绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5923-5928.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.004

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绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定

王阳，曹志强

解放军沈阳军区总医院泌尿外科，辽宁省沈阳市 110840

修回日期:2014-08-24 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
通讯作者: 曹志强，博士，副主任医师，解放军沈阳军区总医院泌尿外科，辽宁省沈阳市 110840
作者简介:王阳，男，1987年生，辽宁省本溪市人，满族，硕士，主要从事男科基础与临床研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金项目(2013020199)

Isolation and identification of bone marrow mesenchymal stem cells from transgenic rats with green fluorescent protein gene

Wang Yang, Cao Zhi-qiang

Department of Urinary Surgery, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110840, Liaoning Province, China

Revised:2014-08-24 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
Contact: Cao Zhi-qiang, M.D., Associate chief physician, Department of Urinary Surgery, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110840, Liaoning Province, China
About author:Wang Yang, Master, Department of Urinary Surgery, General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110840, Liaoning Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 2013020199

摘要/Abstract

摘要：

背景：转基因动物提取的间充质干细胞自身携带绿色荧光蛋白，与传统病毒、质粒转染相比，能在活细胞中稳定地表达，可较快筛选其修饰的细胞。
目的：观察绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。
方法：取2周龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠双侧长骨骨髓，采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。流式细胞术分析第5代绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞的细胞表型，并分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向诱导分化，采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定。
结果与结论：成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表达CD90和CD105，不表达或弱表达CD14和CD45。经成骨诱导3周后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积，经成脂诱导3周后油红O染色见红色的脂滴。结果表明稳定表达的绿色荧光蛋白未影响到骨髓间充质干细胞的多向分化潜能，可作为良好的示踪因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 绿色荧光蛋白, 骨髓间充质干细胞, 转基因大鼠, 细胞表型, 成骨分化, 成脂分化, 辽宁省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells from transgenic animals carry green fluorescent protein that can be stably expressed in viable cells and can be used to rapidly screen modified cells in comparison with traditional virus and plasmids.
OBJECTIVE: To study the biological features of bone marrow derived stromal cells from transgenic rats with green fluorescent protein gene.
METHODS: Bone marrows were isolated from the bilateral long bones of 2-week-old transgenic rats with green fluorescent protein gene, and cultivated in conditioned culture medium to obtain bone marrow mesenchymal stem cells with green fluorescent protein gene. The passage 5 bone marrow mesenchymal stem cells with green fluorescent protein gene were analyzed by flow cytometry to detect cell surface molecules, and were induced in calcium or adipogenic induction medium. After calcium induction, the alizarin red staining was performed to test the formation of calcium concentration. After adipogenic induction, bone marrow mesenchymal stem cells were detected with oil red O staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells, stably expressing green fluorescent protein gene, were obtained successfully from the transgenic rat with green fluorescent protein gene. The cells expressed CD90, CD105 strongly, but did not express or weakly expressed CD14 andCD45. After 3 weeks of calcium induction, jacinth calcium salts could be detected in the cells by alizarin red staining. At 3 weeks of adipogenic induction, the cells showed positive oil red O staining. The green fluorescent protein gene, as report gene, exerts no effect on the cell surface molecules and multilineage potential of bone marrow mesenchymal stem cells, which can be used as an efficient tracer.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, green fluorescent proteins, rats, transgenic

中图分类号:

R394.2

王阳，曹志强. 绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5923-5928.

Wang Yang, Cao Zhi-qiang. Isolation and identification of bone marrow mesenchymal stem cells from transgenic rats with green fluorescent protein gene[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5923-5928.

图/表（结果） 1

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引言

骨髓来源的间充质干细胞可以从长骨干骺端骨髓腔及髂骨等处骨髓腔抽取获得，具有体外易于分离扩增的特点，而且不存在如胚胎干细胞应用的伦理和政策性问题^[1-5]，已应用于许多疾病的治疗和预防^[5-6]。然而，在体内应用骨髓间充质干细胞时，细胞定位问题及作用机制研究一直是各项研究的难点和热点^[7]。由于缺乏间充质干细胞特异性的表面分子^[8]，只能通过许多标记系统或模型动物的方法来监测间充质干细胞的体内归巢，包括杂交荧光标记、放射标记、免疫标记或生物发光技术等^[9-10]。

生物发光技术是最直观的体内示踪技术，配合特殊设备仪器，可以实现活体显影示踪，包括绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)和红色荧光蛋白等^[10]。绿色荧光蛋白被用于检测干细胞的分布和结局比较多见，局部注射后它可以在体内存留约28 d^[11-13]。绿色荧光蛋白基因作为一种报告基因，具有高效、稳定、无毒、易于检测等特性，能在活细胞中稳定地表达，可较快筛选其修饰的细胞^[14-15]。

对间充质干细胞进行基因修饰的方法包括瞬时转染、病毒修饰等^[16-18]，都存在转染效率不稳定^[19]，以及体外培养阶段修饰基因逐渐衰减的问题^[20-22]。而转基因动物由于其对目的基因稳定表达，从而在不同部位、不同时间提取的细胞都稳定表达目的基因，已被广泛用于肿瘤研究、干细胞研究等领域^[23-24]。本实验在体外分离、培养绿色荧光蛋白转基因大鼠的骨髓间充质干细胞并进行诱导分化，为进一步在体内研究骨髓间充质干细胞存活、分化和迁移机制提供初步实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2013年8月至2014年3月在解放军沈阳军区总医院全军重症创伤实验室和心内科实验室完成。

材料：

实验动物：2周龄雄性绿色荧光蛋白转基因SD大鼠6只，体质量100-120 g，购自解放军第四军医大学神经生物研究所。动物运送、饲养、手术、术后处理均经解放军沈阳军区总医院及解放军第四军医大学动物伦理委员会审核通过。

主要试剂：DMEM培养基、胰蛋白酶、谷氨酰胺(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；噻唑蓝溶液(Wolsen公司)；CD14、CD45、CD90、CD105小鼠抗大鼠流式单抗(ABD公司)；成脂诱导液、成骨诱导液、油红O染液、茜素红染液(美国Sigma公司)。

主要仪器和器材：流式细胞仪(BD公司)；细胞培养箱、低温离心机、动物手术台，显微手术器械、超低温冰箱(Thermo公司)；振荡器(科瑞永兴化玻仪器有限公司)；自动凝胶成像系统(Syngene公司)；倒置显微镜、细胞培养板、细胞培养瓶、倒置荧光显微镜(美国ACCR-SCOPE)。

实验方法：

转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养：①以10%水合氯醛0.2 mL腹腔注射麻醉。②体积分数为75%乙醇浸泡15 min，鼠头放在乙醇外面以免引起窒息过早死亡。③大鼠固定于无菌操作箱内的手术台上。④剪开皮肤、皮下、肌肉，完全显露股骨和胫骨。⑤保护干骺端，分别取出双侧股骨和胫骨，尽量去除骨外肌肉及脂肪组织，立即放入无血清低糖的DMEM培养基中。⑥眼科剪剪去骨两端软骨和干骺端，显露骨髓腔，注射器抽取含血清的DMEM培养基5 mL反复冲洗骨髓腔，注意不要离下面的无菌培养皿过远，以免溅出，冲洗过程中见粉色浑浊液体流出，待骨髓腔变白后，更换另一骨重复上述步骤冲洗，直至四肢的骨髓都冲出。⑦收集冲洗出来的混合悬液，室温条件下 800 r/min离心5 min。⑧弃去上清，用10 mL新鲜的含血清DMEM培养基重悬混合物，用移液器转移混合物到一个新的培养瓶中，37 ℃，体积分数为5% CO₂培养条件孵育。早期贴壁不好，尽量减少移动和反复观察。⑨48 h后首次换液，去除悬浮细胞和培养基(主要为悬浮生长细胞和死细胞)，观察贴壁细胞的生长情况。⑩细胞融合80%以上时，开始1∶3传代，传至第5代时，分别取细胞进行细胞表型鉴定，定向分化检测。

细胞表型鉴定：细胞融合80%以上后，弃去培养基，PBS冲洗2次，加胰酶消化1 min，用新鲜含血清的DMEM 1 mL终止消化。再加DMEM 3 mL并吹打成单细胞悬液，显微镜计数，加DMEM稀释样本使每个样本细胞数为1×10⁶，常温离心机离心，3 000 r/min，5 min，去上清，PBS冲洗2遍，离心弃去上清。每个待检测的样本中加100 μL 1×PBS后轻轻摇晃混匀，标记好样本种类，继续向瓶中加10 μL CD14、CD90、CD45、CD105各个荧光标记的单克隆流式抗体，孵育30 min，上流式细胞仪检测。

骨髓间充质干细胞多向分化诱导：

成骨诱导：取生长状态良好的第5代绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞，待细胞达到80%融合时，将成骨诱导剂(地塞米松10 μmol/L，维生素C 50 μmol/L，β-磷酸甘油钠10 mmol/L)加入培养基中，每周更换3次，3周后矿化结节形成，细胞培养瓶底部见结晶，此时进行茜素红染色，然后显微镜下观察。阴性对照为未加诱导剂的骨髓间充质干细胞。

成脂诱导：取生长状态良好的第5代绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞，待细胞达到80%融合时，向培养皿中加成脂诱导剂(地塞米松1 μmol/L，吲哚美辛200 μmol/L，IBMX 0.5 μmol/L，胰岛素10 mg/L)，诱导1 d后换液，重复两三天后换普通培养基继续培养孵育。约3周后进行油红O染色，在倒置相差显微可见细胞质中的脂滴沉着，然后显微镜下观察。阴性对照为未加诱导剂的骨髓间充质干细胞。

生长曲线：选取第5代生长良好的细胞进行测定。胰酶消化，DMEM终止消化，加DMEM培养基5 mL吹打细胞制备成单细胞悬液，根据培养天数分为10组培养，每组多培养1个孔为复孔，每孔铺0.2×10⁴细胞，每孔加DMEM培养基约1 mL，轻轻混匀铺平细胞，把24孔板放入细胞培养箱中孵育；每天取3孔，用胰酶消化后显微镜下计数；以培养时间为横坐标，以对应时间测定的细胞数为纵坐标，制成细胞生长曲线。然后根据公式计算倍增时间(TD)=t×lg2/ (lgNt-lgN0)，t为培养时间。N0为首次记下的细胞数，Nt为第t天的细胞数。

主要观察指标：细胞生长形态、生长曲线、绿色荧光蛋白表达情况、定向诱导分化能力。

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讨论

干细胞是一组具有自我复制能力和定向分化成特有细胞能力的细胞。它包含胚胎干细胞、脂肪干细胞、骨髓干细胞等一系列干细胞体系^[26]，其中胚胎干细胞是从胚泡提取的具有向多个系统分化功能的干细胞，是干细胞特性最突出、最吸引人的细胞治疗资源^[27-28]。但是，用人胚胎干细胞治疗存在伦理问题和法律限制，大规模应用于临床治疗不大可能。近期也有研究将多能成体干细胞和诱导的多能干细胞作为细胞治疗来源^[29]，但其技术要求较高，且安全性还有待观察^[30]。

间充质干细胞是一组形态类似于纤维细胞，具有贴壁克隆样生长的细胞系。间充质干细胞可以从小鼠、大鼠和兔等多种动物体内成功地分离获得。在很多成人身体组织中都可以提取出间充质干细胞，包括骨髓、脂肪、肝脏、羊水、骨骼肌以及肾脏^[31-37]。

间充质干细胞的体外增殖性能可因分离方法、取材部位、供者年龄的不同而不完全相同，常用的分离方法包括贴壁培养筛选法、流式细胞仪法以及密度梯度离心法。流式细胞仪分离法和免疫磁珠法都可以从组织中提取高纯度的间充质干细胞，但机器分离过程中对细胞的活性有较大影响，产生很多细胞死亡或变性情况，而且对技术要求高，往往需要多实验室协调配合，操作不便。密度梯度离心法是根据细胞密度不同的原理分离细胞，对细胞不加修饰，所以对细胞的活性影响较小，可将各种细胞按照大小密度分层，但其缺点是破坏了局部微环境。作者认为，全骨髓贴壁分离法分离间充质干细胞是最简单、最实用的方法，利用间充质干细胞具有贴壁生长的特性，把悬浮生长的造血干细胞分离开，而且骨髓中其他许多利于间充质干细胞生长的细胞因子得到了保留，这有利于间充质干细胞自身特性的保持。本实验就是采用这种方法分离提纯幼年大鼠骨髓间充质干细胞，早期可能成分稍复杂，杂质较多，但经过传代几次后，逐步纯化。

本实验结果均证实提取的细胞符合间充质干细胞的具有自我复制能力，能定向分化为脂肪细胞、成骨细胞特性，表面分子表达符合间充质干细胞诊断标准，与文献报道的间充质干细胞特性一致^[38]。研究发现，细胞密度越大，生长越受抑制，即克隆生长的干细胞克隆越大，生长越慢，所以增加传代、稀释细胞有可能延缓间充质干细胞衰老，但也有研究认为传代过多后会使得间充质干细胞失去干细胞特性。本实验过程中发现细胞传到第10代时，间充质干细胞的生物学特性仍变化不大，生长曲线与第3-5代相仿，这可能与供体种类、年龄不同有关。但间充质干细胞体外扩增会部分地改变细胞特性，用于细胞治疗还没有统一的标准扩增方式。

研究显示，不同标记方式可能影响间充质干细胞的归巢部位和效率。用红色荧光标记的间充质干细胞输注后发现大多数间充质干细胞被聚集在肺部^[39]。相反，标记氧化铁纳米颗粒的间充质干细胞大多聚集到胸腺和胃肠道，而不是肺^[40]。虽然归巢器官不尽相同，但这些标记系统都可以引导追踪间充质干细胞如何到达损伤部位起到修复损伤的作用。转基因动物提取的间充质干细胞自身携带绿色荧光蛋白，与传统病毒、质粒转染相比，对细胞的干预更加小，相对转染的方法，本方法更简单^[41]。转基因动物表达的报告基因普遍存在，体外扩增传代和体内分化不会导致报告基因的关闭，因此可以提供直观、简便、稳定的标记细胞^[42]。绿色荧光蛋白可以作为报告基因，标记过程无创，对细胞自身损害小，因此，绿色荧光蛋白不仅可以用于亚细胞定位，也可在体内实时监测。

对间充质干细胞的研究不仅仅集中在研究其本身的生物学特性，也集中在以间充质干细胞为基础的临床疾病治疗。至今已有近400个以间充质干细胞为基础的临床注册研究实验，涉及治疗多种疾病(http://www.clinicaltrials. gov/)。间充质干细胞已经被证实可以用于以下5种疾病状态的治疗：减少炎症和缺血反应，如心肌梗死、糖尿病足^[43-48]；组织再生和修复，如成软骨、成骨、肌肉、肌腱和神经细胞；作为组织工程中的细胞支架塑性剂；增强造血干细胞移植效率；免疫性疾病治疗，如移植物抗宿主病、风湿性关节炎、自身免疫性疾病、败血症、多发性硬化等^[31,49-54]。本实验利用间充质干细胞具有的贴壁特性可以提取骨髓原代细胞中的间充质干细胞，经体外培养扩增后就可以获得实验用的足量间充质干细胞。实验中发现，经鉴定后的间充质干细胞经传代至10代时仍具有很强的增殖能力和定向分化能力，由于该方法简单易行，可以进一步开展细胞移植治疗。细胞自身携带的绿色荧光蛋白可以有效定位干细胞，为转化医学研究提供足够的容易示踪的细胞来源，且整个过程未对细胞进行转染染色等操作，对细胞影响很小。

本研究利用显性遗传的表达绿色荧光蛋白的转基因大鼠作为细胞供体，进行了骨髓间充质干细胞的分离和培养，成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞。并采用油红O和茜素红染色方法进一步证实，在不同的诱导条件下，其可分别向成脂和成骨方向分化。实验结果说明，稳定表达的绿色荧光蛋白未影响到骨髓间充质干细胞的多向分化潜能，可作为良好的示踪因子。本实验结果为利用绿色荧光蛋白作为示踪基因，在体内观察骨髓间充质干细胞参与组织修复提供了实验基础。

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定

Isolation and identification of bone marrow mesenchymal stem cells from transgenic rats with green fluorescent protein gene

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