在三丁基过氧化氢体外诱导造血干/祖细胞衰老中的SIRT6/NF-κB信号轴

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.011

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5967-5971.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.011

• 造血干细胞 hematopoietic stem cells • 上一篇下一篇

在三丁基过氧化氢体外诱导造血干/祖细胞衰老中的SIRT6/NF-κB信号轴

周玥¹，王亚平²，王建伟²，丁继超¹，杨勇琴¹

1大理学院组织学与胚胎学教研室，云南省大理市 671000
2重庆医科大学干细胞与组织工程研究室，组织学与胚胎学教研室，重庆市 400016

修回日期:2014-08-03 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
作者简介:周玥，女，1979年生，云南省大理市人，白族，2011年重庆医科大学毕业，博士，副教授，主要从事干细胞生物学，中药药理学研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81202785，81173398)

Effect of SIRT6/NF-kappa B signal axis during hematopoietic stem and progenitor cell senescence induced by tert-butylhydroperoxide in vitro

Zhou Yue¹, Wang Ya-ping², Wang Jian-wei², Ding Ji-chao¹, Yang Yong-qin¹

1Department of Histology and Embryology, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
2Laboratory of Stem Cells and Tissue Engineering, Department of Histology and Embryology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Revised:2014-08-03 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
About author:Zhou Yue, M.D., Associate professor, Department of Histology and Embryology, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81202785, 81173398

摘要/Abstract

摘要：

背景：SIRT6/NF-κB信号轴是细胞衰老的调控通路，但其在造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell，HSC/HPC)衰老中的作用尚不清楚。
目的：探讨SIRT6/NF-κB信号通路在三丁基过氧化氢体外诱导造血干/祖细胞衰老中的作用。
方法：免疫磁性分选法分离、纯化小鼠Sca-1⁺ HSC/HPC。用100 μmol/L三丁基过氧化氢体外诱导Sca-1⁺ HSC/HPC构建体外衰老模型，通过衰老相关β-半乳糖苷酶细胞化学染色、流式细胞术分析细胞周期、造血祖细胞混合集落培养确定三丁基过氧化氢诱导Sca-1⁺HSC/HPC衰老的生物学作用。荧光定量PCR及Western blotting检测衰老调控分子SIRT6、NF-κB mRNA及蛋白的表达。
结果与结论：与对照组比较，衰老组Sca-1⁺ HSC/HPC β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数、G₀/G₁期细胞比例增高，形成造血祖细胞混合集落数量减少；SIRT6 mRNA及蛋白表达下调，NF-κB mRNA及蛋白表达上调。结果表明三丁基过氧化氢可能通过调控SIRT6/NF-κB信号通路发挥诱导Sca-1⁺HSC/HPC衰老作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 造血干细胞, 三丁基过氧化氢, 造血干/祖细胞, 衰老, SIRT6, NF-κB, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: SIRT6/NF-κB is the important signal axis to cell senescence, but the effect of SIRT6/NF-κB signal axis to hematopoietic stem and progenitor cell (HSC/HPC) senescence is unclear.
OBJECTIVE: To induce (t-BHP) in vitro and to investigate the role of SIRT6/NF-κB signal axis in Sca-1⁺ HSC/HPC senescence induced by tert-butylhydroperoxide in vitro.
METHODS: Sca-1⁺HSC/HPC was isolated and purified by magnetic activated cell sorting. Sca-1⁺ HSC/HPC senescence was induced by 100 μmol/L tert-butylhydroperoxide in vitro. The senescence-associated β-Galactosidase staining, cell cycle analysis and culture of mixed hematopoietic progenitor cell were used to investigate the biological effects of tert-butylhydroperoxide on Sca-1⁺ HSC/HPC senescence. The expression of senescence associated SIRT6, NF-κB mRNA and protein was examined by real-time fluorescence quantitative PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with control group, the percentage of positive cells expressing SA-β-Gal and cells in G0/G1 phase increased and the number of forming colony of mixed hematopoietic progenitor decreased in the aging group. It showed lower expression of SIRT6 and higher expression of NF-κB in the aging group. The SIRT6/NF-κB signal axis may play a key role in the Sca-1⁺ HSC /HPC senescence inducted by tert-butylhydroperoxide.

全文链接：

Key words: hematopoietic stem cells, tert-butylhydroperoxide, aging, NF-kappa B

中图分类号:

R394.2

周玥，王亚平，王建伟，丁继超，杨勇琴. 在三丁基过氧化氢体外诱导造血干/祖细胞衰老中的SIRT6/NF-κB信号轴[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5967-5971.

Zhou Yue, Wang Ya-ping, Wang Jian-wei, Ding Ji-chao, Yang Yong-qin . Effect of SIRT6/NF-kappa B signal axis during hematopoietic stem and progenitor cell senescence induced by tert-butylhydroperoxide in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5967-5971.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] Bee PC, Gan GG, Sangkar VJ,et al.Quality of life after haematopoietic stem cell transplantation in a multiracial population.Med J Malaysia. 2011;66(5):451-455.
[2] Raghavachari N.Gene Expression Profiling of Hematopoietic Stem Cells (HSCs).Methods Mol Biol. 2014; 1185:91-119.
[3] Hine C, Mitchell JR.Saying no to drugs: fasting protects hematopoietic stem cells from chemotherapy and aging.Cell Stem Cell. 2014;14(6):704-705.
[4] Schwer B, Schumacher B, Lombard DB,et al.Neural sirtuin 6 (Sirt6) ablation attenuates somatic growth and causes obesity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(50):21790-21794.
[5] Giblin W, Skinner ME, Lombard DB.Sirtuins: guardians of mammalian healthspan.Trends Genet. 2014;30(7):271-286.
[6] Parenti MD, Grozio A, Bauer I,et al.Discovery of novel and selective SIRT6 inhibitors.J Med Chem. 2014;57(11):4796- 4804.
[7] Zhou Y, Yang B, Yao X,et al.Establishment of an aging model of Sca-1+ hematopoietic stem cell and studies on its relative biological mechanisms.In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2011;47(2): 149-156.
[8] Qin YS, Bu DX, Cui YY,et al.Difference in glycerol levels between leukemia and normal bone marrow stem cells.Oncol Lett. 2014;8(1):169-174.
[9] Smith AJ, Lewis FC, Aquila I,et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.Nat Protoc. 2014; 9(7):1662-1681.
[10] Dykstra B, de Haan G.Hematopoietic stem cell aging and self-renewal.Cell Tissue Res. 2008;331(1):91-101.
[11] Valli H, Sukhwani M, Dovey SL,et al.Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells.Fertil Steril. 2014;102(2): 566-580.
[12] Wang J, Sun Q, Morita Y, et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.Cell. 2012;148(5):1001-1014.
[13] Odendahl M, Grigoleit GU, Bönig H,et al.Clinical-scale isolation of 'minimally manipulated' cytomegalovirus-specific donor lymphocytes for the treatment of refractory cytomegalovirus disease.Cytotherapy. 2014;16(9):1245-1256.
[14] Chen SS, Chiorazzi N.Murine genetically engineered and human xenograft models of chronic lymphocytic leukemia. Semin Hematol. 2014;51(3):188-205.
[15] Rossi DJ, Bryder D, Weissman IL.Hematopoietic stem cell aging: mechanism and consequence.Exp Gerontol. 2007; 42(5):385-390.
[16] Gazit R, Weissman IL, Rossi DJ.Hematopoietic stem cells and the aging hematopoietic system.Semin Hematol. 2008; 45(4):218-224.
[17] Goodrich AD, Varain NM, Jeanblanc CM,et al.Influence of a dual-injection regimen, plerixafor and CXCR4 on in utero hematopoietic stem cell transplantation and engraftment with use of the sheep model.Cytotherapy. 2014;16(9):1280-1293.
[18] Kambham N, Higgins JP, Sundram U, et al.Hematopoietic stem cell transplantation: graft versus host disease and pathology of gastrointestinal tract, liver, and lung.Adv Anat Pathol. 2014;21(5):301-320.
[19] Tennen RI, Chua KF.Chromatin regulation and genome maintenance by mammalian SIRT6.Trends Biochem Sci. 2011;36(1):39-46.
[20] Tennen RI, Berber E, Chua KF. Functional dissection of SIRT6: identification of domains that regulate histone deacetylase activity and chromatin localization.Mech Ageing Dev. 2010;131(3):185-192.
[21] Li Y, Ohms SJ, Sun C,et al.NF-κB controls Il2 and Csf2 expression during T cell development and activation process. Mol Biol Rep. 2013;40(2):1685-1692.
[22] Yu SS, Cai Y, Ye JT,et al.Sirtuin 6 protects cardiomyocytes from hypertrophy in vitro via inhibition of NF-κB-dependent transcriptional activity.Br J Pharmacol. 2013;168(1):117-128.
[23] Jia G, Su L, Singhal S,et al.Emerging roles of SIRT6 on telomere maintenance, DNA repair, metabolism and mammalian aging.Mol Cell Biochem. 2012;364(1-2):345-350.
[24] Baohua Y, Li L.Effects of SIRT6 silencing on collagen metabolism in human dermal fibroblasts.Cell Biol Int. 2012; 36(1):105-108.
[25] Kawahara TL, Michishita E, Adler AS,et al.SIRT6 links histone H3 lysine 9 deacetylation to NF-kappaB-dependent gene expression and organismal life span.Cell. 2009;136(1):62-74.
[26] Ashburner BP, Westerheide SD, Baldwin AS Jr.The p65 (RelA) subunit of NF-kappaB interacts with the histone deacetylase (HDAC) corepressors HDAC1 and HDAC2 to negatively regulate gene expression.Mol Cell Biol. 2001;21(20):7065- 7077.
[27] Wan F, Lenardo MJ.The nuclear signaling of NF-kappaB: current knowledge, new insights, and future perspectives.Cell Res. 2010;20(1):24-33.
[28] Salminen A, Kaarniranta K.NF-kappaB signaling in the aging process.J Clin Immunol. 2009;29(4):397-405.
[29] Natoli G.When sirtuins and NF-kappaB collide.Cell. 2009; 136(1):19-21.
[30] Gertler AA, Cohen HY.SIRT6, a protein with many faces. Biogerontology. 2013;14(6):629-639.
[31] Etchegaray JP, Zhong L, Mostoslavsky R.The histone deacetylase SIRT6: at the crossroads between epigenetics, metabolism and disease.Curr Top Med Chem. 2013;13(23): 2991-3000.
[32] Ren Y, Shan TZ, Zhu LN,et al.Effect of breed on the expression of Sirtuins (Sirt1-7) and antioxidant capacity in porcine brain.Animal. 2013;7(12):1994-1998.
[33] Lee OH, Kim J, Kim JM,et al.Decreased expression of sirtuin 6 is associated with release of high mobility group box-1 after cerebral ischemia.Biochem Biophys Res Commun. 2013;438(2):388-394.

引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2013年1至12月在云南省高校细胞生物学重点实验室完成。

材料：

实验动物：C57BL/6小鼠，6-8周龄，体质量20-25 g，由重庆市医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK (渝)2007-0001。

实验方法：

实验分组：按本实验室方法运用免疫磁性吸附细胞分选(magnetic activated cell sorting，MACS)法分离、纯化小鼠Sca-1⁺ HSC/HPC^[7-9]。将分离纯化的Sca-1⁺HSC/HPC种植于6孔板中，调整细胞浓度为1×10⁵/孔。正常对照组：在37 ℃、体积分数为5% CO₂和含体积分数为10%胎牛血清的IMDM培养液中培养6 h；衰老组：对照组基础上加入终浓度为100 μmol/L三丁基过氧化氢作用6 h。处理结束后洗涤培养液进行相关检测。

SA-β-半乳糖苷酶染色：按照SA-β-Gal Staining Kit方法操作，染色后离心甩片，70%甘油封固镜检。每张甩片随机计数400个细胞，观察和计数阳性细胞的百分比。

流式细胞术细胞周期分析：收集对照组及衰老组细胞，PBS洗1次，体积分数为70%冰乙醇固定过夜，PBS洗涤2次，加入100 µL牛胰核糖核酸酶(1 g/L)，37 ℃水浴孵育 30 min；加入碘化丙啶染色液(50 mg/L)避光反应30 min，流式细胞仪检测，Multicycle软件(日本PHENIX公司)分析各组细胞的细胞周期时相。

造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养：参照文献[10-11]方法改进，依次加入2-巯基乙醇(1×10^-⁴ mol/L)、3% L-谷氨酰胺、马血清、促红细胞生成素、白细胞介素3、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、1×10⁴个对照组/衰老组细胞及2.7%甲基纤维素，总体积2 mL，充分混匀后接种于96孔板(0.2 mL/孔)，在37 ℃、含体积分数为5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养7 d，根据种植Sca-1⁺HSC/HPC数与形成混合集落数评价各组细胞形成混合集落能力与多向分化潜能。

荧光定量PCR检测SIRT6、NF-κB mRNA的表达：收集各组细胞，Trizol裂解后，分别提取各组细胞总RNA。反转录为相应的cDNA，反转录反应条件：42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。反应产物cDNA 于-20 ℃保存待FQ-PCR反应。以RNA反转录得到的cDNA为模板，扩增SIRT6、NF-κB，以GAPDH为内参照。引物序列见表1。PCR扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃检测信号。应用Quantity One软件(Bio Rad)进行数据处理，分析结果。

Western blotting检测SIRT6、NF-κB蛋白的表达：收集各组细胞，分别提取总蛋白，按BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定总蛋白浓度。等量总蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗鼠SIRT6、NF-κB一抗(1︰200)，4 ℃过夜；TBST缓冲液充分漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1︰5 000)，室温反应2 h；TBST充分洗膜3次，ECL增强发光试剂显色后，于凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。

主要观察指标：①SA-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比。②流式细胞术检测细胞周期时相。③形成造血祖细胞混合集落个数。④SIRT6、NF-κB mRNA及蛋白的表达。

统计学分析：运用SPSS 11.0软件进行实验数据统计学处理，两组之间比较采用t 检验，数据均以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

衰老不可避免，但延缓衰老是可行的，探寻衰老之谜，寻找延衰之方，一直是古今中外学者的不懈追求。造血干细胞衰老与机体衰老有着密切联系，造血干细胞衰老将导致血细胞发生失去正常调控、机体免疫功能低下、肿瘤发生率增加，造血干细胞衰老与老年性白血病及再生障碍性贫血的发生密切相关，可见寻找延缓造血干细胞衰老的有效方法对延年益寿和防治老年性疾病有着重要理论和应用价值^[12-14]。研究发现，在机体衰老过程中造血系统的基本成分得以维持，但造血干细胞自我更新及多向分化潜能却逐渐降低，即随着年龄不断增长造血干细胞发生了衰老^[15-18]。衰老机体的造血干细胞形成克隆能力较年轻机体明显降低，并难以重建受者的造血能力；年轻造血干细胞的增殖能力明显强于老年造血干细胞；小鼠造血干细胞连续移植实验发现，造血干细胞能连续移植并具有重建受体鼠造血功能，但造血干细胞移植仅限4-6代，其终将丧失自我更新及多向分化潜能，并表现细胞衰老的生物学特性，在连续移植实验中表现出来的造血干细胞寿命的有限性说明造血干细胞确实发生了衰老。三丁基过氧化氢是一种过氧化物，它可通过氧化应激途径作用细胞，促使细胞逐渐失去增殖能力而衰老。

本研究运用三丁基过氧化氢诱导小鼠Sca-1⁺HSC/ HPC衰老构建体外衰老模型，衰老组Sca-1⁺HSC/HPC SA-β-Gal染色阳性细胞数显著增多，G₀/G₁期细胞比例增高，进入增殖期的细胞数量减少，形成混合集落的能力减弱，说明Sca-1⁺HSC/HPC增殖能力下降，细胞自我更新及多向分化潜能降低，发生衰老。证明：三丁基过氧化氢能有效诱导Sca-1⁺HSC/HPC衰老，衰老的Sca-1⁺HSC/HPC表达干细胞衰老的相关生物学特征。

乙酰化酶SIRT6是细胞寿限的关键调控基因，在抑制衰老过程中发挥着重要的作用，SIRT6的功能缺陷导致了衰老的发生。Tennen等^[19-24]通过基因剔除技术使小鼠中的SIRT6基因缺失，发现小鼠表现出了明显的衰老性状：体积明显减小，骨密度下降，免疫功能降低，代谢功能障碍，基因组稳定性降低等特征。在衰老调控网络中，NF-κB在衰老进程的免疫障碍中扮演了核心角色，NF-κB的激活可诱导细胞衰老的发生。Kawahara等^[25-33]研究发现SIRT6通过抑制NF-κB调控有机体细胞的衰老，SIRT6可促进NF-κB靶基因启动子H3K9脱乙酰作用而发挥其功能。本研究发现，与对照组比较，衰老组Sca-1⁺HSC/HPC SIRT6表达下调，NF-κB表达上调，这与细胞衰老过程中SIRT6与NF-κB表达改变一致，提示三丁基过氧化氢可能通过调控SIRT6/NF-κB信号通路发挥诱导Sca-1⁺HSC/HPC衰老作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

在三丁基过氧化氢体外诱导造血干/祖细胞衰老中的SIRT6/NF-κB信号轴

Effect of SIRT6/NF-kappa B signal axis during hematopoietic stem and progenitor cell senescence induced by tert-butylhydroperoxide in vitro

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.