小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (28): 4535-4541.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.018

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小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定

张鉴清¹，季佳霖²，崔新明²，张祺³，李艳茹²

¹吉林大学第四医院，吉林省长春市 130011；²吉林大学病理生物学教育部重点实验室，吉林大学基础医学院病理学系，吉林省长春市 130021；³吉林大学，吉林省长春市 130021

出版日期:2014-07-02 发布日期:2014-07-02
通讯作者: 李艳茹，副教授，硕士生导师，吉林大学病理生物学教育部重点实验室，吉林大学基础医学院病理学系，吉林省长春市 130021
作者简介:张鉴清，男，1972年生，吉林省舒兰市人，汉族，副主任医师，主要从事手足外科的临床研究工作。
基金资助:
吉林省科技发展计划青年科研基金资助项目(20090192)

Isolation, culture and identification of adipose-derived stem cells from mouse epididymis

Zhang Jian-qing¹, Ji Jia-lin², Cui Xin-ming², Zhang Qi³, Li Yan-ru²

¹ the Fourth Hospital of Jilin University, Changchun 130011, Jilin Province, China;² the Key Laboratory of Pathobiology of Ministry of Education, Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; ³Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

Online:2014-07-02 Published:2014-07-02
Contact: Li Yan-ru, Associate professor, Master’s supervisor, the Key Laboratory of Pathobiology of Ministry of Education, Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
About author:Zhang Jian-qing, Associate chief physician, the Fourth Hospital of Jilin University, Changchun 130011, Jilin Province, China
Supported by:
the Youth Scientific Research Program of Science and Technology Development Plan of Jilin Province, No. 20090192

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞作为一种新的成体干细胞，具有来源丰富、取材容易、增殖能力强等优点，受到人们越来越多地关注。
目的：体外分离培养小鼠附睾脂肪组织中的脂肪干细胞，并鉴定其生物学特性。
方法：无菌切取小鼠附睾处脂肪组织，采用胶原酶进行消化，利用1次消化多次收集与差速贴壁法分离纯化脂肪干细胞。倒置显微镜及透射电子显微镜观察脂肪干细胞的形态。绘制脂肪干细胞的生长曲线。流式细胞术检测脂肪干细胞的免疫表型。加入细胞诱导剂对脂肪干细胞进行成骨及成脂肪的诱导分化。扫描电子显微镜观察脂肪干细胞与胶原支架材料的相容性。
结果与结论：倒置显微镜下可见脂肪干细胞呈长梭形或成纤维细胞样，密集排列成漩涡状或成束状交织，可在体外稳定传至第9代。透射电子显微镜下可见脂肪干细胞表面有丰富的微绒毛结构，细胞核体积大，细胞质内可见线粒体、粗面内质网等细胞器。脂肪干细胞表达CD44、CD29，不表达CD34。经成脂肪诱导剂诱导后，多数脂肪干细胞胞质内可见小脂滴，油红O染色可将小脂滴染成红色。经成骨诱导剂诱导后，在脂肪干细胞生长密集区域内的细胞结构模糊、细胞间界限不清楚。经茜素红染色后，可见较多大小不一的折光率较强颗粒状结构沉积。扫描电子显微镜观察到脂肪干细胞呈铺展状生长于胶原支架材料上。结果表明该方法分离出的脂肪干细胞能在体外扩增并稳定传代，在一定诱导条件下，能够分化为成骨细胞和脂肪细胞并且与胶原支架具有良好的相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 小鼠, 附睾, 脂肪组织, 差速贴壁, 培养

Abstract:

BACKGROUND: As a new kind of adult stem cells, adipose-derived stem cells get more and more attention, because of rich source, drawing materials easily and powerful proliferation.
OBJECTIVE: To isolate and culture adipose-derived stem cells from the epididymal adipose tissue in mice, and to identify their biological characteristics.
METHODS: Adipose tissue was obtained from epididymis in mice by aseptically cutting. The tissue was digested using collagenase. Adipose-derived stem cells were separated and purified by using one digestion, multiple collection method and differential adhesion method. The morphology of adipose-derived stem cells was observed using inverted microscopy and transmission electron microscopy. Growth curve of adipose-derived stem cells was drawn. Immunophenotype of adipose-derived stem cells was identified by flow cytometry. Adipose-derived stem cells were induced to differentiate into adipocytes and osteocytes using cell inductors. Compatibility of adipose-derived stem cells and collagen scaffold material was observed using scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells exhibited long spindle-like or fibroblast-like appearance, grew intensively and arranged in scroll and fascicular shape. In vitro, adipose-derived stem cells could be passaged to passage 9 under the inverted microscope. Under the transmission electron microscope, adipose-derived stem cells showed abundant microvilli on the cell surface. The nuclei were big in size. Some organelles were seen in cytoplasma, such as mitochondria and rough endoplasmic reticulum. Adipose-derived stem cells expressed CD44 and CD29, did not express CD34. After inducing by inductor, many small lipid droplets were seen in the cytoplasm of adipose-derived stem cells. The small lipid droplets were dyed red with oil red O. After induction of osteogenic inductor, the boundary line among adipose-derived stem cells was not clear and the structure of cells was fuzzy in the growth-intensive areas. There were many strong refractive granular material deposits at that field after dyeing with alizarin red. Scanning electron microscope revealed that adipose-derived stem cells were spread on the collagen scaffold. Results suggested that adipose-derived stem cells isolated by this method could amplify in vitro and stably subcultured. Under a certain inducing condition, adipose-derived stem cells could differentiate into osteoblasts and adipocytes, which showed a good compatibility with collagen scaffold.

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Key words: stem cells, adipose tissue, epididymis, mice, inbred BALB C, cells, cultured

中图分类号:

R394.2

张鉴清，季佳霖，崔新明，张祺，李艳茹. 小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4535-4541.

Zhang Jian-qing, Ji Jia-lin, Cui Xin-ming, Zhang Qi, Li Yan-ru. Isolation, culture and identification of adipose-derived stem cells from mouse epididymis [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4535-4541.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪干细胞的形态学观察原代培养细胞贴壁后伸展成长梭形或成纤维样，2 d后细胞扩增速度加快，呈密集生长。6 d时，细胞可达到80%以上融合状态。传代培养细胞的生长速度较原代细胞略快，至第9代细胞仍旧保持长梭形，密集排列成漩涡状或成束状交织(图1)。

2.2 脂肪干细胞的超微结构特点第3代脂肪干细胞体积大，多呈圆形、椭圆形或略不规则形。细胞表面可见丰富的微绒毛结构。细胞核体积大，多居中，呈圆形或长椭圆形，核膜结构清晰，有的细胞核可见核切迹，核仁大而明显。细胞质内可见线粒体、粗面内质网等细胞器。线粒体嵴结构清晰，粗面内质网较多，呈中度扩张(图2)。

2.3 脂肪干细胞的生长动力学第3，6，9代细胞生长曲线均呈S形，细胞在接种后最初2 d处于生长潜伏期，在第3-5天处于指数生长期，6 d达到峰值，以后细胞生长速度减慢，进入生长平台期，符合细胞生长周期(图3)。

2.4 脂肪干细胞的免疫表型检测利用流式细胞术检测脂肪干细胞表面标志，结果显示第4代脂肪干细胞表面CD44表达为71.33%，CD29表达为99.7%，而CD34表达仅为5.84%(图4)。

2.5 脂肪干细胞的成脂肪分化经成脂肪诱导液培养1周后，可在多数脂肪干细胞胞质内见到圆形的小脂滴，有些小脂滴可相互融合成较大的脂滴。经过油红O染色后，脂滴可被染成红色(图5A，B)。

2.6 脂肪干细胞的成骨分化经成骨诱导液培养2周后，在脂肪干细胞生长密集的区域内可见很多细胞间界限不清楚、细胞结构模糊，在该部位可见折光率较强的颗粒状物质沉积。经茜素红染色后，可见较多大小不一的颗粒状结构(图5C，D)。

2.7 脂肪干细胞与胶原支架材料的相容性鼠尾胶原支架为白色海绵状。扫描电子显微镜下可见胶原支架呈多孔网状结构，脂肪干细胞附着于支架上生长，细胞铺展好，有核部分突出(图6)。

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引言

组织工程学是生物医学工程学中的新的分支，是应用生命科学和工程学的原理与技术，设计、构造、改良、培育和保养活组织，以修复或重建组织器官的结构，维持或改善组织器官功能的一门新兴的边缘学科。组织工程学中最主要的研究内容包括：种子细胞、供种子细胞生长的支架材料以及调节种子细胞生长分化的相关因子。其中，种子细胞作为组织工程学的基础，一直是人们重点研究的内容。干细胞因其具有自我更新及多向分化潜能而成为种子细胞的最主要来源。根据不同来源及分化阶段，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类^[1]。尽管胚胎干细胞具有分化为多种不同组织的能力，但伦理上存在的争议限制了其应用。成体干细胞因具有来源广泛、增殖能力强、可向多种成熟细胞分化，并且在使用上不受伦理道德局限等特点，现在已经成为组织工程学研究的首选种子细胞。

成体干细胞的种类较多，如：骨髓间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、毛囊干细胞等。其中骨髓间充质干细胞作为种子细胞已经被广泛应用于体内及体外实验中。但是人们在应用过程中发现骨髓间充质干细胞的取材较困难，每次取材的细胞数量有限，患者也比较痛苦。脂肪干细胞作为组织工程修复的种子细胞，因其具有来源丰富、取材容易、增殖能力强等优点，正受到越来越多的关注。

脂肪干细胞是在2001年被发现的。Zuk等^[2]从抽脂术中取材的脂肪组织悬液中分离了一种具有多向分化能力的干细胞，命名为Processed Lipoaspirate (PLA)。这种细胞的形态类似成纤维细胞，具有较强的增殖能力。在一定的诱导条件下，该细胞可以向脂肪细胞^[2]、成骨细胞^[2-3]、软骨细胞^[4-5]、内皮细胞^[6-8]、肌腱细胞^[9-10]、心肌细胞^[11-13]、上皮细胞^[14-15]、肝细胞样细胞^[16-18]、许旺细胞分化^[19-20]，具有多向分化潜能。

本实验采用一次消化多次收集与差速贴壁法分离小鼠附睾处脂肪组织中的脂肪干细胞，并对其进行生物学功能的鉴定，为今后以小鼠为对象的脂肪干细胞相关研究提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2011年5至12月在吉林大学病理生物学教育部重点实验室完成。

材料：

实验动物：雄性BALB/c小鼠，体质量16-18 g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK (吉)-2007-0003。

实验方法：

小鼠脂肪干细胞的分离培养：颈椎脱臼法处死小鼠，体积分数为75%乙醇浸泡消毒15 min。无菌条件下平行切双侧附睾脂肪。用含青霉素、链霉素各100 U/mL的PBS反复冲洗3次后，再用PBS清洗3次。在体式显微镜下仔细去除血管、脂肪筋膜、结缔组织等，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块。置入2倍体积含0.1%Ⅰ型胶原酶中，37 ℃水浴消化，每隔5 min摇晃1次。30 min后1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，将沉淀用含血清培养液悬起，剩余液体继续消化15 min，收集沉淀，剩余液体继续消化15 min。当观察到组织呈云雾状或乳糜状时，加入等量含血清培养液终止消化，以200目细胞筛网过滤除去未消化组织。1 000 r/min离心10 min。PBS漂洗2次，离心去上清。用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基轻轻吹打成单细胞悬液，接种于6孔培养皿中，放于CO₂孵育箱中( 37 ℃、体积分数为5%CO₂、95%湿度)培养。48 h后首次换液，除去未贴壁细胞及细胞碎片，随后两，三天换液1次，每日在倒置显微镜下观察、记录。待细胞生长融合达80%-90%时，经胰蛋白酶消化后，以1∶3进行传代培养。

小鼠脂肪干细胞生长动力学检测：分别取第3，6，9代细胞，经胰蛋白酶消化后计数，调整细胞密度为1×10⁴/孔，接种于24孔板中，每天取3个复孔进行计数，绘制生长曲线。细胞倍增时间(tD) =0.301t/logNt-logNo，t为细胞培养时间(h)，No代表接种细胞数，Nt代表t小时的细胞数。

小鼠脂肪干细胞超微结构观察：收集小鼠第3代脂肪干细胞，PBS清洗后，1 000 r/min离心5 min成团，戊二醛和锇酸双重固定，乙醇、丙酮系列脱水，环氧丙烷置换，环氧丙烷∶环氧树脂(1∶1)浸透，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重电子染色，透射电镜下观察。

小鼠脂肪干细胞免疫表型的流式细胞术检测：收集第4代小鼠脂肪干细胞，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS重悬清洗2遍，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，分别加入兔抗鼠CD29、CD44、CD34抗体，室温避光孵育1 h，PBS清洗后，流式细胞仪检测。

小鼠脂肪干细胞成脂肪诱导分化及鉴定：取第4代脂肪干细胞接种于24孔板中，每孔为1×10⁴个细胞，加入成脂诱导液(DMEM/F12、青霉素、链霉素各100 U/mL、地塞米松 0.25 μmol/L、胰岛素10 mg/L、吲哚美辛0.2 mmol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol/L)。诱导1周，每隔2 d进行2/3换液，油红O染色，显微镜观察。

小鼠脂肪干细胞成骨诱导分化及鉴定：取第4代脂肪干细胞接种于24孔板中，每孔为1×10⁴个细胞，待细胞融合至60%时，加入成骨诱导液(DMEM/F12、青霉素、链霉素各100 U/mL、地塞米松 10^-⁸ mol/L、L-抗坏血酸/维生素C 0.2 mmol/L、β-磷酸甘油钠 10 mmol/L)。诱导2周，每隔 2 d进行2/3换液。茜素红染色，显微镜观察。

鼠尾胶原的制备：SD大白鼠鼠尾，体积分数为75%乙醇浸泡30 min。将鼠尾剪成小段，抽出银色的尾键，剪碎尾键，放于0.1%无菌醋酸中，全温振荡机4 ℃振荡，48 h后取上清，10 000 r/min，离心30 min，取上清。用NaHCO₃调节pH至7.2-7.4。

小鼠脂肪干细胞与胶原支架的相容性检测：将提取的鼠尾胶原置于培养皿中，-80 ℃冰箱过夜，放入真空冻干机中抽真空24 h，待胶原变为白色海绵状为宜。将胶原支架置于体积分数为75%乙醇中消毒30 min，将第3代脂肪干细胞(2×10⁸ L^-¹)轻铺于支架上，每天换液，10 d后扫描电镜下观察脂肪干细胞与胶原支架的相容性。

主要观察指标： ①脂肪干细胞的形态学、体外增殖传代能力、免疫表型的检测结果。②脂肪干细胞成脂及成骨分化鉴定。③脂肪干细胞与胶原支架材料的相容性。

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讨论

脂肪干细胞由于其取材方便，容易扩增，已经成为人们关注的组织工程的种子细胞。关于脂肪干细胞的动物实验多集中于大鼠^[21-24]、兔子^[25-28]、小鼠^[29-30]。但是，关于小鼠附睾脂肪干细胞的分离及培养方法的报道却不常见。资料显示，动物模型中使用最多的动物是小鼠。虽然小鼠和人类在体型大小和形态上差别很大，但在生物进化上却非常接近。小鼠和人类的基因组有99%以上的基因都是同源的^[31]。而且与其他动物相比，小鼠的品系繁多，因此，小鼠特别适合用于动物实验。作者采用6-8周BALB/c雄性小鼠作为实验动物，以附睾处的脂肪组织为研究对象。尽管小鼠的许多部位都可以获取脂肪组织，如背部及腹部皮下、腹股沟、附睾和肠系膜等处^[32-33]。以取材容易及提取干细胞的数量多为原则，选择了附睾处的脂肪组织。

在利用酶消化脂肪组织提取细胞的过程中，酶的浓度和消化时间是获取尽可能多的原代细胞的关键。为了获得足够多的原代细胞，利用0.1%Ⅰ型胶原酶进行消化。与其他文献报道的1次消化1次收集不同的是^[34]，作者采用了一次消化，多次收集的方法。消化30 min后，首次收集，再消化15 min，2次收集，最后再消化15 min，3次收集，获得原代细胞。通过这种方法可以获得比1次消化1次收集更多的原代细胞。利用成纤维细胞和间充质干细胞较早贴壁的特点，在培养48 h后首次换液，据此时间差纯化脂肪干细胞。

体外培养的细胞需要合适的环境和必要的条件才能够生存、增殖。不同于已有的报道，多采用α-MEM或DMEM培养基进行脂肪干细胞的培养^[22^，^35]。本实验使用的培养液为含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。在培养最初2 d，脂肪干细胞处于生长缓慢的滞留阶段，第3-5天处于指数生长期，第6天达到峰值，以后细胞生长速度逐渐减慢，进入生长平台期，平均五六天传代1次，符合干细胞生长规律^[36]。细胞贴壁后呈长梭形或成纤维样，旋涡状生长。至第9代细胞仍旧保持旺盛的生长状态，说明该培养液能够为小鼠脂肪干细胞的生长提供所需的营养物质。需要指出的是，在实验中应用了不同公司的血清(结果未显示)，结果同王福科等^[37]的结果相似，Gibco胎牛血清更适合小鼠脂肪干细胞的生长需要。

透射电子显微镜下，小鼠脂肪干细胞体积大，细胞表面可见丰富的微绒毛结构。细胞核体积大，细胞质内粗面内质网较多，呈中度扩张状态。说明分离培养的脂肪干细胞具有干细胞的超微结构特点。而且，大量的中度扩张的粗面内质网说明该细胞功能活跃，能够合成大量的蛋白质，与脂肪干细胞扩增速度快的特点吻合。

目前，关于脂肪干细胞表面的特异性标志还没有定论^[38-40]。已有的研究表明，脂肪干细胞能够表达CD10，CD13，CD29，CD44，CD49e，CD59，CD90，STRO-1；不表达造血系统及上皮标志，如：CD3，CD4，CD15，CD16，CD19，CD31，CD33，CD34，CD45，CD56，CD106等^[41-46]。作者选取了CD29、CD34及CD44 作为检测的表面标志。结果显示脂肪干细胞表达CD44、CD29，而不表达CD34，与文献结果一致。说明提取的脂肪干细胞能够表达间充质干细胞表面标志，而不表达造血干细胞表面标志。

实验表明，小鼠脂肪干细胞经过成骨诱导剂诱导后，细胞基质发生钙化，细胞内碱性磷酸酶表达量增加。碱性磷酸酶活性增高提示细胞呈高分化状态，与成骨细胞的分化有关^[47-48]。说明脂肪干细胞具有分化为成骨细胞的潜能。当诱导液中含有较高浓度的地塞米松、胰岛素、吲哚美辛时，能够成功诱导脂肪干细胞分化为脂肪细胞。

生物支架材料是组织工程学的主要研究内容之一，其主要作用在于为种子细胞的增殖提供空间从而引导细胞进行组织构建。由于胶原蛋白具有较好的生物降解性、低抗原性、生物相容性以及促进细胞增殖等特性，因此以胶原为主要材料构建的支架广泛地应用于组织工程皮肤^[49]、组织工程骨^[50]、组织工程血管中^[51]。本实验制备了鼠尾胶原支架，将第3代脂肪干细胞种植于胶原支架上，10 d后，经扫描电子显微镜观察，发现脂肪干细胞呈铺展状生长于胶原支架上，说明二者具有很好的相容性。为今后利用脂肪干细胞及胶原支架材料进行皮肤缺损修复及神经修复奠定了实验基础。

综上，通过1次消化多次收集的方法成功的分离了来自小鼠附睾处脂肪组织中的脂肪干细胞，并且能在体外稳定传代。在一定诱导条件下，分离、培养的小鼠脂肪干细胞能够分化为成骨细胞和脂肪细胞并且与胶原支架具有良好的相容性。如果能够将其应用于临床，相信能够为骨组织缺损、软骨组织缺损及周围神经损伤等疾病的治疗提供新的、有前景的治疗方法。

小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定

Isolation, culture and identification of adipose-derived stem cells from mouse epididymis

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