人脐带源间充质干细胞静脉移植治疗大鼠肝纤维化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：近来国内外研究证明，来自其他组织的干细胞能够归巢到肝脏，并可能参与肝组织的再生，这为发展干细胞治疗肝脏疾病提供了新的希望。
目的：探究人脐带源间充质干细胞的分离、培养方法，观察脐带间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化模型的修复作用，为脐带间充质干细胞的临床应用提供可靠的理论依据。
方法：自然贴壁法分离、纯化人脐带间充质干细胞并进行体外培养和扩增，用皮下多点注射CCl₄制备肝纤维化大鼠模型。将22只模型大鼠随机分为模型损伤组(n=11)和细胞移植组(n=11)。细胞移植组在模型制备成功后的第1，2，3周经尾静脉给予1×10⁶脐带间充质干细胞治疗，4周后将大鼠处死，收集各组大鼠血液检测肝功能；摘取肝脏行苏木精-伊红染色，观察病理变化；免疫组化法观察库普弗细胞的数量及分布；免疫组化法观察治疗组脐带间充质干细胞的定位情况。
结果与结论：脐带间充质干细胞经尾静脉移植入肝硬化大鼠后，大鼠的肝功能均明显改善，与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；肝组织苏木精-伊红染色提示，肝纤维化程度明显改善；免疫组化法观察库普弗细胞的数量提示，库普弗细胞数量明显减少；免疫组化方法利用抗BrdU抗体在治疗组大鼠肝脏观察到BrdU标记的脐带间充质干细胞。说明脐带间充质干细胞移植可以改善大鼠外周血液的血生化特性和肝的组织学结构。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 移植, 脐带, 间充质干细胞, 肝纤维化, 细胞移植, 大鼠, 肝功能, 库普弗细胞, 病理变化

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies verified that other tissues-derived stem cells can be homing to the liver, possibly participate in the regeneration of liver tissues, which provides new hope for stem cells in treatment of liver disease.
OBJECTIVE: To observe isolation and culture of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, to observe the repairing effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation on hepatic fibrosis, and then to provide a reliable theoretical basis for further clinical application of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were isolated and purified by natural adherent method, and then cultured and amplified in vitro. A rat model of hepatic fibrosis was prepared using subcutaneous multi-point injection of CCl₄. A total of 22 rat models were randomly assigned to model injury group (n=11) and cell transplantation group (n=11). At 1, 2 and 3 weeks after model induction, the rats in the cell transplantation group were treated with 1×10⁶umbilical cord-derived mesenchymal stem cells via caudal vein. Four weeks later, the rats were sacrificed. Blood of rats was collected from each group to detect liver functions. The liver was removed to receive hematoxylin-eosin staining, and pathological changes were observed. The number and distribution of Kupffer’s cells were observed using immunohistochemistry. The localization of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from treatment group was observed using immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: After umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were infused into rats with
cirrhosis via caudal vein, liver function was significantly improved, which showed significant differences as compared with the control group (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining revealed that hepatic fibrosis was apparently improved. Immunohistochemistry results demonstrated that the number of Kupffer’s cells was obviously reduced, and BrdU-labeled umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were visible in rat liver of the treatment group using anti-BrdU antibody. These results suggested that umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation could improve biochemical characteristics of rat peripheral blood and histological structure of liver.

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Key words: stem cells, umbilical cord, mesenchymal stem cells, cell transplantation, liver cirrhosis, liver transplantation

中图分类号:

R394.2

张英杰，李玉云，郝晓娜，郝艳梅. 人脐带源间充质干细胞静脉移植治疗大鼠肝纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4485-4490.

Zhang Ying-jie, Li Yu-yun, Hao Xiao-na, Hao Yan-mei. Vein transplantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells for treatment of hepatic fibrosis in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4485-4490.

图/表（结果） 6

2.1 动物数量分析 30只大鼠进行实验研究，随机选取5只大鼠作为健康对照，其余25只腹腔注射CCl₄制备慢性肝损伤模型，造模过程死亡3只，造模成功率88%，22只存活大鼠随机均分成模型损伤组和细胞移植组，模型损伤组在实验过程中死亡1只，细胞移植组11只和模型损伤组10只进入结果分析。

2.2 人脐带间充质干细胞的培养组织块贴壁后1周可见散在分布、贴壁生长的细胞集落。细胞多为双突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞；14 d时细胞贴满瓶底，此时呈鱼群样、漩涡状、辐射状或网状排列(图1)。传代后细胞增殖迅速，一般两三天可传1代。

2.3 人脐带间充质干细胞的鉴定选取状态较稳定的第4代脐带间充质干细胞，流式细胞术分析结果显示，脐带源性间充质干细胞均强表达整合素黏附分子CD29(97.32± 2.77)%，而造血细胞的标记C34和内皮细胞标记CD31仅为(1.01±0.56)%和(2.47±0.54)%，见图2。

2.4 血清肝功能生化丙氨酸氨基转移酶、血清白蛋白结果的比较脐带间充质干细胞移植4周后，将全部大鼠处死，收集血液，检测血清丙氨酸氨基转移酶、血清白蛋白变化，并与健康对照组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、血清白蛋白进行比较(表1)。结果显示，模型损伤组、细胞移植组与健康对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；与模型损伤组比较，细胞移植组大鼠肝功能有明显改善(P < 0.05)。

2.5 苏木精-伊红染色法观察病理变化模型损伤组肝锁严重紊乱，炎细胞浸润，成纤维细胞增生(图3A)；脐带间充质干细胞移植组肝锁紊乱，成纤维细胞增生不明显(图3B)。病理结果提示，脐带间充质干细胞移植组明显好于模型损伤组。

2.6 脐带间充质干细胞对肝纤维化程度的影响请病理教研室同一位老师单盲读片对肝纤维化程度进行评分(表2)，结果显示脐带间充质干细胞治疗后比模型损伤大鼠损伤程度明显好转，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 免疫组化法观察库普弗细胞的数量 ED2是识别库普弗细胞膜表面特异性抗原的单克隆抗体。每张切片分别取5个镜下(×100)视野，读取阳性细胞数，取其平均值。

脐带间充质干细胞移植组阳性细胞数为(8.4±1.2)个，主要沿肝血窦少量散在分布；模型损伤组的阳性细胞数明显增多，为(27.3±2.4)个，且阳性细胞胞质丰富、体积变大。细胞移植组与模型损伤组数量比较，差异有显著性意义 (P < 0.05)。

2.8 移植后脐带间充质干细胞的定位情况结果显示，每张切片均可见BrdU阳性细胞(图4)，但数量较少，每镜下(×400)视野数<1个。

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引言

间充质干细胞是干细胞的一种类型，具备干细胞的重要特征，即很强的自我增殖能力和多向分化潜能，它是继胚胎干细胞、造血干细胞之后的又一研究热点。间充质干细胞具有多向分化潜能，在适宜的环境中可分化发育为心肌细胞、神经元样细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、骨细胞、肝细胞等。间充质干细胞在现代细胞治疗中应用前景广阔，它可用于修复受伤或病变的多种组织器官，可治疗心血管疾病、神经系统疾病，如脊髓损伤引起的瘫痪、老年痴呆、帕金森症；骨组织病，如骨质疏松、软骨损伤、肌腱损伤等、角膜损伤、烧伤烫伤、缺血性血管病、肿瘤等多种疾病。人间充质干细胞不表达MHCII类分子和B7等共刺激分子，具有免疫赦免特性。研究结果表明，间充质干细胞无免疫抗原性，不刺激同种异体反应性，且能逃避细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的溶解，间充质干细胞能在人类血细胞抗原配型不同的个体间移植，不需对宿主进行免疫抑制，因此间充质干细胞移植同种异体后无排斥反应或反应较弱。研究者将体外培养扩增的不同浓度骨髓间充质干细胞通过静脉注入志愿者体内，结果发现直至输入量达到5×10⁷均未发生明显的免疫排斥反应。间充质干细胞的这种低免疫原性的特点，为其在现代细胞治疗中提供了广阔的应用前景，可以将分离纯化的间充质干细胞在人群中同种异体使用，治疗或辅助治疗多种疾病。

肝纤维化是由于各种致病因素引起的肝脏损害和炎症，在组织修复过程中导致肝脏细胞外基质代谢失衡，发生异常增多和过度沉积的病理过程，是肝组织修复过程中的代偿反应，这一阶段若得不到有效治疗，最终会发展为肝硬化，甚至导致患者死亡。

目前对于肝硬化的治疗仅限于去除潜在的有关刺激，用干扰素、病毒吟和拉米夫定等对病毒性肝炎进行抗病毒治疗，以及最后的治疗手段——肝移植。肝移植是治疗末期肝硬化的有效手段，5年生存率达75%。但是由于移植器官的来源有限，需要移植的患者数量众多，以及由于一些因素的限制并非每个患者都适于移植，因此迫切需要发展有效的抗纤维化治疗手段。近来国内外研究证明，来自其他组织的干细胞能够归巢到肝脏，并可能参与肝组织的再生^[1-5]，这为发展干细胞治疗肝脏疾病提供了新的希望。本文观察脐带间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化模型的修复作用，为脐带间充质干细胞的临床应用提供可靠的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞移植，体外观察。

时间及地点：于2012年1月至2013年12月在蚌埠医学院实验中心完成。

材料：

实验动物：雄性3月龄SD大鼠30只，体质量180- 200 g，实验动物均由蚌埠医学院实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK(皖2012-002)。所有动物自由饮水和进食。

实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》中伦理学标准。

脐带标本：脐带来源于蚌埠医学院附属第一医院妇产科健康足月妊娠分娩胎儿脐带(脐带为废弃物，无伦理学问题)。

方法：

脐带源间充质干细胞的分离培养：将无菌取得的足月妊娠分娩胎儿脐带充分洗涤去血渍后，剔除脐带动静脉，解剖刮取Wharton’s Jelly(间质组织)，剪碎成约1 mm× 1 mm×1 mm大小的组织块，DMEM冲洗，以细胞浓度1×10⁶ L^-¹接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，当细胞融合时，用胰蛋白酶消化传代。

脐带间充质干细胞的鉴定：细胞传至第4代后，用消化液消化细胞，PBS洗涤2次(1 000 r/min)，离心5 min，流式细胞术检测CD34、CD29、CD31的表达情况。

脐带间充质干细胞的标记：选取第4代细胞，在DMEM培养液中加入适量BrdU，使终浓度为10 μL/L，孵育48 h，待细胞融合，胰蛋白酶消化备用。

动物模型的制备：随机选取25只SD雄性大鼠用40% CCl₄花生油溶液(自行配制)腹腔注射法制造慢性肝损伤模型。CCl₄花生油溶液的浓度为40%，剂量为2 mL/kg，每周一和周四腹腔注射40%CCl₄花生油溶液，共注射4周，造模过程死亡3只，余存活。

实验动物的分组：剩余未造模的5只大鼠进入健康对照组(n=5)，将上述经CCl₄处理造模成功的22只大鼠随机均分为模型对照组和细胞移植组。细胞移植组(n=11)：造模4周后，分别在第1，8，15天，经鼠尾静脉输注含1×10⁶的BrdU标记的脐带间充质干细胞1 mL。模型对照组(n=11)：造模4周后，与细胞移植组在相同时间尾静脉注射等剂量生理盐水。

标本的收集、保存及检测：正常饮食饲养各组动物4周后，1%戊巴比妥60 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉满意后，取血行肝功能检测：检测血清白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)。

肝脏病理学观察：取动物肝脏左叶，体积分数10%的甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色镜检观察肝组织病理变化；利用抗BrdU抗体，经免疫组化方法观察BrdU标记的脐带间充质干细胞定位情况。ED2是识别库普弗细胞膜表面特异性抗原的单克隆抗体，每张切片分别取5个镜下(×100)视野，读取阳性细胞数，取其平均值。

并按下述标准评判肝纤维化程度^[4]：“-”无成纤维细胞增生(0分)；“+”汇管区扩大，有少量成纤维细胞增生 (1分)；“++”汇管区成纤维细胞增生并向小叶内延伸，呈较窄较短的纤维素条(2分)；“+++”汇管区成纤维细胞大量增生并向小叶内明显延伸，形成纤维隔伴有小叶结构紊乱(3分)。请病理教研室同一位老师单盲读片进行评分。

主要观察指标：脐带间充质干细胞的形态学观察及鉴定；苏木精-伊红染色观察肝脏损伤程度、SP免疫组化法检测ED2阳性细胞数量；细胞移植组经免疫组化方法利用抗BrdU抗体观察脐带间充质干细胞定位情况。

统计学分析：所有数据均采用x(_)±s表示，用 SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理。如果符合正态分布和方差齐性检验，则用多样本均数两两之间的全面比较的 LSD-t 检验，如果不符合则秩转换后用非参数检验。取α=0.05水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

间充质干细胞主要存在于全身的结缔组织和器官间质中，以骨髓中最为丰富，因此，目前国内外间充质干细胞的研究主要集中在骨髓，但成人骨髓源的间充质干细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且供者间充质干细胞的采集须进行骨髓穿刺。其他方法如从脐血和外周血中培养间充质干细胞具有一定难度，且间充质干细胞在足月分娩的脐血或动员的外周血中数量尚存在争议。 2004年Wang等^[6]在Stem Cells首先报道脐带中富含间充质干细胞，与其他来源的间充质干细胞相比，脐带源间充质干细胞更为原始，分化能力更强，脐带的收集对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，其来源丰富易于获得，脐带免疫系统处于原始阶段，降低了移植后受者的排斥反应，与脐血中比各种病毒感染机会相对少，且细胞来源不涉及社会、伦理及法律方面的更多争论。因此，脐带源间充质干细胞的优越性使其在近年的国内外研究中倍受关注。本实验建立了从脐带中分离、纯化、扩增间充质干细胞的新方法，可为间充质干细胞的临床应用提供足够的细胞来源。

慢性肝脏疾病以肝细胞变性、坏死、纤维化为主要病变，一旦肝纤维化形成，就成为不可逆的病变，严重影响肝脏功能和患者的生活质量。因而促进肝脏细胞再生和抗纤维化是治疗肝脏疾病的关键。目前，治疗慢性肝脏疾病主要以药物和肝移植为主，但由于种种原因难以达到满意的疗效。

近年来，研究表明肝纤维化过程是可以逆转的^[7-16]，且骨髓间充质干细胞移植在逆转肝纤维化方面的作用已经得到证实，有望为肝纤维化、肝硬化的治疗带来新手段。本实验的研究结果表明，脐带间充质干细胞移植可明显改善四氯化碳导致的大鼠肝纤维化，其机制可能与以下几个方面有关：①脐带间充质干细胞可分化成肝细胞，修复损伤的肝组织。在肝纤维化特别是肝硬化时，有大量肝细胞坏死，因此补充正常功能的肝细胞可以修复损伤的肝组织，许多研究表明，脐带间充质干细胞在体内外均可分化为肝细胞^[17-20]。实验利用抗BrdU抗体，经免疫组化方法观察BrdU标记的脐带间充质干细胞定位情况显示脐带间充质干细胞可归巢至肝脏，但数目很少，其原因有待今后进一步讨论。②间充质干细胞分泌细胞因子/生长因子、抑制炎症反应，如肝细胞生长因子、白细胞介素10、干细胞因子、基质细胞衍生因子1a、转化生长因子β、肿瘤坏死因子a等。其中肝细胞生长因子不但具有诱导间充质干细胞自身向肝细胞分化功能，还抑制转化生长因子β产生，阻止肝脏纤维化，抗肝细胞凋亡的活性，从而提高肝细胞存活率^[21-22]。白细胞介素10能阻止肿瘤坏死因子的纤维化信号传导通路，减少纤维化^[23-25]。③间充质干细胞抑制库普弗细胞(KC)。肝细胞损伤或坏死刺激、激活库普弗细胞，库普弗细胞活化后分泌多种细胞因子再激活肝星状细胞，肝星状细胞转化为成纤维样细胞或肌纤维细胞，分泌大量的Ⅰ型胶原^[26-27]，胶原在肝脏的沉积，引发肝纤维化。本实验利用单克隆抗体ED1定位库普弗细胞，发现移植组库普弗细胞的数量明显减少，提示间充质干细胞通过抗炎等作用抑制肝库普弗细胞的增生和活化，从而抑制肝星状细胞的激活和转化，减少细胞外基质的产生，抑制肝纤维化的形成。

综上所述，间充质干细胞移植后在一定程度上能修复受损的肝组织，为众多肝纤维化甚至肝硬化患者带来曙光。但间充质干细胞逆转肝纤维化的分子机制尚不完全清楚，另外，要获取间充质干细胞移植的长期生存率、长期不良反应等信息都有待今后开展大规模临床双盲试验。但相信随着这些难题的解决间充质干细胞移植有望成为治疗肝纤维化的理想方法。