长链非编码RNA AK089560在间质干细胞成骨与成脂分化中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.021

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3732-3738.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.021

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长链非编码RNA AK089560在间质干细胞成骨与成脂分化中的表达

左长清¹，卢旱云¹，钟月春¹，汪宗桂²，戴忠¹，刘钰瑜¹，吴铁¹

广东医学院，¹药理学教研室，²生物化学教研室，广东省东莞市 523808

修回日期:2014-05-05 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
通讯作者: 左长清，广东医学院药理学教研室，广东省东莞市 523808
作者简介:左长清，男，1977年生，湖南省湘乡市人，汉族， 2009年南方医科大学毕业，博士，讲师，主要从事干细胞成骨成脂分化调控、生物信息学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81101357，81102450)；东莞市高等院校科研机构科技项目(2011108102029)

The expression of long non-coding RNA AK089560 in mesenchymal stem cells undergoing osteogenic and adipogenic differentiation

Zuo Chang-qing¹, Lu Han-yun¹, Zhong Yue-chun¹, Wang Zong-gui², Dai Zhong¹, Liu Yu-yu¹, Wu Tie¹

¹Department of Pharmacology, ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, Guangdong Province, China

Revised:2014-05-05 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
Contact: Zuo Chang-qing, M.D., Lecturer, Department of Pharmacology, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
About author:Zuo Chang-qing, M.D., Lecturer, Department of Pharmacology, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81101357, 81102450; Science and Technological Program for Dongguan’s Higher Education, Science and Research, and Health Care Institutions，No. 2011108102029

摘要/Abstract

摘要：

背景：最近研究发现众多长链非编码RNA调控干细胞多潜能性和分化。长链非编码RNA AK089560在干细胞多向分化中的表达变化及作用，目前尚不清楚。

目的：观察间质干细胞C3H10T1/2成骨分化与成脂分化过程中AK089560的表达。

方法：重组人骨形态发生蛋白2诱导间质干细胞C3H10T1/2成骨分化，碱性磷酸酶染色鉴定早期成骨分化。地塞米松、吲哚美辛和胰岛素三因子联合诱导C3H10T1/2成脂分化，油红O染色鉴定成脂分化结果。采用qRT-PCR检测诱导前后不同时间点AK089560表达的变化。采用RNAfold软件预测AK089560二级结构，UCSC基因组浏览器分析AK089560邻近编码蛋白基因，fancyGENE在线软件构件长链非编码RNA与编码基因关系图。

结果与结论：C3H10T1/2经成骨诱导后，70%以上细胞碱性磷酸酶染色阳性；成脂分化诱导后，80%以上细胞油红O染色阳性。qRT-PCR结果显示，长链非编码RNA AK089560在成骨分化与成脂分化第2，4，6天表达均明显下降，成骨分化与成脂分化第2，4，6天与相应时间未分化组相比均差异有显著性意义(P < 0.05)。生物信息学分析表明，LncRNA AK089560具有复杂茎环结构，与编码基因Sema3a形成sense overlap关系。结果表明AK089560在间质干细胞成骨与成脂分化中下调表达，提示其可能参与调控间质干细胞多向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 分化, 间质干细胞, 成骨分化, 成脂分化, 长链非编码RNA, 生物信息学, 重组人骨形态发生蛋白2, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have found that stem cell pluripotency and differentiation is regulated by many long non-coding RNAs (LncRNAs). The expression and effect of LncRNA AK089560 during differentiation of stem cells is unclear.

OBJECTIVE: To investigate the expression of LncRNA AK089560 in mesenchymal stem cells C3H10T1/2 undergoing osteogenic and adipogenic differentiation.

METHODS: Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells C3H10T1/2 was induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2 and evaluated using alkaline phosphatase staining. The adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells C3H10T1/2 was induced by three factors (dexamethasone, indomethacin and insulin) and evaluated by oil red O staining. The dynamical expression of LncRNA AK089560 was detected by qRT-PCR assay. The AK089560 secondary structure was predicted using RNAfold software. The relationship between AK089560 and neighboring protein-coding genes was analyzed using UCSC genome browser and visualized by fancyGENE online software.

RESULTS AND CONCLUSION: Over 70% of C3H10T1/2 cells were positive for alkaline phosphatase after osteogenic induction and more than 80% of the cells positive for oil red O staining after adipogenic induction. qRT-PCR results showed that the expression of LncRNA AK089560 at days 2, 4, 6 of both osteogenic and adipogenic differentiation was significantly decreased compared with the control group (P < 0.05). Bioinformatics analysis showed that there was a stem-loop structure for AK089560 and sense overlap relationship between AK089560 and protein-encoding gene Sema3a. These findings indicate that LncRNA AK089560 expression is reduced during osteogenic differentiation and adipogenic differentiation, showing that AK089560 may be involved in regulating the multi-directional differentiation of stem cells.

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Key words: cell differentiation, mesenchymal stem cells, bone morphogenetic proteins

中图分类号:

R394.2

左长清，卢旱云，钟月春，汪宗桂，戴忠，刘钰瑜，吴铁. 长链非编码RNA AK089560在间质干细胞成骨与成脂分化中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3732-3738.

Zuo Chang-qing, Lu Han-yun, Zhong Yue-chun, Wang Zong-gui, Dai Zhong, Liu Yu-yu, Wu Tie. The expression of long non-coding RNA AK089560 in mesenchymal stem cells undergoing osteogenic and adipogenic differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3732-3738.

图/表（结果） 3

2.1 间质干细胞C3H10T1/2早期成骨分化鉴定结果 碱性磷酸酶(ALP)是早期成骨分化的标志，其表达与成骨细胞的分化、成熟呈正相关。在实验中，实验用rhBMP 2诱导间质干细胞C3H10T1/2成骨定向分化。质量浓度300 μg/L rhBMP 2诱导分化6 d后，进行碱性磷酸酶染色，结果显示：成骨诱导分化组可见70%以上细胞染色阳性，细胞呈紫蓝色，而对照组细胞未见明显变化，见图1，这提示rhBMP 2成功诱导间质干细胞C3H10T1/2早期成骨分化。

2.2 间质干细胞C3H10T1/2成脂分化鉴定结果 间质干细胞C3H10T1/2经地塞米松、吲哚美辛、胰岛素三因子(DII)联合诱导成脂分化，在分化的第2天，细胞形态明显变圆，细胞胞浆内开始出现少量细小脂滴，随着时间延长，脂滴数量明显增多，脂滴明显增大。倒置显微镜下可见晶莹透亮的小圆形脂滴。分化到8 d时，胞内的小脂滴逐渐融合成折光性较强的大脂滴，而对照组无明显变化，细胞内没有或极少脂滴出现。油红O染色结果显示：80%以上细胞呈亮红色，对照组无明显变化。提示C3H10T1/2细胞在三因子作用8 d能有效定向诱导成脂分化，见图2。

2.3 qRT-PCR鉴定LncRNA AK089560在成骨分化与成脂分化中时序表达模式 实验前期通过长链非编码RNA芯片筛选发现AK089560在成骨分化中下调表达。实验进一步采用qRT-PCR法鉴定LncRNA AK089560在成骨分化与成脂分化中时序表达模式。结果显示AK089560的表达值在C3H10T1/2细胞成骨分化的第2，4，6天明显下降，与对照组相比较差异具有显著性意义(P < 0.05)；在C3H10T1/2细胞成脂分化的第2，4，6天，AK089560的表达量同样明显下降，与对照组相比较差异有显著性意义(P < 0.05)。见图3。

2.4 AK089560编码蛋白性能鉴定 根据CPC软件预测分析结果，AK089560序列的蛋白编码得分为-0.961223；说明此序列不能编码蛋白质，属于长链非编码RNA。

2.5 AK089560二级结构预测 LncRNA和microRNA除了碱基数长度的差异外，近期的研究表明lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白质、DNA和RNA发生相互作用，因此对生物过程的调控比microRNA更加复杂多样。通过采用RNAflod软件进行AK089560结构预测，实验发现AK089560具有非常复杂的结构特点，包含有多个茎环结构。见图4。

2.6 AK089560功能预测分析结果 通过全基因组生物信息学对AK089560分析发现：AK089560位于第5号染色体，在其附近300kb区域内存在一个蛋白编码基因Sema3a。其中AK089560来源于Sema3a的内含子区的部分剪切体，与Sema3a基因同向转录表达，形成sense overlap关系，见图5。

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引言

间质干细胞是一类在体内与体外具有自我更新与多向分化潜能的细胞，其多能特性的维持与分化是一个多基因时序调控的复杂生物过程。在特定的诱导条件下，间质干细胞可分化为脂肪、成骨等组织细胞，广泛应用于组织工程与再生医学领域。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一类转录本长度超过200 bp的RNA分子，它们不编码蛋白质，最初被认为是基因组转录的“噪音”。随着基因组研究的深入，大量的研究结果否定了以上观点。目前研究发现 lncRNA表达水平异常或者功能异常与众多疾病如肿瘤和阿尔茨默病等紧密相关^[1-4]。最近多项研究表明：LncRNA与干细胞多潜能的维持与分化紧密相关^[5-6]，如敲除LncRNA AK028326、AK141205能导致干细胞丧失多能性，而过表达AK028326、AK141205促进干细胞分化^[7]；过表达LncRNA RMST促进干细胞神经分化^[8]；而LncRNA Braveheart可以刺激干细胞向心脏细胞的分化^[9]，是心脏发育非常重要的一个调控因子。Lander等^[10]研究发现在小鼠胚胎干细胞中高表达147 lincRNAs(基因间LncRNA)，他们通过shRNAs方法，成功鉴定出26个lincRNAs能够诱导多潜能因子Nanog和Oct4的表达而维持胚胎干细胞多潜能状态。随着研究的深入，目前已经发现在干细胞的多向分化过程中，存在大量差异表达LncRNA，同时通过RNAi或过表达LncRNA方法，已经鉴定出部分LncRNA促进或抑制间质干细胞分化。但是关于LncRNA如何调控间质干细胞分化相关机制，目前知之甚少。关于间质干细胞成骨与成脂分化过程中LncRNA的变化及调控作用，目前尚未见其它课题组研究报道。为了探索LncRNA对间质干细胞成骨他化的影响，课题组前期对间质干细胞C3H10T1/2成骨分化后，采用全基因组LncRNA基因芯片分析了分化前后差异表达的LncRNA^[11]，结果表明，116个LncRNA存在差异表达。但这些差异表达的LncRNA在成骨分化与成脂分化过程中动态变化及其作用尚不完全清楚。

实验挑选芯片显著差异表达的LncRNA AK089560，研究其在间质干细胞C3H10T1/2成骨分化与成脂分化过程中的动态表达，并进行生物信息学分析预测其功能，为探讨LncRNA参与间质干细胞多能性维持与分化提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年1至12月在广东医学院东莞校区科研平台完成。

材料：

实验方法：

C3H10T1/2细胞培养及成骨分化与成脂分化：小鼠间质干细胞C3H10T1/2常规培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱，当细胞生长至80%融合时，采用体积分数0.25%胰酶消化传代培养。诱导成骨定向分化方法：细胞接种于24孔细胞培养板中，当生长至95%融合后，加入含300 μg/L rhBMP-2的成骨诱导液继续培养6 d，期间每3 d更换1次成骨诱导液，分化6 d后，进行碱性磷酸酶染色。诱导成脂定向分化方法：细胞接种于12孔细胞培养板中，至100%融合后继续生长一两天，加入含成脂分化诱导液 (10^-⁷ mol/L地塞米松，5×10^-³ g/L 胰岛素，5×10^-⁵ mol/L吲哚美辛，简称DII三因子)的DMEM培养基继续培养8 d^[12]，此期间每2 d全量更换1次成脂诱导液，分化8 d后，进行油红O染色。

碱性磷酸酶染色鉴定成骨分化：C3H10T1/2成骨定向诱导分化6 d后，PBS清洗2次，然后用体积分数为70%乙醇室温固定15 min，采用含质量浓度0.1 g/L napthol AS-MX phosphate和 0.6 g/L Fast Blue BB salt染色液室温避光染色30 min，用蒸馏水漂洗细胞3次，倒置显微镜下观察并拍照记录。

油红O染色鉴定成脂分化：C3H10T1/2成脂诱导分化 8 d后，PBS洗涤2次，然后用40 g/L多聚甲醛固定15 min，体积分数0.5%油红O贮存液(溶于异丙醇)用水按3∶2稀释，0.45 μm滤膜过滤，固定后的细胞用此稀释液室温孵育 30 min后，蒸馏水漂洗细胞3次，倒置显微镜下拍照记录。

实时荧光定量PCR法检测AK089560的表达：C3H10T1/2细胞接种至12孔细胞培养板，按上述方法诱导成骨分化与成脂分化，在分化不同时间点用Trizol法提取细胞总RNA，用NanoDrop^® ND-1000检测RNA的浓度及纯度。按照PrimeScript^TM RT reagent Kit反转录反应制备 cDNA，逆转量为800 ng管，反转录反应条件为37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 s，反应结束后进行实时荧光定量PCR实验。按SYBR@Premix Ex Tap^TM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行PCR反应，反应体系为20 μL。结果以β-actin的表达值做相对定量分析。数据分析采用比较CT法(2^-^ΔΔCt)。采用primer3(http://primer3.ut.ee/)和Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行引物设计，上海生工生物工程公司合成。引物序列分别为：AK089560上游：5’-GAC AGG GTG TAG AAA CCA GAT TG-3’，下游5’-GTG TTT CCT GGT CCT CTG GTC-3’；β-actin上游：5’-GCC AAC CGT GAA AAG ATG AC-3’，下游：5’-ACC AGA GGC ATA CAG GGA CAG-3’。

AK089560非编码性鉴定：由于以往基因芯片在注解编码基因与非编码基因时存在部分差异，少数非编码转录本被错误注解为编码基因，同时少数编码基因转录本误注解为长链非编码RNA。CPC(Coding Potential Calculator，http://cpc.cbi.pku.edu.cn)软件是一种基于支持向量机分类器区别转录本是蛋白编码RNA或非编码RNA^[13]，该软件精确快速，已成为目前鉴定RNA转录本分类的重要方法。实验采用此CPC软件对AK089560 编码性能进行重新鉴定。

AK089560二级结构预测：目前预测LncRNA结构的软件主要有RNAfold和RNAstructure等^[14-15]，但RNA structure受到碱基数的限制，只能预测2 500 bp以下长度序列。RNAfold是一种通过计算最小自由能(MFE: minimum free energy)来预测RNA二级结构的软件。实验采用RNAflod对AK089560的结构进行预测分析。

AK089560作用机制的预测：长链非编码RNA作用方式多样，其中通过对基因组临近编码蛋白基因进行表达调控是其中重要作用方式之一。为了预测AK089560参与细胞调控作用，实验采用UCSC Genome Browser (http:平共处//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)分析AK089560附近300 kb区域蛋白编码基因^[16]。同时采用fancy GENE (http://bio.ieo.eu/fancygene/)在线软件构建AK089560与相邻编码蛋白关系图谱^[17]。

主要观察指标：间质干细胞成骨分化及其鉴定，间质干细胞成脂分化及其鉴定，间质干细胞成骨分化与成脂分化过程中AK089560的表达趋势。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x(_)±s表示，两组间均数差异比较采用两样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

多年来，对间质干细胞成骨分化与成脂分化调控的关注主要集中在编码蛋白质的基因和蛋白质本身。目前，研究表明众多的信号通路蛋白分子参与成骨分化与成脂分化过程，如：Wnt信号通路，BMP信号通路，MAPK信号通路，PTH信号通路，TGF-β信号通路，IGF-1信号通路等^[18-23]。但随着人类基因组计划的完成和哺乳类转录组数据的不断积累，揭示出人类和其他高级真核生物的遗传物质只有极小一部分编码蛋白质，而超过97%的转录产物是功能多样的RNA 分子，即非编码 RNA(non-coding RNA，ncRNA)。ncRNA依据分子大小划分为小分子非编码 RNA (microRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA，碱基数>200)。最近几年已经报道许多microRNA参与了干细胞定向成骨分化与成脂分化调控。如 miR226a和miR2196a参与脂肪干细胞定向成骨细胞分化调控^[24-25]；骨髓间质干细胞向成骨细胞分化过程中有 25个miRNA发生显著变化，其中miR2133可以直接作用Runx2，miR2135可以直接作用Smad5等^[26]；microRNA-204通过调控Runx2表达影响间质干细胞成骨分化和成脂分化^[27]，过表达miR-369-5p和miR-371能抑制间质干细胞成脂分化^[28]。但是，关于占据哺乳类转录组绝对多数的LncRNA是否参与调控间质干细胞成骨分化与成脂分化，目前尚无文献报道，只有几篇文献涉及脂肪前体细胞与成骨前体细胞分化，如 LncRNA PU.1 AS通过与PU.1 mRNA形成mRNA/AS lncRNA复合体，阻止PU.1 mRNA翻译从而抑制前脂肪细胞3T3-L1的成脂分化^[29]。有研究筛选了前脂肪细胞成脂分化过程中差异表达的175个LncRNA，进一步采用RNAi方法鉴定出其中10个LncRNA调控成脂分化过程^[30]。在前体成骨细胞hFOB1.19中通过RNAi下调LncRNA-ANCR表达，能明显促进成骨细胞分化^[31]。

为了进一步明确 lncRNA 表达及其在间质干细胞成骨分化过程中的作用，实验前期进行了LncRNA基因芯片筛选，发现116个差异表达的LncRNA。实验通过建立成骨分化与成脂分化细胞模型，对芯片筛选的差异表达LncRNA AK089560进行了qRT-PCR鉴定。结果表明：在间质干细胞成骨分化的第2，4和6天时间点AK089560表达明显下降，而未分化组表达水平没有明显改变，结果与前期芯片一致。有趣的是，实验进一步研究发现，在间质干细胞成脂分化的第2，4和6天中，AK089560表达水平也持续下降。这与已经报道的众多参与成脂分化与成骨分化基因表达方式不同，一般情况下，成脂分化与成骨分化是间质干细胞的两个相反的分化过程，通常基因表达方式也相反。但最近研究报道miR-138在间质干细胞成骨分化与成脂分化中均下调表达，可以抑制成骨分化同时也抑制成脂分化，这表明miR-138能抑制间质干细胞分化从而使间质干细胞保持在未分化状态^[32-33]。而LncRNA ANCR在角质形成细胞分化，成骨分化，成脂分化中均下调表达，可能是细胞未分化状态维持的另一个重要调控因子^[34]。因此实验猜想AK089560在间质干细胞的分化中可能具有类似miR-138与ANCR的作用：参与维持间质干细胞处于未分化状态，或者既调控成骨分化又能调控成脂分化。

通过最近几年的研究报道，已经明确LncRNA在发育和分化中扮演了重要角色，它们能以 RNA的形式在多种层面上如表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等方面调控基因的表达水平，从而参与许多细胞生长、发育、增殖和分化过程^[35-48]。在调控方式上，LncRNA比microRNA更加复杂多样，它们可以通过改变染色质结构，改变蛋白定位，调节蛋白活性，同时它们也可作为microRNA的前体，通过剪切从而转变成microRNA发挥作用^[36]。LncRNA这种多样的作用方式和复杂的二级结构增加了研究的难度。但是目前证明通过调控邻近编码基因表达是许多LncRNA一种非常重要的作用方式^{[36, 49-50]}。

实验通过基因组分析发现，lncRNA AK089560与编码基因Sema3a 形成sense overlap关系，与Sema3a同向转录表达。最近有研究报道Sema3a不仅能够促进骨骼形成，同时还能阻碍破骨细胞的形成，遏制骨骼破坏；敲除Sema3a的小鼠，成骨细胞数目明显减少，骨形成率显著下降^[51-52]。那么AK089560能否通过调控邻近Sema3a的表达，调节间质干细胞分化呢？值得未来实验进一步研究探讨。

长链非编码RNA AK089560在间质干细胞成骨与成脂分化中的表达

The expression of long non-coding RNA AK089560 in mesenchymal stem cells undergoing osteogenic and adipogenic differentiation

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