间充质干细胞移植修复炎性肠组织过程中的主导基因筛选

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.021

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (28): 4555-4562.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.021

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间充质干细胞移植修复炎性肠组织过程中的主导基因筛选

曹燕雯¹，魏亚明²，李瑜元¹，聂玉强¹，吴倩¹

广州医学院附属广州市第一人民医院，¹消化科，广州市临床医学研究所，²输血科，广东省广州市 510180

出版日期:2014-07-02 发布日期:2014-07-02
通讯作者: 魏亚明，博士后，主任医师，广州医学院附属广州市第一人民医院输血科，广东省广州市 510180
作者简介:曹燕雯，女，1986年生，广东省广州市人，汉族，2013年广州医科大学毕业，硕士，主要从事炎症性肠病方面研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81070385)；留学回国人员科研启动基因(教外司留{2012}940号)；广州市重大民生专项基金(201300000100)

Screening main genes during mesenchymal stem cell transplantation in repair of inflammatory bowel tissue

Cao Yan-wen¹, Wei Ya-ming², Li Yu-yuan¹, Nie Yu-qiang¹, Wu Qian¹

¹Department of Gastroenterology, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou Municipal Clinical Medical Institute, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China; ²Department of Blood Transfusion, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China

Online:2014-07-02 Published:2014-07-02
Contact: Wei Ya-ming, M.D., Chief physician, Department of Blood Transfusion, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
About author:Cao Yan-wen, Master, Department of Gastroenterology, Guangzhou First People’s Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou Municipal Clinical Medical Institute, Guangzhou 510180, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070385; the Scientific Research Project of Returned Overseas Students (Jiaowaisiliu 2012), No. 940; the Major People’s Livelihood Project of Guangzhou City, No. 201300000100

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究已证明间充质干细胞可定植于炎症性肠黏膜修复炎症性肠组织。
目的：应用表达谱芯片技术研究间充质干细胞移植修复前后大鼠炎症性大肠组织的差异基因表达情况，初步揭示与间充质干细胞定植、分化、修复炎症性肠组织过程相关的主导基因。
方法：健康SD大鼠随机分为2组：移植实验组用三硝基苯磺酸灌肠制作炎症性肠病模型，造模后24 h经尾静脉注入绿色荧光蛋白标记的间充质干细胞；对照组以生理盐水代替三硝基苯磺酸同法灌肠处理。于移植后28 d取移植实验组和对照组大肠组织，利用基因芯片技术筛选移植实验组和对照组的差异表达基因。
结果与结论：对照组和移植实验组大肠组织全基因组表达谱芯片结果有差异性表达的基因共388个(P < 0.05，FC>2)，其中表达上调基因191个、表达下调基因197个，主要与炎症反应、免疫反应和细胞分化3个方面有关。前10位显著上调和下调的差异基因(共20条)中，与炎症反应相关的有3个，与免疫反应相关的有3个，与干细胞分化相关的有2个。388个差异基因主要涉及33条信号通路(P < 0.05)，其中与炎症反应相关的有6条，与免疫反应相关的有8条，与干细胞分化相关的有5条。结果可见利用全基因组表达谱基因芯片的方法初步筛选了间充质干细胞修复炎症性肠组织的主要相关基因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 炎症性肠病, 间充质干细胞, 表达谱基因芯片, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have verified that mesenchymal stem cells could be transplanted into inflammatory bowel mucosa to repair inflammatory bowel tissue.
OBJECTIVE: To observe the differential gene expression in large intestine before and after mesenchymal stem cell transplantation in repair of inflammatory bowel tissue of rats using microarray technology, and to primarily discover the main genes during mesenchymal stem cell transplantation, differentiation, and reparation in inflammatory colorectal tissue region.
METHODS: Healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups. Experimental rat models of inflammatory bowel disease were established using trinitrobenzene sulfonic acid via enema. At 24 hours after model establishment, green fluorescent protein-labeled mesenchymal stem cells were infused via the caudal vein. The control group was treated with physiological saline by enema, instead of trinitrobenzene sulfonic acid. At 28 days, large intestine was obtained from the experimental group and control group. Differentially expressed genes were screened in the experimental and control groups using microarray technique.
RESULTS AND CONCLUSION: The microarray analysis results showed that there were 388 differential genes in the control and experimental groups (P < 0.05, FC > 2), in which 191 were up-expressed, and 197 were down-expressed. All of these genes were mainly involved in inflammatory reaction, immune reaction and cell differentiation. In the top 10 up-regulation and down-regulation differential genes (totally 20 genes), 3 genes were involved in inflammation, 3 genes were involved in immune reaction, and 2 genes were related to stem cell differentiation. In the 388 genes, 33 were related to signaling pathways (P < 0.05), 6 related to inflammation, 8 related to immunity, and 5 related to stem cell differentiation. Results suggested that the main genes involved in mesenchymal stem cells in repair of inflammatory bowel tissue were primarily screened using gene expression microarray technique.

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Key words: mesenchymal stem cell transplantation, Crohn disease, intestine, large, gene expression profiling, microchip analytical procedures

中图分类号:

R394.2

曹燕雯，魏亚明，李瑜元，聂玉强，吴倩. 间充质干细胞移植修复炎性肠组织过程中的主导基因筛选[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4555-4562.

Cao Yan-wen, Wei Ya-ming, Li Yu-yuan, Nie Yu-qiang, Wu Qian. Screening main genes during mesenchymal stem cell transplantation in repair of inflammatory bowel tissue[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4555-4562.

图/表（结果） 7

2.1 移植实验组和对照组大肠组织观察普通光镜下对照组肠黏膜正常，未见溃疡、炎症(图2A)。三硝基苯磺酸造模后可见大肠肠腔扩张，肠壁明显充血、水肿、糜烂、坏死和多发溃疡形成，有点状出血和片状出血，多呈节段性，部分肠管增厚，肠腔狭窄，部分溃疡点几近穿孔，与人类克罗恩病肠道表现相似(图2B)。间充质干细胞移植后的移植实验组在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白标记的间充质干细胞在大肠上皮内定植情况良好，从隐窝基底部到隐窝顶部肠腔都有分布。间充质干细胞移植后病变肠黏膜轻度充血、溃疡较少，炎症较轻(图2C)。

2.2 基因筛选结果全基因组表达谱芯片结果显示所测样品数据趋势集中及样品重复性良好(图3A，B)，取P < 0.05，FC>2为筛选基因的条件时，正常大肠组织和间充质干细胞移植后炎症性肠病大肠组织差异性表达基因共388个，其中上调基因191个，下调基因197个(图3C)，主要涉及炎症反应、免疫反应和细胞分化3个方面。前10位显著上调和下调的差异基因(表1，2)，与炎症反应相关的有3个，与免疫反应相关的有3个，与干细胞分化相关的有2个。

2.3 聚类分析结果将移植实验组和对照组得到的191个上调基因和197个下调基因分别进行聚类分析，聚类分析后的聚类热图如图4所示，移植实验组样本之间和对照组样本之间基因表达的重复性好，且移植实验组和对照组基因表达差异明显。

2.4 GO基因富集分析结果利用GO富集功能分析法把具有相同或相似功能的基因归为一类，富集度检验P < 0.05为差异有显著性意义。得出的388个差异基因，分别对上调和下调的差异基因进行GO分析，涉及分子结构、细胞结构形成和生物学过程3个方面(图5)。

2.5 信号通路分析注释筛选的388个差异基因后，对差异基因可能的分子信号通路进行分析，发现主要涉及炎症反应、免疫反应和细胞分化3个方面，其中与炎症反应相关的有6条，这主要与三硝基苯磺酸造模有关。与免疫反应相关的有8条，与干细胞分化相关的有5条，它们可能与间充质干细胞修复炎症性肠上皮有密切关系，筛选条件为P < 0.05(表3)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年9月至2013年3月在广州市第一人民医院消化实验室完成。

材料：

间充质干细胞：来自于美国Cyagen Biosciences Inc.用病毒转染的稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的SD大鼠间充质干细胞(第6代)(图1)，培养于含体积分数为10%胎牛血清的GIBCO L-DMEM培养基中。

实验动物：健康SD大鼠8只，8周龄，体质量180-200 g，由广东省实验动物中心提供。

实验方法：

SD大鼠炎症性肠病模型造模方法：8只大鼠随机分为两组，每组4只。移植实验组：用乙醚将动物麻醉后，参照Hollenbach的方法^[18]，将一直径约2.0 mm、长约20 cm的橡胶输液管，由肛门轻缓插入约8 cm，每只各用注射器推入含20 mg三硝基苯磺酸(TNBS)的体积分数为50%乙醇溶液1.0 mL，灌肠完毕后将动物倒立1 min。对照组：以1.0 mL生理盐水代替三硝基苯磺酸溶液同法灌肠处理。两组各取1只大鼠于灌肠后7 d处死，取大肠组织观察造模情况。移植实验组大鼠于造模后24 h后经尾静脉注射绿色荧光蛋白标记的间充质干细胞，移植后第28天处死大鼠，取炎症段大肠组织。

冰冻切片观察：常规制片，苏木精-伊红染色，普通光镜及荧光显微镜下观察。

表达谱基因芯片：从-80 ℃冰箱中取出移植实验组和对照组大肠组织标本50 mg，液氮下研磨，使用Trizol提取总RNA，然后纯化总RNA，琼脂糖凝胶电泳进行完整性分析，Nanodrop ND-100核酸蛋白检测仪对总RNA进行质量检测。将提取后的总RNA反转录合成双链cDNA，用RNase A纯化cDNA。然后用Cy3标记cDNA，标记后的cDNA经纯化后进行杂交和洗脱后，芯片用Axon GenePix 400B基因芯片扫描仪扫描。

差异基因的筛选：对移植实验组及对照组大肠组织进行全基因组表达谱芯片的扫描，将数据信息导入NimbleScan v2.6软件，采用quantile方法和RMA算法对原始数据进行标准化处理。用Agilent GeneSpring GX 11.5.1软件进行数据分析，箱线图和散点图分析样品数据总体分布集中趋势，取P < 0.05，FC>2为筛选条件，通过火山图过滤出差异基因，采用层次式聚类法对所得差异基因进行聚类分析。利用基因本体(GO)数据库分析差异基因功能学分类，取P < 0.05为差异有显著性意义。KEGG Pathway数据库分析差异基因相关信号通路(P < 0.05)。

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讨论

通过基因芯片技术检测一系列组织或细胞中的表达谱，可揭示个体间，或疾病与正常组织中基因表达差异的情况，这是筛选疾病和正常组织之间、不同疾病之间或不同状态的细胞间基因表达水平差异的重要手段^[19-21]。间充质干细胞是具有多项分化潜能的干细胞，移植间充质干细胞治疗炎症性肠病是新兴的治疗方法，是近年来炎症性肠病治疗领域的研究热点。回顾性分析1993至2007年白血病并发炎症性肠病的20例患者，自体干细胞移植3例，异体干细胞移植17例，16例于随访期内获长期缓解^[9-13]。陈隆典等^[22]应用自体造血干细胞移植治疗9例糖皮质激素及免疫抑制剂治疗无效的克罗恩病患者及1例Truelove临床重型溃疡性结肠炎患者，移植后3个月和12个月时分别有5例和1例患者克罗恩病活动指数<150(完全缓解)，2例术后克罗恩病活动指数分值下降但未达缓解标准；完全缓解者症状消失，血液检查指标正常，体质量明显增加(5-20 kg)，平均随访16.1个月，复发4例，除1例病情严重外，余均较术前病情减轻；5例患者获长期缓解，1例克罗恩病患者术后10个月无复发症状，血液检查指标均正常，但肠镜复查示无明显改善。与自体造血干细胞移植治疗相关的并发症有干细胞回输期间与白细胞减少相关的发热及感染、术后脱发，1例乙型肝炎病毒(HBV)携带者术后转氨酶水平及HBV-DNA滴度增高。结果表明自体造血干细胞移植可改善其他方法治疗无效的难治性炎症性肠病，近期疗效满意，部分患者可获较长期的缓解，治疗期间无严重不良反应，但不能阻止病情复发，且不能改善患者肠道病理改变。He等^[21]的研究证明，间充质干细胞移植后的炎症性肠病小鼠临床症状、病理组织学改变都比非间充质干细胞移植组好转。课题组前期研究已证实间充质干细胞可定植于大鼠大肠炎症损伤区域并修复损伤肠黏膜，植入间充质干细胞分布于从隐窝基底部到隐窝顶部肠腔，具有上皮细胞形态。但间充质干细胞是如何修复炎症性肠组织的，哪些基因在修复过程中发挥了作用，哪些基因在间充质干细胞分化为肠上皮过程起作用，目前还不完全清楚。本实验利用涵盖26 000多个大鼠基因的表达谱基因芯片，筛选与间充质干细胞定植、分化、修复炎症性肠组织相关的特异性主导基因。

在通过比较对照组和移植实验组基因芯片检测结果，取P < 0.05，FC>2为筛选条件时，发现388个差异表达基因，其中上调基因191个，下调基因197个，用KEGG数据库分析预测这388个差异基因主要涉及33条信号通路，这些差异基因及细胞信号通路涉及细胞炎症、细胞黏附、移植物抗宿主反应、同种异体移植物排斥、IgA相关肠道免疫屏障、细胞分化等生物过程，归纳起来主要与炎症反应、免疫反应和细胞分化3方面相关，说明间充质干细胞修复炎症性肠组织主要表现在间充质干细胞具有向肠上皮细胞分化补充受损肠上皮细胞的能力，而且还能调节免疫及炎症反应，与此同时还显示出对以炎症持续存在为特点的治疗潜能。

继续对这些差异表达的基因在pubmed和Gene Card数据库中对上调10位和下调10位的基因进行分析，其中与炎症反应相关的基因有3个，与免疫反应相关的基因有3个，与干细胞分化相关的基因有2个。炎症反应相关基因Mcpt1是已知的与炎症性肠病相关的细胞标记^[23-25]，在大鼠炎症肠组织中Mcpt2表达也升高^[26-29]；线虫感染后胃肠道的Gcnt表达升高^[30]。免疫反应相关基因中IgJ表达升高，存在于二聚体分泌型IgA和五聚体IgM中，与B细胞发育、成熟有关，在炎症性肠病或间充质干细胞修复炎症性肠组织中尚未见报道；Ighg，免疫球蛋白重链，参与免疫球蛋白重链γ的合成，构成IgG。基因Rnf125编码蛋白是一种泛素化连接酶，与天然免疫相关^[31]，降低Rnf125的表达可促进天然免疫反应^[32]。与干细胞分化相关的Olfm4基因在线粒体、细胞核和细胞膜上都有表达，主要分布在胃肠道(胃、小肠和结肠)、前列腺及骨髓^[33-37]。Olfm4可通过影响Notch信号通路来调节干细胞的分化，参与促进间充质干细胞向肠上皮细胞的分化^[38]。Fabp1基因已被证实在炎症性肠病中表达升高^[39]，有实验已证实在小鼠肠干细胞分化的过程中，Fabp1表达升高，提示Fabp1可能是肠干细胞分化成熟的标志^[40]。

间充质干细胞修复炎症性肠组织与多种分子功能基因或生物过程相关。间充质干细胞移植修复炎症性肠上皮涉及的基因属于不同信号系统，参与多条细胞信号通路的调控，因此深入研究这些信号传导通路的变化对阐明间充质干细胞修复肠组织的分子机制有重要的理论指导意义。对照组和移植实验组的差异基因主要涉及33条信号通路，其中与炎症反应相关的有6条，与免疫反应相关的有8条，与干细胞分化相关的有5条。金黄色葡萄球菌感染、白细胞迁移等信号通路都提示了间充质干细胞可在炎症环境下定植于肠黏膜，并修复受损肠组织。与免疫反应相关的通路中移植物抗宿主、同种异体移植物排斥、自然杀伤细胞的细胞毒作用等信号通路受抑制，IgA组成的肠道免疫信号通路上调，反应了间充质干细胞的免疫调节能力，间充质干细胞是天然免疫系统的有效调节细胞，抑制免疫排斥反应，促进免疫修复。5条与细胞分化相关的信号通路中，Notch信号通路已报道参与间充质干细胞向肠上皮细胞分化过程。其余4条信号通路与间充质干细胞分化相关，但是在间充质干细胞向肠上皮细胞分化的表达情况尚未有报道。P53信号通路参与细胞周期的调节、细胞的衰老和凋亡，已证实炎症性肠上皮细胞P53信号通路活性增加^[41]，而且相关研究表明P53信号通路与间充质干细胞分化相关，Lo Furno等^[42]发现间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中P53信号通路活性降低。MAPK信号通路可将细胞外刺激信号转导至细胞及核内，调控细胞增殖、分化、有丝分裂过程，激活MAPK信号通路可促进间充质干细胞向脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞分化^[43]。PPAR信号通路主要调节能量代谢、细胞生长、分化和凋亡，可促进间充质干细胞分化为脂肪细胞、骨细胞^[44]。间充质干细胞可分化为破骨细胞，而且破骨细胞分化信号通路的P38基因可影响MAPK信号通路的表达。这些信号通路可能参与间充质干细胞跨系分化修复炎症肠组织过程，并相互影响共同构成间充质干细胞修复炎症肠组织过程复杂变化的调控网络。

利用基因芯片技术高通量、快速、灵敏、平行性高的特点，可以便捷地筛选间充质干细胞修复炎症性肠组织过程中的相关主导基因，为深入研究间充质干细胞治疗炎症性肠病相关信号通路中调控基因之间的相互作用缩小了研究范围，以便为间充质干细胞用于临床治疗炎症性肠病提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
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[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
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[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.