慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (32): 5197-5202.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.32.019

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慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞

尹秀茹，裴凌，梁佐迪

中国医科大学附属第一医院，辽宁省沈阳市 110001

收稿日期:2014-06-24 出版日期:2014-08-06 发布日期:2014-09-18
通讯作者: 裴凌，博士，教授，中国医科大学附属第一医院，辽宁省沈阳市 110001
作者简介:尹秀茹，女，1981年生，辽宁省沈阳市人，汉族，2007年中国医科大学毕业，硕士，讲师，主要从事围麻醉期器官保护方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助(81071530)

Lentiviral vector-mediated transfection of bone morphogenetic protein 2 gene into endothelial progenitor cells from rat bone marrow

Yin Xiu-ru, Pei Ling, Liang Zuo-di

First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Received:2014-06-24 Online:2014-08-06 Published:2014-09-18
Contact: Pei Ling, M.D., Professor, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
About author:Yin Xiu-ru, Master, Lecturer, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071530

摘要/Abstract

摘要：

背景：基因治疗已成为疾病治疗的新趋势，为某些难治性疾病带来了曙光，合适的细胞、基因及载体的选择是治疗的关键。
目的：探讨慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞应用于基因治疗的有效性和可行性。
方法：从SD大鼠骨髓分离、培养、鉴定内皮祖细胞，采用构建的慢病毒载体(LV)将空载体(LV-eGFP)或骨形态发生蛋白2基因(LV-eGFP-BMP2)转染至内皮祖细胞，通过eGFP荧光检测转染效率。ELISA法检测上清液中骨形态发生蛋白2蛋白的分泌，Western blot法检测细胞骨形态发生蛋白2蛋白的表达，比较转染后细胞的迁移、增殖和抗凋亡能力。
结果与结论：慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体的转染效率可达90%。与正常内皮祖细胞、转染空载体内皮祖细胞比较，转染骨形态发生蛋白2基因的内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白增加(P < 0.01)，迁移和增殖能力无明显改变(P > 0.05)，肿瘤坏死因子α损伤后的细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)。结果表明慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体可成功转染内皮祖细胞，转染后可增加内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白，增强对炎性损伤的抗凋亡能力，对迁移能力和增殖活性无明显影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 内皮祖细胞, 骨形态发生蛋白2, 慢病毒载体, 基因转染, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Gene therapy has become a new trend for disease therapy and brought promise for some refractory diseases. The key point is to choose the proper cell, gene and vector.
OBJECTIVE: To investigate the effectiveness and feasibility of bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene transfected into endothelial progenitor cells (EPCs) from rat bone marrow for gene therapy.
METHODS: The EPCs were isolated, cultured and identified from the bone marrow of Sprague-Dawley rats. Empty vector (LV-eGFP) or BMP2 gene (LV-eGFP-BMP2) was transferred into EPCs by the constructed lentiviral vector (LV). We examined the transfection efficiency by eGFP fluorescence, BMP2 secretion by ELISA, BMP2 expression by Western blot, and compared the capacities of migration, proliferation and anti-apoptosis after transfection in the three groups of normal EPCs, empty vector-EPCs, and BMP2-EPCs.
RESULTS AND CONCLUSION: The transfection efficiency of lentiviral vector was 90%. BMP2 gene-transferred EPCs secreted and expressed more BMP2 proteins (P < 0.01), and showed enhanced anti-apoptotic ability (P < 0.05). The proliferation and migration capacity did not change obviously (P > 0.05). After successful transfection with lentivirus-BMP2 gene, EPCs can secrete and express more BMP2 protein and show enhanced anti-apoptotic ability without obvious influence on the proliferation and migration capacity.

全文链接：

Key words: endothelial cells, bone morphogenetic proteins, lentivirus, transfection

中图分类号:

R394.2

尹秀茹，裴凌，梁佐迪. 慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(32): 5197-5202.

Yin Xiu-ru, Pei Ling, Liang Zuo-di. Lentiviral vector-mediated transfection of bone morphogenetic protein 2 gene into endothelial progenitor cells from rat bone marrow[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(32): 5197-5202.

图/表（结果） 2

2.1 内皮祖细胞的形态观察和表型、双荧光染色鉴定刚分离出的单个核细胞为小圆形细胞，经培养逐渐出现梭形细胞集落，随后细胞集落逐渐增多，7 d左右细胞呈现典型的鹅卵石形(图1A)。流式细胞仪检测的表型结果为CD34⁺Flk-1⁺CD45^-CD133^-(图1B)，荧光标记示细胞DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色阳性(图1C-E)。所得结果符合内皮祖细胞的特征。

2.2 慢病毒-eGFP-BMP2基因转染内皮祖细胞的荧光观察以MOI值为100转染第3代内皮祖细胞，7 d后分别在倒置相差显微镜和荧光显微镜下观察，随机选取10个视野，计算同一视野下发绿色荧光细胞数和总细胞数比值，可见大部分细胞(转染效率>90%)表达绿色荧光且生长状态良好(图2)。

2.3 骨形态发生蛋白2蛋白分泌与正常内皮祖细胞和空载体转染内皮祖细胞相比，转基因内皮祖细胞上清液中的骨形态发生蛋白2含量明显增加(P < 0.01，见图3)。

2.4 骨形态发生蛋白2蛋白表达与正常内皮祖细胞和空载体转染内皮祖细胞相比，转基因内皮祖细胞的骨形态发生蛋白2蛋白表达明显增加(P < 0.01，见图4)。

2.5 细胞迁移能力与正常内皮祖细胞和空载体转染内皮祖细胞相比，转基因内皮祖细胞的迁移能力无明显变化(P > 0.05，见图5)。

2.6 细胞增殖活性与正常和空载体转染内皮祖细胞比较，转基因内皮祖细胞的增殖活性无明显变化(P > 0.05，见图6)。

2.7 细胞抗凋亡能力流式细胞仪检测结果显示，转基因内皮祖细胞的Annexin V⁺细胞(凋亡细胞)比率为(10.82± 1.32)%，比正常内皮祖细胞(20.39±2.13)%和空载体转染内皮祖细胞(19.87±2.94)%明显减少(P < 0.05)，说明转染骨形态发生蛋白2基因可增强内皮祖细胞的抗凋亡能力(图7)。

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引言

材料方法

设计：细胞形态学和生物学特性观察。

时间及地点：于2013年3月在中国医科大学中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性成年SD大鼠，8-10周龄，体质量220-250 g，由中国医科大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

实验方法：

内皮祖细胞的分离培养和形态观察：大鼠采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，碘伏、体积分数为75%乙醇全身消毒。无菌条件下取四肢长骨，并去除长骨表面肌肉、软骨和结缔组织，以小注射器将骨髓细胞以无菌PBS完全冲洗至无菌离心管，反复吹打均匀。常温离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，底部沉淀细胞以5 mL无菌PBS重悬，吹打均匀。15 mL离心管底部加入Histopaque-1083分离液 5 mL，上层缓缓加入骨髓细胞悬液5 mL。4 ℃离心 (2 000 r/min，30 min)，使细胞分层。吸取中间白色细胞层(单个核细胞)，PBS洗涤两次，每次常温离心(1 000 r/min， 5 min)，弃上清。以含体积分数为10%胎牛血清的EGM-2MV培养液重悬，接种于人纤维连接蛋白预先包被的10 cm培养皿中。37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下孵育箱内培养。48 h后首次换液，对贴壁细胞继续培养。以后每隔48 h换液1次，每日观察细胞的生长形态，继续传代培养，对第3代细胞进行鉴定和基因转染。

慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞实验主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
EGM-2MV培养基	Lonza，瑞士
Histopaque-1083分离液	Sigma，美国
小鼠抗大鼠CD34抗体、小鼠抗大鼠Flk-1抗体、兔抗大鼠CD133抗体、FITC标记的抗大鼠CD45抗体、FITC标记的抗小鼠IgG、PE标记的抗兔IgG	Santa Crutz，美国
DiI-ac-LDL	Invitrogen，美国
FITC-UEA-1	Sigma，美国
LV-eGFP-BMP-2基因载体	上海吉玛公司
MTT	Gibico，美国
PVDF膜	Milipore，美国
Annexin V/Propidium Iodide(PI)试剂盒	北京宝赛生物技术有限公司
骨形态发生蛋白2 ELISA试剂盒	Bio-Swamp，中国
Transwell小室	Corning，美国
高速低温离心机	Eppendorf，美国
CO₂孵育箱	SANYO，日本
超净工作台	苏州净化设备厂
倒置相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜	Olympus，日本
流式细胞仪、酶标仪	BD，美国
凝胶成像仪	Bio-Rad，美国

内皮祖细胞的表型和双荧光染色鉴定：将细胞进行胰酶消化和计数，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹细胞悬液，分别加1 mL至5个EP管中。按说明书浓度在其中的3个管中加入未标记的CD34、CD133、Flk-1抗体，4 ℃孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，加PBS重悬洗涤2次。按说明书浓度在这3个管中加入对应的标记二抗，另外2个管分别加入直接标记的CD45抗体和同型IgG作为对照，4 ℃避光孵育30 min。1 000 r/min离心5 min，加PBS重悬洗涤2次。每管以250 μL PBS重悬后，进行流式细胞仪检测。

根据内皮细胞具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)和结合荆豆凝集素(UEA-1)的特性，对细胞进行DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色，将贴壁细胞用PBS漂洗后置于含DiI-ac-LDL(10 mg/L)的无血清培养液，37 ℃避光孵育4 h。PBS洗涤3次，20 g/L多聚甲醛固定10 min。PBS洗涤3次，加入含FITC-UEA-1 (5 mg/L)的无血清培养液，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗涤3次，加入Hoechst33342复染核5 min。PBS洗涤后缓冲甘油封固，置激光共聚焦显微镜下观察、拍照。

慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染和eGFP荧光检测：采用构建的eGFP标记慢病毒载体，通过预实验确定最佳感染复数(MOI)值。取生长良好的第3代内皮祖细胞，消化后收集于15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min后重悬细胞，种植于6孔细胞培养板，调整细胞密度为5×10⁴/孔，以MOI值为100进行慢病毒介导空载体或骨形态发生蛋白2基因转染，待转染7 d后观察细胞状态，通过eGFP荧光表达情况检测转染效率。

ELISA法检测骨形态发生蛋白2蛋白分泌：分别将转基因第7天的内皮祖细胞、同代正常培养和空载体转染的内皮祖细胞的培养液，1 000 r/min离心20 min，取上清进行检测。ELISA法按说明书操作，分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加入不同浓度的标准品或待测样品100 μL，轻轻晃动混匀，酶标板上覆膜，37 ℃反应120 min。经第一和第二抗体孵育反应后，用酶标仪在450 nm处测量各孔的吸光度值。对标准品中骨形态发生蛋白2蛋白浓度及对应的吸光度值绘制标准曲线，将细胞培养上清液中测得的吸光度值在标准曲线上确定骨形态发生蛋白2蛋白含量。

Western blot检测骨形态发生蛋白2蛋白表达：收集转基因第7天的内皮祖细胞、同代正常培养和空载体转染的内皮祖细胞，加入RIPA裂解液提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育后，用软件ImageJ对反应条带进行半定量分析，记录所测的灰度值。以骨形态发生蛋白2与同组β-actin的灰度值比值表示骨形态发生蛋白2蛋白的相对表达量。

细胞迁移能力检测：消化转基因第7天的内皮祖细胞、同代正常培养和空载体转染的内皮祖细胞，用PBS和无血清培养基先后各洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数并调整细胞浓度为2×10⁷ L^-¹。在Transwell下室加入含体积分数为10%血清的培养基600-800 µL，上室加入100-150 µL细胞悬液，继续在孵箱培养24 h。取出小室，甲醇固定，Giemsa液染色，揭膜封固，显微镜下取5个随机视野计数迁移的细胞数，统计结果。

MTT法检测细胞增殖活性：常规消化转基因第7天的内皮祖细胞、同代正常培养和空载体转染的内皮祖细胞，种植于96孔培养板孵育。分别于培养的第1，2，3，5，7天，吸除培养液，每孔加入MTT溶液20 µL，继续孵育4 h后，终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 µL，振荡10 min。在酶标仪上490 nm波长比色，以单纯培养基调零测定各孔吸光度值。

Annexin V-FITC/ PI双标法检测细胞凋亡：将转基因第7天的内皮祖细胞、同代正常培养和空载体转染的内皮祖细胞接种到24孔板，每孔约10⁵细胞，用质量浓度为10 μg/L的肿瘤坏死因子α孵育24 h，恢复24 h。消化细胞，收集细胞悬液至15 mL离心管中，室温离心1 000 r/min，5 min。用4 ℃ PBS洗2次后，悬浮于200 μL染色缓冲液中。加入10 μL FITC标记的Annexin V，轻轻混匀，4 ℃避光反应15- 20 min，置于冰上，送流式检测。上机前5 min，加入300 μL染色缓冲液，轻轻混匀，加入5 μL PI避光。将细胞悬液转至流式检测管中，上机检测。结果以Annexin V⁺细胞作为凋亡细胞进行统计，计算细胞凋亡率。

主要观察指标：①内皮祖细胞转染骨形态发生蛋白2基因后骨形态发生蛋白2蛋白的分泌和表达。②检测骨形态发生蛋白2基因转染对内皮祖细胞迁移、增殖和抗凋亡能力的影响。

统计学分析：数据采用x(_)±s表示，SPSS 16.0软件进行组间比较的单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

内皮祖细胞存在于骨髓或外周血中，具有在炎症、缺血、肿瘤等环境下受某些趋化因子影响向损伤部位归巢的特性，分泌对损伤的内皮细胞具有修复作用的细胞因子，并可衍生为成熟的内皮细胞，通过分泌和分化两方面作用生成新的微血管，改善局部微循环^[13]。但是在机体的某些病理状态下，例如在糖尿病时内皮祖细胞的功能会受到损害^[14]。内皮祖细胞经基因修饰后不仅可以增强自身功能，并可以作为基因治疗的靶细胞，把产生的治疗蛋白带到损伤部位，共同起到治疗效果。骨形态发生蛋白2对于干细胞正常功能的维持具有重要作用。研究发现经骨形态发生蛋白2处理后的干细胞增殖和造血能力增强^[15]，并且可诱导内皮祖细胞趋化^[16]、促进内皮祖细胞生成血管^[17]，并利于内皮细胞存活^[18]。由此推测骨形态发生蛋白2可成为有益于内皮祖细胞的候选治疗基因之一。

目前，用于基因治疗的载体按来源可分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体的转染效率高，但细胞毒性和免疫原性限制了其应用，而以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒为代表的慢病毒载体，与通常使用的反转录病毒载体和腺病毒载体比较，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、携带基因片段容量大、不易诱发宿主免疫反应、长期稳定表达目的基因等优点^[19]。正是基于以上特点，本实验采用了慢病毒介导的基因转染。

本实验从大鼠骨髓中分离培养出内皮祖细胞并成功进行了慢病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染，发现转染骨形态发生蛋白2基因的内皮祖细胞可分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白，骨形态发生蛋白2基因可增强内皮祖细胞的抗凋亡能力，不影响其增殖和迁移能力。但以往有研究得出骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞的增殖能力增强^[20]，分析其原因可能与干细胞不同的生物学特性和分化方向有关。

综上所述，慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染后的内皮祖细胞抗凋亡能力增强，为相关疾病的治疗奠定了理论基础，但其具体机制及体内应用有待于进一步研究探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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