人羊膜间充质干细胞生物学特征及向多巴胺能神经元样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.013

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (23): 3682-3690.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.013

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人羊膜间充质干细胞生物学特征及向多巴胺能神经元样细胞的分化

周文然¹，李新¹，王文波¹，谢燕霞¹，唐娜¹，阎影^1，2

¹中健医疗集团干细胞与再生医学研究所，北京市 100094；²密苏里大学堪萨斯分校医学院，美国密苏里州堪萨斯城 64108

修回日期:2014-03-14 出版日期:2014-06-04 发布日期:2014-06-04
通讯作者: 闫影, 博士后，博士研究生导师，教授，中健医疗集团干细胞与再生医学研究所，北京市 100094
作者简介:周文然，女，1979年生，山东省枣庄滕州市人，汉族，2003年河北农业大学动物遗传与育种专业毕业，硕士，副研究员，现主要从事干细胞分化及临床应用基础研究和肿瘤免疫治疗研究.

Biological characteristics and dopaminergic neural-like cell differentiation potential of human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells

Zhou Wen-ran¹, Li Xin¹, Wang Wen-bo¹, Xie Yan-xia¹, Tang Na¹, Yan Ying^{1, 2}

¹Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, Zhongjian Medical Group, Beijing 100094, China;²Saint Lukes Cancer Institute and School of Medicine, University Missouri-Kansas City, Kansas City, MO 64108, USA

Revised:2014-03-14 Online:2014-06-04 Published:2014-06-04
Contact: Yan Ying, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, Zhongjian Medical Group, Beijing 100094, China; Saint Lukes Cancer Institute and School of Medicine, University Missouri-Kansas City, Kansas City, MO 64108, USA
About author:Zhou Wen-ran, Master, Associate investigator, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, Zhongjian Medical Group, Beijing 100094, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：羊膜间充质干细胞具有类似胚胎干细胞多潜能的特点，在再生医学等多种领域的临床应用具有广泛的实用性和明确的良好前景。然而，目前对于羊膜间充质干细胞的生物学特性和分化潜能的认识仍然了解甚少。

目的：建立体外分离和纯化人羊膜间充质干细胞的方法，检测羊膜间充质干细胞的体外分化特点，确定羊膜间充质干细胞在体外诱导条件下向多巴胺能神经元样细胞分化的潜能。

方法：采用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ分步消化法从羊膜中分离羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞；采用percoll梯度离心方法对羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞进行纯化；流式细胞术检测羊膜间充质干细胞的表面标志，确定羊膜间充质干细胞细胞表面抗原的表达特征；对体外培养的羊膜间充质干细胞进行成脂肪和成骨诱导，确定其多向分化的潜能；采用神经细胞条件培养体系诱导羊膜间充质干细胞向多巴胺神经细胞分化，通过免疫荧光染色和激光共聚焦荧光显微镜观察和鉴定诱导后多巴胺神经元样细胞的生成。

结果与结论：从羊膜组织成功分离、纯化和培养出羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞。羊膜来源的间充质干细胞不仅具有典型的间充质干细胞标志，而且保留了一些胚胎干细胞的OCT-4，SOX-2和KLF4等特有干细胞标志，可以诱导分化成为脂肪细胞和骨细胞，显示羊膜间充质干细胞保持了较为原始的胚胎干细胞的特点，具有多向分化的潜能。诱导分化之前的原代羊膜间充质干细胞表达固有的多种神经细胞标记，体外诱导后羊膜间充质干细胞可分化成为β-微管蛋白Ⅲ、神经元特异性核蛋白、酪氨酸羟化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白和巢蛋白等阳性表达的多巴胺能神经元样细胞。结果表明人羊膜来源的间充质干细胞所保留的多向分化潜能和有效分化成为多巴胺能神经元样细胞的特性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 分化, 羊膜, 间充质干细胞, 羊膜上皮细胞, 诱导分化, 多巴胺能神经元

Abstract:

BACKGROUND: Human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells (AMSCs) are considered to be one kind of adult stem cells that can be easily obtained in large quantities without using an invasive method. Because of their low immunogenicity, anti-inflammatory properties, multipotency of differentiation and without ethical issue, human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells have been proposed as a good candidate to be used in cell therapy and regenerative medicine. However, the biological properties and the differentiation capacity of human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells are still poorly characterized.

OBJECTIVE: To establish a practical method for isolation and purification of human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells, and to study the biological characteristics and dopaminergic neural-like cell differentiation potential of the human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells.

METHODS: Human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells were disassociated and isolated from the amniotic membrane by trypsin and collagenase based enzymic digestion, and purified by percoll mediated density gradient centrifugation. Expressions of surface antigens and transcription factors of the human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells were determined by flow cytometry and western blot assays. Based on the osteogenic and adipogenic induction, the multipotent differentiation capability of human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells was determined. Induction of neural cell differentiation of human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells was conducted in Neurabasal conditioning medium with ATRA supplement. Neural cell associated bio-markers were determined by immunofluoresence staining and confocal microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: In this study, we performed a practical method to isolate and purify human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells and amniotic epithelial cells simultaneously, with high cells yield. We demonstrated a group of constitutive expressions of neural antigens and embryonic associated transcription factor proteins (OCT-4, SOX-2 and KLF4) in fresh isolated human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells as well as in human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells after in vitro passage, which suggested that the human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells not only possessed intrinsic tendency to neural cell differentiation, but also maintained their stem cell characteristics after in vitro passage. We stimulated the human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells in the neurobasal-A and B27 based conditioning medium to induce neural cell differentiation. The induced human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells displayed an up-regulation of expression in panel of neural and dopaminergic associate molecules (β-tubulin III, neuron-specific nuclear protein, tyrosine hydroxylase, glial fibrillary acidic protein, myelin basic protein and nestin) by flow cytometry and immunofluorescence staining, which demonstrated the multipotent differentiation capability and dopaminergic neuron-like differentiation potential of the human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells.

全文链接：

Key words: stem cells, amnion, mesenchymal stem cells, epithelial cells, cell differentiation, dopamine, neurons

中图分类号:

R394.2

周文然，李新，王文波，谢燕霞，唐娜，阎影. 人羊膜间充质干细胞生物学特征及向多巴胺能神经元样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3682-3690.

Zhou Wen-ran, Li Xin, Wang Wen-bo, Xie Yan-xia, Tang Na, Yan Ying. Biological characteristics and dopaminergic neural-like cell differentiation potential of human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3682-3690.

图/表（结果） 3

2.1 人羊膜间充质干细胞体外培养中的形态特点

原代培养：经Ⅱ型胶原酶消化和Percoll纯化后收集的有核细胞在培养24 h后，有少部分细胞贴壁。刚贴壁的细胞呈圆形，折光性强。随后细胞胞质逐渐展开，折光性减弱，逐渐形成扁平单层细胞，呈漩涡状生长或成簇生长， 7 d细胞融合度达到80%。

传代培养：传代细胞生长迅速，接种4 h后细胞贴壁，形态、大小均一，两三天可倍增，细胞可以稳定生长传代。用于诱导分化的第4代羊膜间充质干细胞形态(图1)。

2.2 人羊膜间充质干细胞相关抗原的表达 原代羊膜间充质干细胞(图2)和第4代羊膜间充质干细胞(图3)细胞表面抗原和神经细胞相关抗原表达的特点。

羊膜间充质干细胞不表达造血细胞特异性抗原CD45，CD14，CD11c和CD34(图中未展示)。原代和第4代羊膜间充质干细胞均表达间充质干细胞特异性标志抗原CD44，CD73和CD105，传代后的羊膜间充质干细胞上述抗原表达趋向均一，表达比例也有所增加。神经细胞相关抗原巢蛋白、CD133、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白在原代羊膜间充质干细胞中表达比例分别为2.44%、10.19%、47.06%和73.07%，而在第4代羊膜间充质干细胞中表达比例分别为3.66%、29.72%、71.08%、97.17%。髓鞘碱性蛋白、酪氨酸羟化酶和神经元特异性核蛋白等神经细胞标记物在原代羊膜间充质干细胞中表达比例为1.58%、2.22%、13.95%，在第4代羊膜间充质干细胞中表达比例分别为0.26%、0.14%和0.14%。

2.3 原代和体外培养第4代羊膜间充质干细胞表达与胚胎干细胞密切相关的转录因子蛋白 Western Blot方法检测结果显示，上述与胚胎干细胞生物学特征密切相的转录因子蛋白OCT-4和SOX-2在原代和体外培养第4代羊膜间充质干细胞中均有明显表达。KLF4在原代羊膜间充质干细胞中有微弱表达，在第4代羊膜间充质干细胞中表达明显(图4)。

2.4 人羊膜间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化 人羊膜间充质干细胞在诱导为骨细胞的初始阶段，细胞形态保持长梭形。随着诱导时间的延长，细胞增殖速度减慢，细胞趋向聚集，逐渐汇合呈铺路石状，细胞由长梭形变为胞体较小的立方形，同时在高倍镜下可见细胞呈复层生长。随后出现多角形成骨样细胞，胞质颜色变深，含粗大颗粒，胞核明显，胞外基质分泌逐渐增多，胶原堆积、钙盐沉积。诱导培养至10-12 d，细胞中有不透光钙结节形成(图5A)，钙结节茜素红染色阳性(图5B)。

2.5 人羊膜间充质干细胞向成脂细胞的诱导分化 第4代羊膜间充质干细胞在成脂条件培养基诱导下，形态逐渐趋向圆形，胞体逐渐变大。在诱导第12天的细胞中可见大的脂肪滴，细胞介于不成熟脂肪细胞和成熟脂肪细胞之间阶段的标志(图5C)，用0.3%油红(Oil Red-O)染色，显微镜下可见阳性细胞(图5D)。

2.6 人羊膜间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化 诱导前的羊膜间充质干细胞呈成纤维细胞样的典型间充质细胞形态，诱导后第3天可见羊膜间充质干细胞细胞质向胞核收缩，呈典型核周体形态，6 d后可见多数细胞呈类神经元样细胞形态，胞体呈圆形，突起伸长，在突起末端出现分支，部分相邻细胞的突起连接成网状。随着诱导时间延长，细胞之间形成的网络状结构更加明显。诱导第12天时细胞交联形成的网络状结构。此时细胞形态改变更为明显，多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态。细胞伸出突触，在高倍镜下可见较典型的神经细胞形态(图6)。
免疫荧光染色结果显示诱导后的细胞表达神经细胞特异性标志β-微管蛋白Ⅲ，神经元特异性核蛋白、酪氨酸羟化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白(图7)。

2.7 RT-PCR检测诱导后神经元细胞相关神经标记mRNA的表达分析 分别提取培养至第4代的羊膜间充质干细胞以及经过神经培养基诱导第4天、第8天和第12天的神经元样细胞cDNA进行微管蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、多巴胺转运体基因、乙酰胆碱转移酶基因、多巴胺受体D2型基因、巢蛋白基因的PCR扩增。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，微管蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因以及巢蛋白基因mRNA的表达量随着诱导时间的延长逐渐增高，但未检测到多巴胺转运体和多巴胺受体D2型基因的mRNA表达。在第4代间充质干细胞中未检测到乙酰胆碱转移酶基因mRNA的表达，诱导之后出现阳性表达(图8)。

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引言

材料方法

设计：细胞学对比观察实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年6月在中健干细胞与再生医学研究所实验中心完成。

材料：新鲜胎盘来源于北京玛丽妇婴医院，经医院伦理委员会批准及家属同意并签署知情同意书后获得。

实验所需主要试剂及仪器：Neurabasal medium、B27 supplement、胶原酶Ⅱ(GIBCO公司)；Penicillin-Streptomycin、Trypsin-EDTA、DMEM、胎牛血清FBS，Percoll、兔抗人八聚体结合转录因子-4(OCT4)、鼠抗人转录因子SOX2 (SOX2)、鼠抗人Krueppel样因子4(KLF4)(ABGENT公司)；GAPDH、Goat anti Mouse IgG-HRP、Goat anti Rabbit IgG-HRP(Santa Cruz公司)；Mini-PROTEAN^® TGXTM Gels、Immun-Blot PVDF Membrane、Sandwiches、Western ECL Substrate (BIO-RAD公司)；显影剂、定液剂(柯达)；兔抗人β-微管蛋白Ⅲ(Tuj1)、鼠抗人神经元特异性核蛋白(NeuN)、鼠抗人酪氨酸羟化酶(TH)、鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、鼠抗人髓鞘碱性蛋白(MBP)、鼠抗人巢蛋白(nestin) (Neuromics)；FITC标记羊抗鼠IgG、 Rhodamine标记驴抗兔IgG(SIGMA公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)；多聚甲醛paraformaldehyde、TRITON-100(北京美莱博生物科技有限公司)；激光共聚焦荧光显微镜Observer Z1(德国Zeiss)；Western blot 电泳仪，琼脂糖凝胶电泳仪(美国 Bio-Rad公司)。

方法：

人羊膜间充质干细胞的分离和原代培养：胎盘娩出后尽快送达实验室处理，在无菌条件下将羊膜从胎盘的绒毛膜剥离下来，同时用眼科手术剪将羊膜剪成三四块。用PBS 洗涤羊膜3-5次直到羊膜清澈透明无血迹后，将羊膜转移到两个50 mL离心管中，加入0.5 mmol/L的EDTA 20 mL，在37 ℃恒温箱中孵育10 min后，将羊膜转移到装有30 mL预热的 0.05% trypsin/EDTA 溶液的离心管中。在37 ℃恒温箱中孵育60 min后，弃掉消化液，将胰酶消化后的膜用200 mL PBS洗3次，再加入1 g/L胶原酶Ⅱ(含25 mg/L的DnaseⅠ)^[14]，在37 ℃摇床中消化40-60 min，待羊膜充分消化后，稀释3倍，离心洗涤3次，然后将细胞悬浮成浓度为3×10¹⁰ L^-¹的细胞悬液备用。因消化下来的细胞中含大量上皮细胞，故对其进行纯化，步骤如下：

在15 mL离心管中，轻轻从下往上叠加入不同浓度的Percoll液：1 mL 70%， 3 mL 52%， 4 mL 42%和5 mL 30% Percoll，之后缓慢将1 mL间充质干细胞悬液叠加到30% Percoll的表面，以1 000×g离心力，4 ℃条件下离心 30 min，轻轻将最上层的间充质细胞转移到一新的15 mL离心管中，用PBS洗涤3次，细胞计数，最终按1×10⁵/cm²浓度接种到25 cm²的培养瓶中，培养基为DMEM+体积分数10%FBS+10 µg/L表皮生长因子+10 µg/L成纤维细胞生长因子2^[14-18]。将羊膜间充质干细胞置于体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱内培养，每3 d换液1次。

羊膜间充质干细胞的传代培养：待原代羊膜间充质干细胞生长覆盖70%瓶底时，去除培养液，用PBS平衡液洗1次。然后用3 mL 0.05%的胰蛋白酶消化细胞1 min左右，终止消化后吹打、回收和离心收集细胞，按照1∶3的比例传代培养。

原代和培养第4代羊膜间充质干细胞的流式细胞仪检测：下列鼠抗人单克隆抗体 (mAbs)：CD105 (endoglin)，CD73，CD29，CD44，CD45-FITC，CD14-FITC，CD11c-FITC，CD34-FITC和CD31用来鉴定羊膜间充质干细胞^[16-17^，^19-21]。此外为检测羊膜间充质干细胞是否表达固有的神经元细胞标志，采用下列鼠抗人单克隆抗体：β-微管蛋白Ⅲ、神经元特异性核蛋白、酪氨酸羟化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白和巢蛋白标记羊膜间充质干细胞。二抗为羊抗鼠IgG-FITC。细胞表面抗原标记染色过程如下：将羊膜间充质干细胞悬浮为浓度1×10⁹ L^-1的细胞悬液，直接染色时，细胞悬液在含体积分数5%小鼠血清的PBS中室温孵育10 min进行封闭，然后加入一抗在4 ℃条件下染色30 min；间接染色时，细胞悬液在含体积分数5%山羊血清的PBS中室温孵育10 min封闭，然后加入一抗在 4 ℃染色30 min，用PBS洗涤细胞3次后，加入羊抗鼠IgG-FITC；细胞内抗原染色时，将细胞混悬液浓度调整为1×10⁹ L^-¹，PBS洗3次后，用40 g/L的多聚甲醛(Paraformaldehyde)在室温下固定20 min，用PBS洗3次，每次400×g离心5 min，室温下用0.1% Triton X-100松解细胞膜，再用PBS洗3次，然后用15%山羊血清室温孵育 60 min，然后加入一抗室温孵育60 min或者4 ℃孵育过夜，然后洗涤细胞3次后，加入羊抗鼠IgG-FITC，室温孵育 60 min。用PBS洗细胞3次后，将细胞悬于0.5 mL PBS中，用流式细胞仪(FACS calibur，Becton Dickinson)检测，至少计数20 000细胞用于分析。

Western blot检测：采用Western blot方法检测胚胎干细胞相关转录因子OCT-4，SOX-2和KLF4在原代和培养至第4代羊膜间充质干细胞中的表达。方法简述如下：标本各取2×10⁶个细胞，采用RAPI裂解液提取总蛋白，蛋白含量测定采用BCA法。电泳的各标本蛋白含量调整至40 μg/孔。于95 ℃水浴5 min后标本以及蛋白分子量标准品分别加入凝胶加样孔，浓缩胶电泳电压为100 V，分离胶电泳电压为150 V。样本经SDS-PAGE凝胶电泳后，电转移至聚二氟乙烯(PVDF)膜。将膜用TBST清洗后，用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗，一抗浓度分别为OCT-4(1∶100)，SOX-2 (1∶200)，KLF4 (1∶1 000)和GAPDH (1∶1 000)于4 ℃孵育过夜。而后将膜用TBST充分洗涤，加入Goat anti Mouse IgG-HRP(1∶6 000)或者Goat anti Rabbit IgG-HRP (1∶6 000)，室温孵育1 h，再次用TBST漂洗PVDF膜，之后用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate反应液进行化学增强发光处理及胶片显色。

羊膜间充质干细胞向成骨细胞诱导分化：取培养的第3代羊膜间充质干细胞，用基础培养基调整细胞浓度至5× 10⁷ L^-¹，接种到24孔板中。待羊膜间充质干细胞融合度达皿底的80%时，弃去基础培养基，用PBS洗2次，加入成骨诱导培养基DMEM+体积分数15%FBS+160 pmol/L维生素C磷酸盐( L-ascorbic acid 2-phosphate)+10^-⁸ mol/L 地塞米松(dexamethasone)^[22]，置于37 ℃、含体积分数5%CO₂，饱和湿度培养箱静置培养。每3 d更换1次培养基。培养大约20 d后，用1%茜素红S(Alzarin Red S，经氢氧化铵调整pH至4.1-4.3)染色，显微镜下观察。

羊膜间充质干细胞向成脂细胞诱导分化：取第3代培养的羊膜间充质干细胞，用基础培养基调整细胞浓度至5× 10⁷ L^-¹，接种到24孔板中。待其融合度达到100%时，弃去基础培养基，用PBS洗2次，加入成脂诱导培养基DMEM+体积分数15%FBS+ 0.5 μmol/L地塞米松(dexamethasm)^[22]+ 0.5 μmol/L IBMX + 50 μmol/L吲哚美辛(indomethacin)，置于37 ℃、体积分数5%CO₂，饱和湿度培养箱内培养。每 3 d更换1次培养基。培养大约20 d后，用0.3%油红(Oil Red-O)染色，显微镜下观察。

羊膜间充质干细胞向多巴胺能神经元诱导分化：取第3代培养的羊膜间充质干细胞，用基础培养基调整细胞浓度至5×10⁷ L^-¹，接种到4孔chamber中。待其融合度达到80%时，弃去基础培养基，用PBS洗2次，加入多巴胺能神经元诱导培养基：神经细胞专用培养基(Neuralbasal medium Gibco)+2% B27 supplements+0.5 mg/L ATRA(全反式维甲酸all-trans-Retinoic acid)，于37 ℃、体积分数5%CO₂的饱和湿度条件下静置培养，每3 d更换1次培养基，培养至第12天时，进行免疫荧光检测。

诱导后神经元样细胞的免疫荧光染色分析：羊膜间充质干细胞诱导培养12 d后，进行免疫荧光染色分析。具体操作步骤是：吸去培养液，用PBS洗3次各5 min；经40 g/L的多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次各5 min；然后用0.1% TritonX-100处理15 min；PBS漂洗3次各5 min；用10% BSA室温封闭20 min；分别加入鼠抗人抗体神经元特异性核蛋白(1∶500)，酪氨酸羟化酶(1∶500)，胶质纤维酸性蛋白 (1∶500)，髓鞘碱性蛋白(1∶500)，或巢蛋白(1∶500)，并与兔抗人β-微管蛋白Ⅲ(Tuj1)复染；于4 ℃孵育过夜；PBS洗3次各5 min；加入FITC标记的羊抗鼠二抗(1∶1 000)和罗丹明(Rhodamine)标记的猴抗兔二抗(1∶1000)室温孵育60 min；PBS漂洗3次各5 min后，用含有DAPI的封片剂封固。在激光共聚焦荧光显微镜(Observer Z1，Zeiss)下观察并拍照。

RT-PCR检测诱导的神经元样细胞相关抗原mRNA的表达：采用RNeasy Mini Kit (Qiagen)试剂盒提取细胞总RNA，具体方法参照说明书进行。紫外分光光度计测吸光度值，计算RNA浓度，反转录反应合成cDNA后，置于-20 ℃保存以备用。以反转录产物2 µL作为模板建立 20 μL PCR反应体系：2×Taq酶 mix buffer 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH₂O 6 μL。反应条件如下：预变性：95 ℃，10 min；扩增：变性：95 ℃，30 s；退火：55-65 ℃(具体温度见表1)，30 s；延伸：72 ℃， 30 s；40个循环；后延伸：72 ℃，10 min。取2 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统对PCR产物进行分析。引物序列设计和合成：以GenBank中人相应的神经标记基因以及Actin基因的序列设计引物，引物由上海生工生物公司合成。

主要观察指标：①倒置显微镜观察诱导后的神经细胞的形态。②流式细胞仪检测诱导前原代和第4代间充质干细胞表型和神经细胞特异性抗原。③Westernblot检测间充质干细胞干性相关的转录因子的表达。④免疫荧光检测诱导后神经细胞的特异性标记。⑤采用RT-PCR检测神经细胞的酪氨酸羟化酶和乙酰胆碱转移酶等mRNA的表达。

统计学分析：文中流式分析结果是由第一作者采用BD FACSCalibur自带的分析软件CellQuest进行分析处理。

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讨论

人羊膜组织是位于胎儿绒毛膜表面的一层光滑、无血管及淋巴管的半透明薄膜，厚0.02-0.50 mm。羊膜是由胚胎发育期的滋养细胞层演化而来，其中主要含有两种类型细胞：羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞^[8^，^23]。鉴于羊膜组织结构致密，用酶一次性消化时间过长对细胞损伤较大，时间太短得到的细胞数量又太少，因此实验中多采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集细胞。胰酶消化分离出的是上皮细胞，胶原酶消化下来的是上皮细胞和间质干细胞混合物。实验采用Percoll浓度梯度离心法对胶原酶消化后的细胞混合物进行分离纯化后，每份羊膜标本可分离出2×10⁸左右的羊膜间充质干细胞。通过流式细胞检测可见羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞相似。羊膜间充质干细胞表面分子CD44、CD73、CD105均为阳性，而造血干细胞的表面标志CD34、CD45，CD31和人类白细胞抗原DR均为阴性，显示了典型间充质干细胞抗原表达和低免疫原性的特点。

近年来一些研究显示羊膜间充质干细胞具有很强的可塑性和多向分化的潜能^[24-26]。它在适当生长因子的诱导下可向3个胚层来源的细胞分化。实验对新鲜分离的原代和传代至第4代的羊膜间充质干细胞中的转录因子OCT-4，SOX-2和KLF4的表达进行了检测，结果显示上述转录因子蛋白在羊膜间充质干细胞中均为阳性表达。OCT-4，SOX-2和KLF4都是维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新的关键蛋白。同时，SOX-2也参与神经干细胞分化和神经发育的过程。原代和体外传代生长的羊膜间充质干细胞表达上述胚胎干细胞的重要转录因子，提示羊膜间充质干细胞可能保留了与胚胎干细胞相近的增殖潜力和干细胞生物学特征。实验对羊膜间充质干细胞分别进行了成骨和成脂肪细胞诱导分化，证明羊膜间充质干细胞可以诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞^[27-28]，显示了羊膜间充质干细胞具有的可塑性和干细胞的多向分化潜能。

发育生物学认为神经发育早期，羊膜组织与神经上皮有直接的相互作用。羊膜组织通过向羊水中释放神经递质和神经营养因子，对神经系统发育起重要作用。此外，研究还表明羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞本身也具有神经细胞和神经前体细胞的某些生物学特性。Sakuragawa等^[29]的研究显示羊膜组织中的羊膜间充质干细胞表达巢蛋白。此外，实验发现羊膜间充质干细胞中存在某些表达神经元细胞相关标志的细胞群体，这些标志性蛋白包括：β微管蛋白Ⅲ、中分子量神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白等。实验对羊膜间充质干细胞进行的流式细胞仪检测，发现巢蛋白和CD133这两个神经干细胞的特异性的标志，在原代和培养的羊膜间充质干细胞上都有表达，表明羊膜间充质干细胞保持了固有的神经干细胞的生物学特性；此外，原代羊膜间充质干细胞表达β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白的比例分别为7.06%和73.07%。培养至第4代的羊膜间充质干细胞表达β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白的比例分别为71.08%、97.17%。这些数据进一步证明了羊膜间充质干细胞内在固有的神经干细胞的生物学特性。同时，髓鞘碱性蛋白，酪氨酸羟化酶和神经元特异性核蛋白3种成熟神经元特异性标记程度不同的表达结果，也进一步确定了羊膜间充质干细胞保持了固有的某些神经元细胞的性质。这种羊膜间充质干细胞内在特质可能为诱导神经干细胞分化潜能和对神经退行性疾病的细胞治疗奠定了重要基础。蔡哲等^[30]报道了采用人羊膜间充质干细胞移植治疗帕金森病小鼠，有效地改善了帕金森病小鼠的病情，促进了小鼠体内多巴胺能阳性神经元的生成，缓解帕金森病小鼠运动功能障碍。这些研究均显示羊膜间充质干细胞在帕金森病和其他神经退行性疾病的治疗方面具有重要的前景^[31-33]。

目前，来源于中胚层的间充质干细胞向外胚层分化生成神经元的研究仍处于早期阶段。有人把这种跨胚层分化称为“转分化”，对于“转分化”所获得的是否是真正的神经元尚存在争议^[34-35]。目前体外诱导的方法主要分为3种^[36]：①神经营养因子和细胞因子，如维甲酸、脑源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等诱导分化。②化学试剂，二甲基亚砜、2-巯基乙醇、丁羟茴醚等诱导分化。③基因转染或修饰的诱导分化。使用化学诱导剂在数小时后即可出现间充质干细胞形态改变及神经特异性蛋白表达，但之后的研究发现诱导后细胞的形态和功能不能够长时间维持，因此有人认为这是一种细胞毒性的改变而不是细胞分化的过程。基因转染或修饰的诱导分化方法也存在稳定性差、表达率低、细胞损害和宿主细胞基因可能发生改变等问题，限制了实际上的应用^[37-38]。研究认为人羊膜间充质干细胞在体外培养条件下，能向神经前体细胞方向分化，并能分化为神经元和星形胶质细胞，表达典型神经细胞标志，例如：神经元特异性核蛋白、半乳糖脑苷脂、人微管相关蛋白2、乙酰胆碱转移酶、酪氨酸羟化酶、巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、中分子量神经丝蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白等蛋白水平的上调，这些可能与羊膜间充质干细胞保持的某些固有内在神经细胞特质有关^[39-41]。

实验采用经典的神经基础培养基，反式维甲酸结合B27，对人羊膜间充质干细胞进行神经细胞诱导，成功和高效率的生成了神经元样细胞。对诱导至12 d的神经样细胞进行免疫荧光检测发现巢蛋白、神经元特异性核蛋白、酪氨酸羟化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白均为阳性表达。与β-微管蛋白Ⅲ复染后显示细胞呈双阳性表达。RT-PCR检测到微管蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因以及巢蛋白基因mRNA的表达量随着诱导时间的延长上调。而乙酰胆碱转移酶基因mRNA在第4代MSC中未检测到其表达，诱导之后出现阳性表达。酪氨酸羟化酶能催化氨基酸L-酪氨酸转变成为多巴胺前体的二羟基苯丙氨酸(多巴)，表明由羊膜间充质干细胞诱导分化的神经样细胞具有多巴胺合成的能力。而表达的髓鞘碱性蛋白是中枢神经系统髓鞘的主要蛋白质，具有维持中枢神经系统髓鞘结构和功能稳定的重要作用。上述结果提示诱导的神经样细胞群体可能具有类似多巴胺能神经元，胆碱能神经元和神经胶质细胞等生物学作用。

本次工作为进一步研究参与多巴胺能神经元等分化的分子途径，神经递质合成和分泌的潜力，对损伤神经组织再生与修复的作用，和对于神经退行性疾病临床治疗的应用奠定了必要的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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人羊膜间充质干细胞生物学特征及向多巴胺能神经元样细胞的分化

Biological characteristics and dopaminergic neural-like cell differentiation potential of human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells

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