人牙周膜干细胞与牙周膜细胞生物学特性的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (28): 4510-4516.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.014

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人牙周膜干细胞与牙周膜细胞生物学特性的比较

封艳¹，粱学萍¹，赵今¹，孙玉亮¹，钟良军²

¹新疆医科大学第一附属医院口腔医学中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830013；²杭州师范大学附属医院(杭州市第二人民医院)口腔科，浙江省杭州市 310015

出版日期:2014-07-02 发布日期:2014-07-02
通讯作者: 赵今，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院口腔医学中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830013
作者简介:封艳，女， 1973年生，浙江省平湖市人，汉族，新疆医科大学第一附属医院在读博士，主要从事牙周病的治疗研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2010211A49)

Differences between biological characteristics of human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells

Feng Yan¹, Liang Xue-ping¹, Zhao Jin¹, Sun Yu-liang¹, Zhong Liang-jun²

¹Oral Medicine Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ² Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University (Second People’s Hospital of Hangzhou), Hangzhou 310015, Zhejiang Province, China

Online:2014-07-02 Published:2014-07-02
Contact: Zhao Jin, Professor, Doctoral supervisor, Oral Medicine Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Feng Yan, Studying for doctorate, Oral Medicine Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2010211A49

摘要/Abstract

摘要：

背景：牙周膜干细胞生物作用是目前牙周病治疗研究的热点，牙周膜成纤维细胞是其分化的终末功能细胞之一，也是其主要的支持细胞，两者生物学特性的差异研究鲜有报道。
目的：比较牙周膜干细胞与牙周膜细胞生物学特性的差异。
方法：用组织块法体外对牙周膜细胞以及单细胞克隆分离纯化后的人牙周膜干细胞两种细胞分别进行显微镜下形态观察，CCK8法检测并绘制2种细胞的生长曲线。流式细胞分析比较2种细胞的细胞周期以及细胞表面标记物的表达、实时PCR对2种细胞碱性磷酸酶、增殖细胞核抗原和Scleraxis基因进行检测。
结果与结论：牙周膜干细胞与牙周膜成纤维细胞外观差别明显，人牙周膜干细胞的生长曲线培养前5 d要低于牙周膜细胞，但在5 d后明显高于牙周膜细胞。人牙周膜干细胞与牙周膜细胞的细胞周期分别为41.1%和23.9%。表面标记物检测结果显示2种细胞虽有相似的表达，但在表达率差异有有显著性意义。实时荧光定量PCR结果显示，人牙周膜干细胞在碱性磷酸酶、增殖细胞核抗原以及Scleraxis基因的表达检测均高于牙周膜细胞。表明牙周膜干细胞在成骨增殖等生物学功能上比牙周膜细胞具有更强的潜能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 牙周膜干细胞, 牙周膜细胞, 成骨, 增殖, 生物学特性, 表面标志物, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The biological function of human periodontal ligament stem cells is a hot area of research in the treatment of periodontal disease. Human periodontal ligament cells are one of the end cells derived from human periodontal ligament stem cells; meanwhile, it can also provide supports to the development of human periodontal ligament stem cells. However, few studies are reported about the difference of biological characteristics between human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells.
OBJECTIVE: To compare the differences of biological characteristics between human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells.
METHODS: The human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells were isolated and purified using tissue explant method and cell clone method, respectively, and then were observed under light microscope to compare the differences of morphology. Cell proliferation curves of human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells were drawn respectively with cell counting kit 8 assay. Flow cytometry analysis was used to detect their cell circles and their surface markers expressions. The alkaline phosphatase gene, proliferating cell nuclear antigen gene and Scleraxis gene of human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells were detected by Real-time PCR assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells showed a notable difference in morphology under the light microscope observation. During the first 5 days, the cell proliferation curve of human periodontal ligament stem cells was lower than that of human periodontal ligament cells, but 5 days later, the curve of human periodontal ligament stem cells was significantly higher than that of human periodontal ligament cells. The cell circles of human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells were 41.1% and 23.9%, respectively. The surface markers of human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells were similar, but their expression rates had significant difference. The expressions of alkaline phosphatase gene, proliferating cell nuclear antigen gene and Scleraxis gene of human periodontal ligament stem cells were significantly higher than those of human periodontal ligament cells. The above results suggest that human periodontal ligament stem cells have much stronger potential ability than human periodontal ligament cells in osteogensis and cell proliferation.

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Key words: periodontal ligament, stem cells, cell proliferation, cell differentiation

中图分类号:

R394.2

封艳，粱学萍，赵今，孙玉亮，钟良军. 人牙周膜干细胞与牙周膜细胞生物学特性的比较[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4510-4516.

Feng Yan, Liang Xue-ping, Zhao Jin, Sun Yu-liang, Zhong Liang-jun. Differences between biological characteristics of human periodontal ligament stem cells and human periodontal ligament cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4510-4516.

图/表（结果） 7

2.1 人牙周膜细胞和牙周膜干细胞生长曲线的差异从图1可见牙周膜细胞于接种前5 d呈现出相当强的体外扩增能力，很快进入对数生长期。牙周膜干细胞在接种后第五六天开始显示其增殖旺盛期，而且增殖活力明显强于牙周膜细胞，2种细胞直到第8天进入平台期后，人牙周膜干细胞仍表现高于牙周膜细胞的扩增能力。

2.2 人牙周膜细胞和牙周膜干细胞形态的差异第7代牙周膜细胞、牙周膜干细胞和培养3 d，倒置显微镜观察两种细胞的形态，可见牙周膜细胞胞体呈现长梭形或三角形，胞核居中，梭形两端的有突起和分叉，并与邻近牙周膜细胞的突起接触和连接。而右图中的人牙周膜干细胞在3 d时增殖比牙周膜细胞较慢，细胞形态有2种，其中一部分与牙周膜细胞相似，呈现长梭形或三角形，胞核略显饱满些，还有一类呈现圆形，卵圆形的纯化的牙周膜干细胞，细胞核是非常丰富和饱满，胞浆少，核浆比例高，呈幼稚生长状态，与其周围的长梭形牙周膜细胞有明显的区别(图2)。

2.3 人牙周膜细胞和牙周膜干细胞表面标记的差异流式细胞仪检测细胞分子表型结果显示，人牙周膜干细胞高水平表达间充质干细胞特异的表面标记(CD29，CD44，CD105，STRO-1)，低表达造血系细胞(CD34，CD45)和内皮细胞特异的分子表型(CD31)，证明了人牙周膜干细胞的干细胞特性，牙周膜细胞也高表达间充质干细胞表面标记物，但CD29，STRO-1表达率明显低于人牙周膜干细胞，同时低表达造血细胞和内皮细胞表面标记物，但CD34和CD31表达率明显高于人牙周膜干细胞(图3，表1)。

2.4 人牙周膜细胞和牙周膜干细胞细胞周期的差异人牙周膜干细胞细胞比例分别为G₁/G₀=58.9%，G₂/M=6.4%，S=34.7%。牙周膜细胞的细胞比例分别为G₁/G₀=76.1%， G₂/M=8.5%，S=15.4%。2种细胞的G₂+S期分别是41.1%和23.9%(图4)。

2.5 人牙周膜细胞和牙周膜干细胞中成骨及成纤维相关基因的表达实时PCR结果显示，人牙周膜干细胞的成骨相关基因碱性磷酸酶和韧带相关基因Scleraxis mRNA的表达要明显高于牙周膜细胞(P < 0.05)。培养前5 d人牙周膜干细胞与牙周膜细胞中增殖细胞核抗原mRNA表达水平较高，5 d后2种细胞中增殖细胞核抗原mRNA表达均下降，但人牙周膜干细胞中增殖细胞核抗原mRNA的表达水平要高于牙周膜细胞(P < 0.05，图5)。

2.6 人牙周膜干细胞与牙周膜细胞的成骨分化能力成骨诱导培养2周后，茜素红染色可观察到细胞紧密生长并出现大小不一的结节。茜素红染色可见在复层生长的细胞散在出现大小不一的橘红色矿化结节。人牙周膜干细胞生成的矿化结节面积较大且较稠密，而牙周膜细胞生成的矿化结节分散且单个结节的面积较小(图6)。

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引言

材料方法

设计：细胞学对比观察。

时间及地点：所有实验均于2012年期间在新疆医科大学第一附属医院科研中心干细胞研究室完成。

材料：在经过患者及监护人的知情同意后，共获得16个样本的27颗牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，取自13-23岁因正畸治疗需要减数拔牙的患者。

牙齿数量27颗，患者年龄13-23岁，其中男5例，女11例。实验经新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准。

方法：

人牙周膜细胞和牙周膜干细胞的培养与分离：在获取患者及监护人的知情同意后，标本取自临床上13-23岁因正畸治疗而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，移入离心管中，离心管中加有低糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清，2 mmol/L谷胺酰胺)并含高浓度双抗(1×10⁶U/L青霉素和1×10⁶ μg/L链霉素)。1×10⁶ U/L青霉素和1×10⁶ μg/L链霉素)反复冲洗，刀片刮取根中1/3的牙周膜组织并用新鲜培养液将刀片上的牙周膜组织冲至培养皿中，反复数次后，将有牙周膜组织块和低糖 DMEM培养基的培养皿放入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱，第6，9天可以轻柔地半量换液，12 d左右，组织块周围有细胞爬出，到组织块周围爬出的细胞达到对数生长期时，含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。将消化的牙周膜细胞尽量吹打成单个细胞，细胞悬液计数，调整细胞浓度为(10-15)×10³ L^-¹，种于96孔板，每孔100 μL适应性培养基。在接种第1天开始挑选只有一个活细胞的孔，标记后继续培养。待细胞克隆面积大于96孔底面积1/2或2/3时进行转种。扩大培养时分别依次接种于48孔、24孔板、3.5 cm皿、6 cm皿、10 cm皿。

CCK-8法分析细胞增殖能力：将牙周膜细胞和人牙周膜干细胞以2×10³/孔的密度接种于96孔培养板，每孔加入0.2 mL常规培养液，连续在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养12 d。每3 d换液1次。连续12 d于每天同一时间点进行分析，每时间点测量8个孔。弃去检测孔中的液体，用PBS清洗3遍，入20 μL CCK-8液，继续在37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养3 h。避光震荡5 min，使结晶物得到充分溶解。在酶联检测仪测量以波长490 nm测量吸光值，重复3次求均值，绘制2种细胞的生长曲线。

流式细胞仪分析2种细胞的细胞周期：取第6代第5天的牙周膜细胞和人牙周膜干细胞，以胰酶消化后，弃上清，加入1 mL冷PBS和2 mL无水乙醇吹打混匀，于4 ℃固定细胞24 h。1 000 r/min离心6 min，弃乙醇(固定液)，用5 mL左右冷PBS洗2次，10 000 r/min离心6 min。用100 μL PBS吹打细胞后，加5%碘化丙锭染液(100 g/L)400 μL充分混匀，室温避光染色30 min，流式细胞仪测定 DNA含量，根据DNA含量判定细胞周期，分析细胞在G₁，S，G₂期的比例。

流式细胞仪检测2种细胞中不同细胞表型的表达：取1×10⁶个第6代牙周膜细胞、人牙周膜干细胞，胰酶消化后，PBS清洗3遍。加一抗孵育30 min。PBS清洗后，加入IgG1- FITC和IgG1-PE孵育30 min。PBS清洗、重悬，在避光条件下，用流式细胞仪检测，应用Cell Quest软件(BD公司)进行分析。

实时PCR比较2种细胞中成骨与韧带组织相关基因的表达：为了分析2种细胞中成纤维、成骨分化的潜能，对相关分子标记做一定量分析。从RNA水平鉴定成骨相关基因碱性磷酸酶与韧带组织相关基因Scleraxis的表达。

收集第6代的牙周膜细胞和人牙周膜干细胞，RNA提取步骤如下：①细胞离心，弃上清，PBS清洗2次，加1 mL Trizol裂解细胞，吹打混匀，室温放置10 min后，加200 μL氯仿，剧烈振荡15 s后，静置5 min；4 ℃ 12 000 r/min× 15 min离心。②离心后出现分层相，吸取水相，加入0.5 mL预冷异丙醇，混匀，室温作用10 min后，4 ℃ 12 000 r/ min× 10 min离心。③离心后可见 RNA沉淀，弃上清，加入1 mL预冷体积分数75%乙醇(DEPC水稀释)，清洗RNA沉淀，颠倒混匀后；4 ℃ 7 500 r/min×5 min离心。⑤弃上清，37 ℃，超净台内风干30 min，再加DEPC水溶解 RNA沉淀，测定 RNA浓度和纯度，同时分装RNA，-80 ℃保存。

取适量总RNA加1 μL Oligo dT以及RNA酶水(DEPC水)，达到总体积12 μL，65 ℃水浴孵育5 min。接着加4 μL 5× Buffer、1 μL RNA酶抑制剂、2 μL dNTP，最后入1 μL Amv反转录酶，总体系20 μL混匀后离心，42 ℃水浴60 min后，70 ℃ 5 min中止反应，所获得的cDNA，-80 ℃冻存。

每管中加入2×qPCR TaqMix 12.5 μL，10 μmol/L各基因双向引物混合物2 μL，与引物对应的cDNA各2 μL。不加模板的一管为阴性对照。各管补加水至25 μL。混匀后荧光定量PCR仪中检测。50 ℃ 2 min预处理，95 ℃ 10 min预变性后，95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s(荧光检测)，40个循环，基因相对表达量采用2^-^△△^CT法计算。

引物序列：

成骨诱导能力比较：分别以5×10³/孔的密度将体外扩增的人牙周膜干细胞和牙周膜细胞接种于12孔培养板，用含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养，当细胞达到60%汇合时，加入矿化诱导液(含10 nmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L维生素C，1×10^-⁷ mol/L地塞米松、体积分数5%胎牛血清的 α- MEM培养液)继续培养2周，每隔3 d换液1次。当细胞出现复层生长并有许多小的细胞堆积物弃去矿化培养基，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定0.5 h，加入1%茜素红染液染 3-5 min，去除茜素红染液，去离子水充分冲洗，镜下观察。

主要观察指标：2种细胞生物学特性的差异。

统计学分析：数据以平均值表示。两组间比较在SPSS 13.0软件(美国SPSS公司)下采用独立样本t 检验方法， P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

牙周炎是一种发病率较高的、能造成牙周组织中牙槽骨以及软组织损伤伴牙齿脱落的慢性疾病。牙周再生成为牙周病治疗的关键，而牙周再生过程的关键则是有足够量的功能细胞迁移到组织缺损区域，发挥干细胞招募、增殖、分化等作用，重建牙周组织。再生医学的研究表明^[8]，牙周膜干细胞比骨髓间充质干细胞在体外更容易扩增，体现出更强的细胞量储备的优势^[9-10]。所以研究证实牙周膜干细胞是维持牙周组织在动态平衡以及缺损修复状态下的关键细胞^[11]，在动物体内可以形成新的牙周组织结构^[12]，为牙周膜干细胞用于牙周组织再生治疗提供了依据。无论是牙周膜干细胞体内移植的体内实验，还是细胞膜片技术的细胞移植加细胞因子调控的体外实验，都需要分离纯化以及富集足够数量的牙周膜干细胞，促进在病损区域形成干细胞巢^[13]。干细胞巢是指自然条件下围绕干细胞周围的支持细胞、黏附分子和基质构成的微环境，该支持细胞是一群位于特殊位置并维持干细胞的细胞^[14]。而牙周膜细胞以数量优势成为牙周膜干细胞主要的支持细胞。牙周膜成纤维细胞与牙周膜干细胞的相互关系类似于体外培养中先为干细胞培养准备的滋养层细胞，牙周膜成纤维细胞不但要参与组织修复，还要分泌干细胞因子帮助维持干细胞的干性。而在另一方面，牙周膜干细胞在不对称分裂后会形成牙周膜细胞。除了两者密不可分的相互联系外，2种细胞在生物学特性和功能方面的差异也是不可避免的成为实验探讨和研究的内容。实验分别从两种细胞的镜下形态观察、增殖曲线、细胞周期、表面标记物的表达、成骨增殖基因的检测，以及成骨能力等方面的进行比较。在哺乳动物中，不对称分裂的干细胞表现为：留在干细胞巢中的一个子代细胞保持有干细胞的特性，而离开干细胞巢的另一个子代细胞发生增殖和分化，最终成为功能性细胞^[17]。在对2种细胞的镜下形态观察可以在图3中发现牙周膜干细胞作为干细胞独特的分裂方式—非对称分裂，既有对称性分裂成2个圆形牙周膜干细胞，也有非对称分裂成长梭形的成体牙周膜细胞。所以在纯化的牙周膜干细胞中有两种细胞形态，其中一类是刚刚分化的长梭形多角形的牙周成纤维细胞。还有一类是未分化的圆形，卵圆形呈幼稚生长的牙周膜干细胞，核质饱满，核浆比例高。

在流式细胞仪检测两种细胞分子表型中，虽然牙周膜细胞也高表达间充质干细胞低表达造血细胞和内皮细胞表面标记物，但表达率却有明显差异，尤其是CD29，STRO-1表达率明显低于人牙周膜干细胞，说明牙周膜细胞时一群异质性的混杂细胞，也含有一部分具有间充质干细胞特性的细胞群。并且牙周膜细胞在造血细胞标记CD34和内皮细胞标记CD31表达率明显高于人牙周膜干细胞，甚至达到10倍以上，说明牙周膜细胞中已含有较多分化的对牙周组织修复有帮助的血管上皮细胞。

牙周膜干细胞在体内通过增殖形成组织并维持自身数量来实现自我更新能力^[18-19]。细胞周期是反映细胞增殖能力的重要参考指标，2种细胞的G₂+S期分别是41.1%和23.9%。人牙周膜干细胞的G₂+S期的细胞比例明显高于牙周膜细胞的G₂+S期的细胞比例，体现出牙周膜干细胞相对于牙周膜细胞较强的增殖能力。

实时定量PCR从RNA水平对增殖成骨相关的一些基因进行了定量分析，结果显示人牙周膜干细胞碱性磷酸酶碱性磷酸酶基因的表达要明显高于牙周膜细胞。碱性磷酸酶活性增高被认为是组织发生矿化的前提条件，与细胞分化状态密切相关，它可以调节磷离子的转运，矿化组织形成中发挥着十分重要的作用^[20]。高水平的矿化相关基因表达证明了人牙周膜干细胞的高矿化潜能。

人牙周膜干细胞表达韧带相关基因 Scleraxis数量要高于牙周膜细胞，说明人牙周膜干细胞比牙周膜细胞的成纤维分化能力更强，另外牙周膜细胞因本身含有较多已分化的成纤维细胞，故 Scleraxis基因表达处在一个较低水平。

2种细胞的增殖细胞核抗原的表达都表现与细胞生长曲线对应却相反的走势，说明在细胞潜伏期和指数生长期增殖细胞核抗原基因高表达，在平台期低水平表达或不表达增殖细胞核抗原基因。而人牙周膜干细胞在指数增长期后表达量仍高于牙周膜细胞，从另一方面佐证人牙周膜干细胞比牙周膜细胞有较强的增殖能力。

干细胞一直被认为是生长周期慢于短暂增殖细胞的，但其增殖潜能大，常在组织再生需要时增殖速度提高^[15-16]。在2种细胞的生长曲线图中可看出在培养的前5 d牙周膜干细胞表现为慢增殖状态，增殖速度要小于牙周膜成纤维细胞，而在5 d以后牙周膜干细胞增殖的速度明显加快，增殖能力显着高于牙周膜成纤维细胞，并且在进入平台期仍然保持较高的增殖活力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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