骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的免疫调节机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.013

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5977-5982.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.013

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骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的免疫调节机制

胡红林¹，邹丛²，习小庆¹，叶真逢¹，江唯¹

1南昌大学第二附属医院泌尿外科，江西省南昌市 330006
2南昌大学第四附属医院内分泌科，江西省南昌市 330003

修回日期:2014-08-22 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
通讯作者: 胡红林，博士，副主任医师，副教授，南昌大学第二附属医院泌尿外科，江西省南昌市 330006
作者简介:胡红林，男，1978年生，江西省遂川县人，汉族，2010年南昌大学毕业，博士，副主任医师，副教授，主要从事泌尿生殖系疾病的基础与临床研究。
基金资助:
江西省科技支撑计划资助项目(20112BBG70056)

Bone marrow mesenchymal stem cells protect against renal ischemia-reperfusion injury through immune regulatory mechanism

Hu Hong-lin¹, Zou Cong², Xi Xiao-qing¹, Ye Zhen-feng¹, Jiang Wei¹

1Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
2Department of Endocrinology, the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330003, Jiangxi Province, China

Revised:2014-08-22 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
Contact: Hu Hong-lin, Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Hu Hong-lin, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Scientific and Technological Support Plan of Jiangxi Province, No. 20112BBG70056

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞治疗肾缺血再灌注损伤一直是众多学者研究的热点，其机制相当复杂，不能用单纯的干细胞分化机制来解释，是多种机制共同参与的结果。
目的：探讨骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤时对免疫细胞的影响，从而初步总结骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的免疫调节机制。
方法：首先建立SD大鼠肾缺血再灌注损伤模型，将体外培养纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞移植入模型体内，采用流式细胞仪检测技术，分析大鼠脾细胞中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例，探讨骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤时对免疫细胞的影响，然后将上述受体SD大鼠的脾细胞移植到裸鼠体内，再使该裸鼠经历肾缺血再灌注损伤，监测裸鼠肾损伤前后肾功能和肾脏组织学变化。
结果与结论：骨髓间充质干细胞移植能够明显抑制肾缺血再灌注损伤导致的大鼠脾细胞CD4⁺CD25⁺调节性T细胞比例的降低；移植此组大鼠的脾细胞给裸鼠，可以明显保护裸鼠肾缺血再灌注损伤，表现为血清肌酐和尿素氮的降低以及肾小管病理损伤评分降低。因此，骨髓间充质干细胞可以通过调节免疫系统来治疗肾缺血再灌注损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 肾缺血再灌注损伤, 骨髓间充质干细胞, CD4⁺CD25⁺ T细胞, 免疫调节, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell therapy for renal ischemia-reperfusion injury has been the hot topics for many scholars. Its mechanism is very complex, which could not be explained by simple mechanism of stem cells differentiation. It is the result involving a variety of mechanisms.
OBJECTIVE: To investigate the influence on immune cells during the bone marrow mesenchymal stem cell therapy for renal ischemia-reperfusion injury, then to preliminary summarize the immune regulation mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell therapy for renal ischemia-reperfusion injury.
METHODS: First, we established a model of renal ischemia-reperfusion injury in rats and, cultured and purified rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Then, the bone marrow mesenchymal stem cells were transplanted into the rat models. Using flow cytometry detection technology, we analyzed the proportion of CD4⁺CD25⁺regulatory T cells of rat spleen cells, discussed the effects on immune cells during the bone marrow mesenchymal stem cell therapy for renal ischemia-reperfusion injury, and then transferred the rat’s spleen cells to the nude mice which were subjected to renal renal ischemia-reperfusion injury. Renal function and renal histological changes of nude mice were assessed.
RESULTS AND CONCLUSION: The bone marrow mesenchymal stem cell transplantation could significantly inhibit the decrease of CD4⁺CD25⁺ regulatory T cell of spleen cells in rats with renal ischemia-reperfusion injury. The transplantation of spleen cells from the above-mentioned rats to nude mice could obviously protect nude mice from renal ischemia-reperfusion injury, characterized by lower serum creatinine, blood urea nitrogen and renal tubule pathologic damage score. Therefore, bone marrow mesenchymal stem cells have protective effects on renal ischemia-reperfusion injury by regulating the immune system.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, kidney, reperfusion injury, T-lymphocytes

中图分类号:

R394.2

胡红林，邹丛，习小庆，叶真逢，江唯 . 骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的免疫调节机制[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5977-5982.

Hu Hong-lin, Zou Cong, Xi Xiao-qing, Ye Zhen-feng, Jiang Wei . Bone marrow mesenchymal stem cells protect against renal ischemia-reperfusion injury through immune regulatory mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5977-5982.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 18只SD大鼠，骨髓间充质干细胞移植组有1只术后5 h死亡，15只裸鼠，脾细胞移植组和对照组各有1只术后8 h和6 h死亡，其余动物全部存活。

2.2 骨髓间充质干细胞生长特点 骨髓单个核细胞接种于培养瓶后，细胞呈圆形，透亮，72 h换液去除未贴壁细胞后，可见散在的贴壁细胞呈长梭形，第3天后细胞增殖加快，贴壁细胞增多，呈成纤维样细胞形态，细胞扁平无立体感。10-14 d细胞铺满瓶底，达到融合状态。传代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形，24 h内完全贴壁，形态与原代培养的细胞类似，生长迅速，1周左右达到完全融合。传至8-10代以后，细胞分裂增殖速度明显减慢，细胞内颗粒增多，细胞逐渐老化。体外传代培养4-6代的骨髓间充质干细胞经锥虫蓝染色显示细胞活性大于95%。

2.3 骨髓间充质干细胞移植对肾缺血再灌注损伤大鼠脾细胞CD4⁺CD25⁺调节性T细胞亚型的影响 流式细胞结果显示，正常组、对照组、骨髓间充质干细胞移植组大鼠脾脏中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例分别为(12.81± 2.76)%，(9.21±1.79)%，(16.12±2.34)%。与正常组比较，对照组大鼠脾脏中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例明显降低(P < 0.05)；与对照组比较，骨髓间充质干细胞移植组大鼠脾脏中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例明显升高(P < 0.05)，见图1。

2.4 移植大鼠脾细胞对裸鼠肾缺血再灌注损伤后肾功能的影响 裸鼠经历45 min双侧肾脏缺血，再灌注后48 h各组血清肌酐和尿素氮水平见图2。与正常组相比，对照组血清肌酐和尿素氮均明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与对照组相比，脾细胞移植组血清肌酐和尿素氮均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 移植大鼠脾细胞对裸鼠肾缺血再灌注损伤后肾脏组织学的影响 正常组肾脏形态、大小、色泽正常；而缺血组肾脏稍肿大，髓质可见轻重不一的淤血暗红。

苏木精-伊红染色光镜检查显示：正常组肾脏组织结构基本正常(图3A)；对照组肾组织见大量小管上皮细胞肿胀、空泡变性，部分小管上皮细胞刷状缘扁平、皱缩、核深染、裸露。严重者可见上皮细胞坏死、崩解脱落以及细胞核浓缩、碎裂、核溶解。部分肾小管管腔扩张，坏死、崩解的上皮细胞可脱落入肾小管管腔内，呈模糊的颗粒样结构；肾间质见炎性细胞浸润(图3B)。脾细胞移植组肾小管上皮细胞坏死明显减轻(图3C)。肾小管病理损伤评分结果所示，对照组病理评分均显著高于正常组，差异有显著性意义(P < 0.01)，而脾细胞移植组病理评分显著低于对照组，差异有显著性意义 (P < 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年1月至2013年12月在南昌大学医学院泌尿外科研究所和南昌大学第二附属医院完成。

材料：

实验动物：①雄性SD大鼠18只，6-8周龄，体质量200-250 g，由南昌大学医学院动科部提供。18只SD大鼠根据随机数字表采用完全随机方法分为骨髓间充质干细胞移植组、生理盐水注射组(对照组)和正常组，每组6只。②雄性裸鼠15只，8周龄，均为SPF级，购自北京实验动物研究中心，根据随机数字表采用完全随机方法分为脾细胞移植组、生理盐水注射组(对照组)和正常组，每组5只。③4周龄雄性SD大鼠用于分离骨髓间充质干细胞，体质量100-150 g，由南昌大学医学院动科部提供。

主要实验试剂：PE 标记的CD4或CD8抗鼠单克隆IgG 抗体购自Invitrogen公司。Ficoll-Paque淋巴细胞分离液、DMEM/F12培养基、胎牛血清、EDTA酶均购自美国SIGMA公司。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及体外标记：无菌条件下用注射针头捣碎大鼠股骨骨小梁，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗，离心后收集沉淀，用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集单核细胞用DMEM/F12洗涤后进行细胞计数，以1×10⁷个接种于50 mL的细胞培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱，饱和湿度条件下培养。每3 d换含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基1次，待原代培养的细胞增殖接近融合状态时，用0.25%胰蛋白酶(含EDTA 1 mmol/L)消化细胞，按1︰2传代培养。

将体外传代培养4-6代的骨髓间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶(含EDTA 1 mmol/L)消化、离心收集细胞，并计数。用锥虫蓝染色观察骨髓间充质干细胞活性。

大鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立：大鼠术前8-12 h禁食，应用戊二醛腹腔内注射麻醉。沿腹正中线做1.5-2.0 cm的切口，逐层分离皮肤、腹膜，进入腹腔，将肠道推向一侧，找到肾蒂后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左右肾蒂，可见肾脏由鲜红变紫黑色，表示夹闭成功，双侧肾蒂阻断45 min后，去除动脉夹，恢复血流灌注，可见肾脏迅速由紫黑色变为鲜红，恢复原来颜色，术毕分层缝合关闭腹腔。术后大鼠于24-29 ℃的环境保暖，补充水与饲料。术中应用2.0-3.0 mL生理盐水使大鼠保持充分的水化。

模型成功与否判定：①造模成功：术中夹闭双侧肾蒂后，可见肾脏由鲜红变紫黑色，去除动脉夹，恢复血流灌注，可见肾脏迅速由紫黑色变为鲜红，恢复原来颜色；并且术后1-3 h可见小鼠苏醒，逐渐恢复正常活动。②造模不成功：肾脏恢复血流后5 min，肾脏未恢复正常颜色；或术中损伤周围组织或器官；或术后1-3 h小鼠未苏醒或死亡。

骨髓间充质干细胞注射入肾缺血再灌注损伤大鼠体内：肾缺血45 min后，松开血管夹的同时移植组将1.5×10¹⁰L^-¹骨髓间充质干细胞悬液1 mL经下腔静脉注射，对照组经下腔静脉注射1 mL无菌生理盐水。

大鼠脾脏细胞的收集和淋巴细胞亚群检测：肾脏灌注后48 h，将各组大鼠脾脏做成细胞悬液。用冷的PBS洗去血液，剪碎脾脏，用毛玻片研磨，经孔径为80 μm不锈钢丝网过滤，收集单核细胞悬液，1 200 r/min离心10 min，低渗溶血去除红细胞，用RPMI-1640培养基反复离心洗涤，至细胞团呈乳白色。重悬细胞，调整浓度为1×10¹¹ L^-¹，留取备用。以上操作细胞均置于0-4 ℃冰浴中。

取50 μL脾脏细胞悬液，加入5 μL FITC anti-mouse CD4、5 μL PE anti-mouse CD25，混匀，避光孵育20 min，加入红细胞裂解液1 mL，混匀，避光孵育10 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再用PBS 2 mL冲洗，弃上清，加入200 μL PBS，用流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例。同时检查正常大鼠和对照组大鼠脾脏细胞CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的比例。

大鼠脾脏细胞移植入裸鼠体内：将1×10⁷脾细胞经尾静脉移植入脾细胞移植组裸鼠体内。对照组注射等量的生理盐水溶液。

裸鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立：如上述大鼠肾缺血再灌注损伤模型方法，开腹后将双侧肾蒂用无损伤血管夹夹闭45 min建立肾缺血再灌注损伤裸鼠模型。

检测裸鼠肾功能的变化：肾灌注后48 h经眼眶内眦静脉丛取血约0.3 mL，4 500 r/min离心10 min后吸取血清，检测血清肌酐和尿素氮水平。

裸鼠肾脏组织形态学分析：肾脏灌注后48 h，收集裸鼠肾脏，肾脏行纵轴冠状面切开，置于体积分数为10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，制作4 μm切片，常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察肾小管坏死情况。每只裸鼠肾脏切片随机选取皮髓交界处20个视野观察，根据肾小管坏死程度，采用Rabb的半定量病理评估法评分^[2]：评分越高说明肾小管坏死越严重(最高4分)，0分为正常肾脏，1分为最少坏死(<5%的肾小管坏死)，2分为轻度坏死(5%-25%的肾小管坏死)，3分为中度坏死(26%-75%的肾小管坏死)，4分为重度坏死(>75%的肾小管坏死)。

主要观察指标：注射骨髓间充质干细胞后大鼠淋巴细胞变化；注射大鼠脾细胞后裸鼠血清肾功能变化，肾组织形态学变化，肾小管坏死程度。

统计学分析：使用GraphPad Prism 5.0统计软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示，计量资料组间差异采用t 检验，计数资料组间差异采用χ²检验, P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

肾脏缺血再灌注损伤是临床上常见的病理生理过程，是引起急性肾功能衰竭的重要原因之一，也是肾移植中影响移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素^[1-2]。肾缺血再灌注损伤的病理生理机制非常复杂，至今尚未彻底阐明。

近年研究发现，免疫系统参与了肾缺血再灌注损伤的发生发展^[3]。大量直接或间接证据均证实T细胞介导肾缺血再灌注损伤^[4-5]。T细胞介导肾缺血再灌注损伤的间接证据来源于对T细胞的免疫抑制剂的研究。吗替麦考酚酯和FTY720在肾缺血再灌注损伤后通过减轻肾脏炎症反应和减少肾小管的损害而保护肾功能^[6]。在缺血再灌注损伤过程中，阻断T细胞共刺激信号分子和白细胞黏附分子而产生损伤保护效应进一步提供了T细胞介导缺血再灌注损伤的证据^[7-8]。T细胞直接介导肾脏缺血再灌注损伤。CD4⁺和CD8⁺ T细胞缺陷鼠经历肾缺血再灌注损伤后，其肾脏功能和结构的异常明显得到改善^[9-10]。无胸腺的nu/nu裸鼠产生肾缺血再灌注损伤后保护效应，而转移野生型T细胞后这种保护效应被消失^[11-12]。

免疫细胞通过抗原依赖性途径和抗原非依赖性途径参与缺血后组织损伤^[13]，同时免疫细胞也可能参与了组织缺血再灌注损伤后的修复机制^[14]，但究竟是哪些免疫细胞亚群参与了损伤后的修复机制还不清楚。这启发研究者可以尝试调节机体免疫细胞，即上调具有保护作用的免疫细胞亚群，抑制具有损害作用的免疫细胞亚群，从而在缺血再灌注损伤的预防和治疗上发现新的治疗策略和功效。

间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤近年来一直成为众多学者的研究热点，在这方面显示出其独特的优越性^[15-22]。间充质干细胞具有调控淋巴细胞反应的特性^[23]。间充质干细胞能分泌各种生长因子和细胞因子调节T细胞反应从而调控机体的免疫系统^[24]。

Bartholomew等^[25]率先报道了灵长类动物的骨髓间充质干细胞可抑制同种异体混合淋巴细胞增殖反应达50%以上，体内注射供者来源的体外扩增骨髓间充质干细胞可延长同种异体移植皮肤的寿命。Kim等^[26]研究也发现BALB/c鼠的骨髓间充质干细胞可以抑制同种异体混合淋巴细胞反应中T淋巴细胞的增殖，并且被抑制的T细胞主要停滞于细胞周期的G₀/G₁期。

调节性T细胞是一个特殊的T细胞亚群，它能抑制免疫系统的激活，帮助维持稳态和对自身抗原的耐受，在保护机体对抗自身免疫反应中起着非常重要的作用^[27-28]。研究表明，间充质干细胞具有促进调节T细胞产生的作用^[29]。间充质干细胞的免疫调节作用可能是通过促进调节T细胞的增殖来实现的^[30]。

最近多项研究表明CD4⁺CD25⁺淋巴细胞可以保护肾缺血再灌注损伤和肾毒性损伤^[31-34]。本实验探讨了骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤的干细胞免疫调节机制，发现大鼠骨髓间充质干细胞移植入肾缺血再灌注损伤大鼠模型体内，可以使肾缺血再灌注损伤大鼠脾脏细胞CD4⁺CD25⁺淋巴细胞亚群表达升高，进一步印证了间充质干细胞具有促进调节T细胞表达的作用。然后将此大鼠的脾细胞转移给裸鼠，裸鼠经历肾缺血再灌注损伤，发现经骨髓间充质干细胞调节的大鼠脾细胞可以抑制肾缺血再灌注损伤造成的肾损伤。此研究结果在一定程度表明了骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤免疫调节作用。

综上所述，本研究的结果初步为骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤提供了新的理论依据，也将为肾缺血再灌注损伤的预防和治疗提供新的策略，但是机体的免疫反应是个极其复杂的网络机制，有很多细胞、分子对肾缺血再灌注损伤的调节都起着非常重要作用，还有待于进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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