间歇张应力对骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞骨向分化中细胞骨架的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (37): 5905-5910.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.37.001

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间歇张应力对骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞骨向分化中细胞骨架的影响

欧阳宁鹃，傅润卿，张鹏，吴玉琼，王洁，江凌勇，房兵

上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科；上海市口腔医学重点实验室，上海市 200011

修回日期:2014-08-23 出版日期:2014-09-03 发布日期:2014-09-03
通讯作者: 江凌勇，博士，副教授，上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科；上海市口腔医学重点实验室，上海市 200011 并列通讯作者：房兵，博士，教授，上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科；上海市口腔医学重点实验室，上海市 200011
作者简介:欧阳宁鹃，女，1990年生，上海市人，汉族，在读硕士，主要从事口腔科方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81371121, 11342005, 30901698, 10972142)；上海市自然科学基金(13ZR1423700)；上海交通大学“医工交叉基金”(YG2012MS40)；上海市科委基础研究重点项目(12JC1405700)；上海交通大学SMC-晨星青年学者奖励计划优秀青年教师(B类计划)；上海市教委创新团队

Effect of intermittent tensile stress on cytoskeleton of bone marrow mesenchymal stem cells during osteogenic differentiation in osteoporosis rats

Ouyang Ning-juan, Fu Run-qing, Zhang Peng, Wu Yu-qiong, Wang Jie, Jiang Ling-yong, Fang Bing

Department of Crania & Oral Maxillofacial Science, Shanghai Ninth People’s Hospital, College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China

Revised:2014-08-23 Online:2014-09-03 Published:2014-09-03
Contact: Jiang Ling-yong, M.D., Associate professor, Department of Crania & Oral Maxillofacial Science, Shanghai Ninth People’s Hospital, College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China Corresponding author: Fang Bing, M.D., Professor, Department of Crania & Oral Maxillofacial Science, Shanghai Ninth People’s Hospital, College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China
About author:Ouyang Ning-juan, Studying for master’s degree, Department of Crania & Oral Maxillofacial Science, Shanghai Ninth People’s Hospital, College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371121, 11342005, 30901698, 10972142; the Natural Science Foundation of Shanghai, No. 13ZR1423700; Medical and Engineering Crossing Fund of Shanghai Jiao Tong University, No. YG2012MS40; the Basic Research Major Project of Shanghai Science and Technology Commission, No. 12JC1405700; the SMC-Young Scholar Bonus Scheme for Excellent Young Teachers (Class B); the Innovative Team of Shanghai Education Bureau

摘要/Abstract

摘要：

背景：细胞骨架在力学信号的传递中发挥着重要作用，间歇张应力可促进骨髓间充质干细胞的骨向分化，但关于骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的细胞骨架在间歇张应力作用下骨向分化中的变化尚无相关报道。
目的：探讨间歇性张应力在骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化过程中对细胞骨架的影响。
方法：建立大鼠骨质疏松模型，提取骨髓间充质干细胞进行体外培养，用FX-4000T Flexcell对细胞施加不同强度的间歇性张应力(5%，10%，15%)，对照组不予施力，碱性磷酸酶染色明确骨向分化情况，激光共聚焦显微镜观察并应用Image ProPlus6.0软件进行分析，测定细胞面积、长宽比及骨架蛋白F-actin的积分荧光强度。
结果与结论：力学作用下，骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的排列基本垂直于加力方向，所选幅度皆可促进细胞骨向分化，以10%应变组碱性磷酸酶染色最深，15%张应力组细胞排列出现连续性中断。加力后，细胞骨架发生适应性改建，F-actin纤维束平行排列似栅栏状。图像分析显示：间歇性张应力刺激下，骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞面积减小(10%，15%应变组)、长宽比增加(10%，15%应变组)、F-actin表达量增加(5%，10%，15%应变组)，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。由此可得，力学刺激下，在骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化的过程中，细胞骨架结构发生了相应改建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 间歇性张应力, 骨髓间充质干细胞, 骨质疏松, 骨向分化, 细胞骨架, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Cytoskeleton plays an important role in the transduction of mechanical signal, and intermittent tensile stress can promote osteogenic differentiation. However, there is no relevant study about the change of cytoskeleton in osteoporosis rat bone marrow mesenchymal stem cells under intermittent tensile stress.
OBJECTIVE: To investigate the effects of intermittent tensile stress on the cytoskeleton of osteoporosis rat bone marrow mesenchymal stem cells during osteogenic differentiation.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were obtained from osteoporosis rats and cultured in vitro. The 5%, 10% and 15% tensile stress were strained on the bone marrow mesenchymal stem cells through FX-4000T Flexcell. No stress was in the control group. Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells was observed through alkaline phosphatase staining, while the change of cytoskeleton was observed by confocal laser scanning microscopy with figures collected for analysis by Image-ProPlus 6.0 software. The area of cells, ratio of length to width and integrated fluorescence intensity of cytoskeleton protein F-actin were measured.
RESULTS AND CONCLUSION: Under tensile stress, bone marrow mesenchymal stem cells from osteoporosis rats arranged in the direction vertical to mechanical stimulation. Cells under different tensile stress differentiated towards osteoblasts. The result of alkaline phosphatase staining showed the most significant difference in 10% group, and quite an amount of cells lining lost succession in the 15% group. Under stress, the F-actin filaments were rearranged in parallel accordingly, which showed a reconstruction of cytoskeleton. Imaging analysis indicated that the area of bone marrow mesenchymal stem cells was decreased in 10% and 15% groups (P < 0.05) with the increased ratio of length to width (P < 0.05), and expression of F-actin increased in5%, 10%, 15% groups (P < 0.05) after tensile stress. Under mechanical stimulation, the cytoskeleton of bone marrow mesenchymal stem cells from osteoporosis rats is shown to have corresponding alterations during osteogenic differentiation.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, osteoporosis, stress, mechanical, cytoskeleton

中图分类号:

R394.2

欧阳宁鹃，傅润卿，张鹏，吴玉琼，王洁，江凌勇，房兵. 间歇张应力对骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞骨向分化中细胞骨架的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(37): 5905-5910.

Ouyang Ning-juan, Fu Run-qing, Zhang Peng, Wu Yu-qiong, Wang Jie, Jiang Ling-yong, Fang Bing. Effect of intermittent tensile stress on cytoskeleton of bone marrow mesenchymal stem cells during osteogenic differentiation in osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(37): 5905-5910.

图/表（结果） 2

2.1 形态学观察及碱性磷酸酶染色结果 对照组细胞排列杂乱，加力组细胞排列较为规律，与受力方向垂直，所选幅度皆能促进骨向分化。其中，10%应变组形态最为规整，细胞呈现长梭形，交织排列；15%应变组细胞形态不规则，排列连续性中断，局部已无细胞生长。5%应变组染色较对照组深，10%应变组染色最深且均匀分布，15%应变组染色较浅，见图1。

2.2 细胞骨架观察情况及统计学分析 激光共聚焦显微镜下可见，对照组细胞呈典型多角形，骨架相互交织，方向不规律，排列欠规则。在5%应变组及10%应变组中，细胞骨架发生改建，F-actin纤维束呈现明显方向性，类栅栏状平行排列，与受力方向基本垂直。其中，5%应变组骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞骨架略有拉伸，微丝纤维开始增粗，10%应变组微丝明显增粗，F-actin纤维束于靠近胞膜处较为密集。加力幅度继续增大时，15%应变组F-actin纤维束逐渐出现分布不均的现象，多集中于胞膜处(图2)。

加力后细胞面积及长宽比变化显示，10%应变组、15%应变组的细胞面积皆显著小于对照组；同时，10%应变组的细胞面积与5%应变组相比差异也有显著性意义。另外，力学刺激下，细胞的长宽比也发生了改变，其趋势与面积变化趋势相反，即10%应变组、15%应变组的细胞长宽比显著高于对照组，10%应变组的细胞长宽比较5%应变组也显著升高。随着加力幅度的增大，骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的细胞面积减小，长宽比增加。

数据显示，应力刺激下，骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的F-actin积分荧光强度较未加力组明显升高，且10%应变组最为明显，接近未加力对照组的4倍(表1和图3)。

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引言

材料方法

设计：细胞学实验。

时间及地点：于2013年7至11月在上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔重点实验室和上海交通大学力学生物学与医学工程研究所完成。

材料：

实验动物：3月龄雌性SD大鼠15只，体质量180- 200 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院SPF级动物房。

实验方法：

骨质疏松大鼠模型的建立：15只雌性SD大鼠随机分为骨质疏松组12只和假手术组3只。采用美国 FDA 所推荐大鼠双侧卵巢切除法建立骨质疏松模型，在无菌条件下用水合氯醛麻醉，背部刮毛，俯卧固定在鼠板上，经背侧肋缘下1 cm，脊柱外侧1 cm处分别在两侧做1 cm长纵行切口，分层剥离筋膜肌肉，分离卵巢结扎并切除，假手术组做同样处理，但不结扎切除卵巢。通过全身双能X射线骨密度仪测定确定骨质疏松建模成功。

骨髓间充质干细胞的取材及体外培养：造模后饲养12周处死，无菌条件下分离骨质疏松大鼠双侧胫骨、肱骨，刮除骨膜和软组织，切断两端，分别用10 mL α-MEM培养液冲取其中的骨髓，每3只大鼠骨髓收集于1只离心管中，1 800 r/min，离心10 min，弃上清，每管用10 mL α-MEM培养液(含体积分数为10%胎牛血清)制成细胞悬液，接种于10 cm培养皿中，至于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，3 d后首次换液，9 d后首次传代，获取后每3 d换液，根据细胞生长状况传代。以下实验选用第2-4代骨髓间充质干细胞。

应力加载：真空泵产生负压，拉伸BIOFLEX细胞培养板的弹性孔膜，对黏附于孔膜上的细胞产生张应力，应力方向由孔膜中心向周围，应力大小由孔膜拉伸幅度决定。将细胞以合适的密度接种于BIOFLEX细胞培养板中，培养箱中培养36 h，达到90%汇合，用α-MEM(含体积分数为1%胎牛血清)培养液对细胞进行同步化培养8 h，加力前换为α-MEM(含体积分数为10%胎牛血清)培养液，实验组分别施加5%，10%，15%的应力，每次4 h，每隔8 h加力1次，加力3 d，对照组始终处于静态培养。应变波形选择1/2正弦波，频率为1 Hz。培养液每3 d更换1次。

碱性磷酸酶染色：细胞加力完成后，置于培养箱中静态培养3 h，吸弃培养液，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min。按比例配制BCIP-NBT碱性磷酸酶染色工作液，每孔加入1 mL，避光反应30 min后吸弃。用蒸馏水清洗，光镜下拍照。

细胞骨架染色及图像分析：按5×10⁷ L^-¹的细胞浓度将骨髓间充质干细胞接种到Bioflex细胞培养板，使用α-MEM培养液培养，隔日在显微镜下观察细胞基本贴壁后，更换High-Glucose DMEM(含体积分数为10%胎牛血清)培养液培养，使用High-Glucose DMEM(含体积分数为1%胎牛血清)培养液将细胞同步化培养8 h后换用High-Glucose DMEM(含体积分数为10%胎牛血清)培养液，对照组不予施力，实验组分别施加5%，10%，15%的应力，每次4 h，每隔8 h加力1次，加力3 d。加力结束后静态培养3 h，PBS冲洗3次，加40 g/L多聚甲醛溶液固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min。Triton-X100对细胞进行透化处理5 min后用PBS冲洗3次，每次5 min。使用5 mg/L红色鬼笔环肽室温下孵育1 h，孵育结束后用PBS清洗3次。核DNA显色剂 DAPI 1∶1 000 稀释，用镊子取出盖玻片，细胞面朝下，贴在另一载玻片上，封固。染色完毕的细胞在避光状态下保存，选择合适的激发光和发射光范围在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架并拍照。测定骨髓间充质干细胞面积、长宽比及所选取视野下F-actin的积分吸光度及细胞面积总和，通过后两者的比值测算单位面积上的荧光强度。

主要观察指标：光镜观察细胞排列情况，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架变化情况。使用Image ProPlus 6.0软件测定骨髓间充质干细胞面积、长宽比及所选取视野下F-actin的积分吸光度及细胞面积总和，通过后两者的比值测算单位面积上的荧光强度。

统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以x(_)±s表示。对各组细胞面积、长宽比、视野内细胞面积总和、F-actin积分荧光强度进行方差分析，组间两两比较采用Dunnett检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

当今社会，越来越多的中老年患者为了获得良好咬合而在修复或种植治疗前接受正畸治疗^[1]，另外，因牙周前牙散开美观诉求而选择正畸治疗的中老年患者也不在少数，这之中，相当数量的绝经后妇女患有骨质疏松症^[2-4]。在骨质疏松状态下，影响牙槽骨改建的因素也可影响正畸牙的移动，其过程也会发生相应变化^[5-9]。另一方面，力学刺激是维持骨细胞生存和生长的重要细胞外刺激，在骨骼的发育、形成、改建中起重要的作用。力学刺激下的骨改建是正畸牙移动的基础，而Flexercell细胞张应力加载系统是目前公认的体外加载模型^[10-11]。课题组的前期实验从正畸领域着手研究骨向分化，发现了间歇张应力可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化^[12]；同时，在持续张应力下，骨髓间充质干细胞的早期成骨能力显著提高^[13-14]。

细胞骨架既是维持细胞基本形态的重要结构，也在力学信号的接收和传递中发挥着重要作用^[15]，其中，胞核骨架、细胞骨架及膜整合素受体间的直接连接为力学刺激提供了通路^[16-18]。外力一方面通过细胞骨架再分布，引起纤维束重排；另一方面，与细胞骨架偶联的离子通道通透性及部分受体活性增加，第二信使帮助力学信号传至胞核，调控基因表达^[19-20]。既往实验表明，不同强度的力学刺激可影响细胞形态，改变骨架结构^[21-25]，本实验拟初步探究骨向分化过程中来源于骨质疏松这一病理状态下的大鼠骨髓间充质干细胞骨架的变化，以期了解细胞骨架在该过程中的作用。

碱性磷酸酶活性是反映成骨细胞活性及成骨作用的重要指标。课题组的早期研究显示，间歇性牵张应变可在早期促进大鼠骨髓间充质干细胞的骨向分化^[26-27]；同样，在持续张应力刺激条件下，碱性磷酸酶活性增强，骨髓间充质干细胞的成骨向分化得以促进^[28]。本实验发现，在3种不同力值作用下，骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色活性均较未施力的对照组增加，但以10%力值组增加最为明显。力值过大时，出现排列连续性中断，局部无细胞生长现象，提示适宜的张应力能够促进骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的骨向分化。

激光共聚焦显微镜下所观察到的形态学变化与光镜下相符，力学刺激下，骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞排列基本与受力方向垂直，骨架排列规则。积分吸光度为所测区域内各点吸光度的总和，它与该区域内的阳性物质总的含量有关^[29]，通过软件测量积分吸光度后除以该区域细胞总面积所得积分荧光强度即可反映F-actin的分布。由积分荧光强度可看出，施以外力后，细胞骨架染色较对照组有所加深，其中10%应变组上升最为明显；而15%应变组中，F-actin纤维束出现分布不均的现象，多集中于胞膜处，随加力幅度增加，骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的面积减小，长宽比增加。在10%应变组，这一变化与积分荧光强度增强相对应；在15%应变组，这可能与细胞难以维持原有形态有关。研究同样表明，在间歇性张应力的作用下，细胞形态出现适应性变化^[30]，同时，细胞的凋亡情况产生相应改变。戚孟春等^[21]认为，在短时机械张应力作用下，乳鼠的骨髓间充质干细胞体积变小，肌动蛋白束变细，排列稀疏且紊乱，凋亡现象明显。而Zheng等^[31]则发现，短时张应力对细胞的形态基本不会产生影响，长时张应力作用下，细胞表现出方向的一致性，细胞骨架及蛋白染色都较对照组明显。同时，根据相关研究^[32]，频率1 Hz，幅度10%的张应力最适于成骨相关细胞，这也与本研究所得结果相符。

在间歇张应力作用下，骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞排列较为规律，细胞骨架发生顺应性改建，微丝蛋白F-actin荧光强度增加，碱性磷酸酶活性增强，细胞面积减小，长宽比增加；而在超高强度刺激下，细胞间相互连接被破坏，细胞骨架形态改变，F-actin纤维束分布不均。这表明适宜的机械刺激可改变骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化过程中的骨架结构，然而，F-actin在传导力学信号、促进成骨中的具体机制仍有待进一步探究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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文章快阅

延伸阅读

力学刺激在骨骼的发育、形成、改建中起重要的作用。不同强度的力学刺激可影响细胞形态，改变骨架结构。Liu等^[1]对大鼠成骨样细胞施加1.2、1.6及1.9 Pa不同强度的流体剪切力1 h后发现，细胞整体形态在适宜剪切力作用下沿其长轴伸展，排列方向也变得有序而统一。Li等^[2]使用四点弯曲加力系统对于大鼠成骨样细胞UMR106分别施加强度 1 000、4 000 με，频率0. 5 Hz的压应力，激光共聚焦显微镜观察显示，施以应力的微丝蛋白在15 min因解聚而排列紊乱，但1 h后又发生了重新聚合。与之相应，骨生长矿化过程中关键转录因子c-fos的mRNA表达量于15 min增加了1倍，并在 1 h达到高峰。本研究结果也提示，细胞骨架在成骨细胞机械信号传导过程中发挥重要作用。同时，机械应力能激活多条细胞内信号通路^[3-4]，如丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)^[5-6]、PI3K/Akt通路等、Rho-ROCK信号通路等^[7]，但间歇张应力在骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化过程中诱导细胞骨架重排的具体机制仍待进一步研究。

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间歇张应力对骨质疏松大鼠骨髓基质干细胞骨向分化中细胞骨架的影响

Effect of intermittent tensile stress on cytoskeleton of bone marrow mesenchymal stem cells during osteogenic differentiation in osteoporosis rats

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