cells, indicating that cytokines can directly induce adipose-derived mesenchymal stem cells to differentiating into inner ear hair cells in guinea pigs.

全文链接：

Key words: adipose tissue, mesenchymal stem cells, guinea pigs, hair cells, auditory, cytokines

中图分类号:

R394.2

王晓燕，李兵兵，张恩峰，毕晓娟，刘立中. 分阶段添加细胞诱导因子诱导豚鼠脂肪间充质干细胞定向分化内耳毛细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5998-6002.

Wang Xiao-yan, Li Bing-bing, Zhang En-feng, Bi Xiao-juan, Liu Li-zhong . Adipose-derived mesenchymal stem cells differentiate into inner ear hair cells in guinea pigs induced by progressive addition of cytokines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5998-6002.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Stucky SR, Wolf KE, Kuo T.The economic effect of age-related hearing loss: national, state, and local estimates, 2002 and 2030.J Am Geriatr Soc. 2010;58(3): 618-619.
[2] Turner CW, Gantz BJ, Karsten S,et al.Impact of hair cell preservation in cochlear implantation: combined electric and acoustic hearing.Otol Neurotol. 2010;31(8):1227-1232.
[3] Koehler KR, Mikosz AM, Molosh AI,et al.Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 2013;500(7461):217-221.
[4] Fu Y, Wang S, Liu Y,et al.Study on neural stem cell transplantation into natural rat cochlea via round window.Am J Otolaryngol. 2009;30(1):8-16.
[5] Durán Alonso MB, Feijoo-Redondo A, Conde de Felipe M,et al. Generation of inner ear sensory cells from bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.Regen Med. 2012;7(6):769-783.
[6] Du D, Lou X.Generation of induced pluripotent stem cells from neonatal mouse cochlear cells.Differentiation. 2014; 87(3-4):127-133.
[7] Pauley S, Kopecky B, Beisel K, et al. Stem cells and molecular strategies to restore hearing.Panminerva Med. 2008;50(1):41-53.
[8] 马旭,姜晓丹,张洪钿,等.骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究[J].中华神经医学杂志,2009,8(5): 441-445.
[9] Chen W, Johnson SL, Marcotti W,et al.Human fetal auditory stem cells can be expanded in vitro and differentiate into functional auditory neurons and hair cell-like cells.Stem Cells. 2009;27(5):1196-1204.
[10] Malgrange B, Belachew S, Thiry M,et al.Proliferative generation of mammalian auditory hair cells in culture.Mech Dev. 2002;112(1-2):79-88.
[11] Guan K, Chang H, Rolletschek A,et al.Embryonic stem cell-derived neurogenesis. Retinoic acid induction and lineage selection of neuronal cells.Cell Tissue Res. 2001; 305(2):171-176.
[12] Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD.CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.Cell. 1990;60(4):585-595.
[13] Hu Z, Corwin JT.Inner ear hair cells produced in vitro by a mesenchymal-to-epithelial transition.Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(42):16675-16680.
[14] Jeon SJ, Oshima K, Heller S,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells are progenitors in vitro for inner ear hair cells.Mol Cell Neurosci. 2007;34(1):59-68.
[15] Hung SC, Cheng H, Pan CY,et al.In vitro differentiation of size-sieved stem cells into electrically active neural cells.Stem Cells. 2002;20(6):522-529.

引言

材料方法

设计：体外细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年3至10月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞室完成。

材料：

实验动物：由新疆医科大学第一附属医院动物中心提供健康雄性豚鼠15只，体质量200-300 g，通过动物伦理审查，实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

豚鼠脂肪间充质干细胞的获取和培养：将健康豚鼠腹部及双后肢脱毛备皮，腹腔注射麻醉处死，乙醇消毒，无菌条件下腹部取十字切口，取腹股沟及双侧附睾处脂肪组织，PBS彻底冲洗血细胞及组织碎屑，剔除血管和筋膜后剪碎至糊状，移入50 mL离心管中，加入2倍体积的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，37 ℃水浴中振荡消化30 min，加入同体积的L-DMEM完全培养液终止消化，100目筛网过滤，1 500 r/min离心10min，弃上清及油脂，L-DMEM完全培养液重悬细胞，计数后按1×10⁹ L^-¹细胞浓度接种细胞于 25 cm²培养瓶中，置入37 ℃，体积分数为5%的CO₂培养箱中孵育48 h后，大部分细胞已贴壁，吸弃培养液，用PBS轻轻清洗2次，洗去红细胞及杂质，最后继续加入L-DMEM完全培养液培养，每3 d换液1次。倒置显微镜下观察细胞生长达80%左右汇合时，吸弃培养液，用PBS洗2次，0.05% Trypsin/EDTA消化，镜下观察大部分细胞变圆即添加2倍体积的培养液终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞后按8 000-10 000个/cm²密度传代培养。

流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原：收获培养的第3代对数生长期细胞，用冷的PBS调整细胞浓度为1×10⁹L^-¹，分别用CD34，CD45，CD29，CD44标记抗体，设空白对照，4 ℃避光孵育30 min后，流式细胞仪进行检测。

成毛细胞样诱导：收获培养第3代细胞，用DMEM/F12+体积分数为10%胎牛血清+2%B27液重悬，按(1.0-2.0)×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔板，待细胞融合至50%- 60%后开始诱导，更换为无血清诱导液(DMEM/F12+ 2%B27+10 µg/L表皮生长因子+20 µg/L碱性成纤维细胞生长因子)培养3-5 d，添加诱导因子(35 µg/L全反式维甲酸+ 50 µg/L胰岛素样生长因子1+30 µg/L神经营养因子3+ 10 µg/L脑源性神经营养因子)继续培养14 d，每3 d换液，隔日倒置显微镜观察细胞形态变化，拍照记录。

成毛细胞诱导的鉴定：诱导后的细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min×3次，室温下滴0.1% TritonX-100通透20 min，PBS洗5 min×3次，用体积分数为10%正常山羊血清工作液室温孵育30 min，吸弃血清，滴加相应比例稀释的一抗∶MyosinⅦa (1∶500稀释)、Math1 (1∶100稀释)、GFAP (1∶200稀释)、nestin(1∶200稀释)，放入湿盒，避光，4 ℃过夜。次日用PBS冲洗3 min×3次，滴加二抗工作液，37 ℃避光孵育1 h，PBS冲洗3 min×3次。避光Hoechest染核，PBS冲洗3 min×3次，倒置显微镜下观察。

主要观察指标：豚鼠脂肪间充质干细胞的生长特性及鉴定，向内耳毛细胞诱导后细胞的鉴定。

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讨论

感音神经性耳聋主要是由于毛细胞和与之相联系的螺旋神经的损伤和退化造成，由于内耳毛细胞的不可再生性，因此中重度的听力损失必须借助于外源性细胞诱导或植入来重建损伤的内耳结构并达到听功能恢复。近年来，用间充质干细胞治疗耳聋方面开展了大量基础实验，而相对于骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞有更强的向神经源样细胞分化的潜能，且不涉及免疫排斥反应及伦理学问题^[8]。

豚鼠耳部结构和功能更接近人耳，是耳科学首选动物模型，本实验选择豚鼠脂肪间充质干细胞作为研究对象，为后期动物实验打基础。但是研究表明将脂肪间充质干细胞分化为神经元样细胞后进一步分化为内耳毛细胞需要特定诱导培养基，而且诱导成毛细胞数量非常有限^[9]。本实验通过细胞因子体外诱导豚鼠脂肪间充质干细胞分化为毛细胞，证实用特定的培养体系配合多种细胞因子定向诱导分化毛细胞是可行的，为豚鼠脂肪间充质干细胞耳蜗移植再生修复受损毛细胞奠定基础。

目前间充质干细胞向毛细胞诱导的方法主要是化学因子诱导和共培养诱导，而且以鼠和人脂肪间充质干细胞研究较多，但是用化学因子诱导易产生细胞毒性，诱导分化的细胞无生物活性和电活动，无法正常发挥毛细胞的生理功能。细胞因子在毛细胞的生长发育中起重要作用。转基因毛细胞体外培养证实表皮生长因子能够有效的促进感觉上皮细胞前体细胞的有丝分裂，是毛细胞生长和分化所必需的生长因子^[10]。碱性成纤维细胞生长因子可促使神经干细胞增殖并决定其分化方向，在促进神经外胚层向神经前体细胞转化这个环节发挥重要作用^[11]，在内耳发育过程中对感觉毛细胞的增殖、分化和再生起重要调节作用^[12]。胰岛素样生长因子1可以促进听泡中细胞的分裂并使有丝分裂信号级联放大，在内耳发育后期，胰岛素样生长因子1还能促进耳蜗前庭螺旋神经节的发育^[13]，脑源性神经营养因子是耳蜗初级听觉神经元存活的主要营养因子。神经营养因子3是促进发育成熟的听觉神经元体外存活的最重要因子，Jeon等^[14]研究表明脑源性神经营养因子和神经营养因子3可能通过影响Math1的表达，从而促进干细胞向神经元和毛细胞样细胞分化。Hung等^[15]应用全反式维甲酸在无血清的条件下将骨髓间充质干细胞诱导出具有电活动的神经细胞。结合上述细胞因子在毛细胞生长发育中的作用，本实验选取表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、全反式维甲酸、脑源性神经营养因子、神经营养因子3作为诱导因子，在不同的时间点添加诱导，而且调整细胞因子的浓度，既能保证高效向毛细胞诱导，又不至于诱导的细胞在浓度过大时死亡。研究结果显示，豚鼠脂肪间充质干细胞在细胞因子的诱导下，可诱导分化为神经前体细胞，星形胶质细胞和内耳毛细胞，在诱导7-10 d时诱导细胞表达神经前体细胞标记物nestin阳性，部分细胞向星形胶质细胞分化，表达GFAP阳性，继续诱导10 d后发现神经前体细胞向内耳毛细胞分化，诱导细胞表达毛细胞特异性标记物MyosinⅦa和Math1，倒置显微镜观察星形胶质细胞已大部分死亡。MyosinⅦa是毛细胞主要标记物之一，早期毛细胞也表达，在耳蜗及前庭毛细胞静纤毛及胞体中表达而在支持细胞中不表达。Math1对毛细胞的分化是至关重要的，也是毛细胞主要标记物之一，但只有毛细胞同时表达这2个标志，说明豚鼠脂肪间充质干细胞在细胞因子的诱导下有分化为毛细胞的潜力。

虽然脂肪间充质干细胞具有向内耳毛细胞分化的能力，能够分化为神经源性细胞类型，而且也有实验成功移植到耳蜗中发生迁移、分化，并部分分化内耳毛细胞，但是如何使分化的毛细胞具有生物活性和电活性，能使诱导细胞发挥其正常的生理功能，移植到受损耳蜗后才能有望建立神经通路，最终是否改善听力需进一步探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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Adipose-derived mesenchymal stem cells differentiate into inner ear hair cells in guinea pigs induced by progressive addition of cytokines

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.