促红细胞生成素基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.23.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：促红细胞生成素具有神经元的保护及促进神经再生的作用。

目的：观察促红细胞生成素修饰的骨髓间充质干细胞尾静脉移植对大鼠脑梗死的治疗效果。

方法：用Western blot鉴定外源人促红细胞生成素基因在骨髓间充质干细胞中的表达。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型，模型组尾静脉注射PBS、骨髓间充质干细胞组注射骨髓间充质干细胞悬液，促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组注射转染了促红细胞生成素的骨髓间充质干细胞悬液。移植后3 d及移植后1，2，3，4 周行改良神经功能评分，检测神经功能的损伤情况。移植后4 周将大鼠麻醉后断头取脑，RT-PCR检测脑组织中bcl-2/bax基因表达变化，用原位末端标记法测定细胞凋亡情况、苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察PKH26标记的骨髓间充质干细胞的存活和分布情况。

结果与结论：Western blot结果显示，转染人促红细胞生成素基因的骨髓间充质干细胞体外能表达促红细胞生成素蛋白。移植后1-4周，骨髓间充质干细胞组和促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组神经缺损评分明显低于模型组(P < 0.05，P < 0.01)。与骨髓间充质干细胞组及模型组相比，大鼠脑梗死区组织促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组bcl-2基因的表达明显增高(P < 0.05)，bax基因的表达明显降低(P < 0.05)，凋亡细胞明显减少，PKH26阳性细胞数明显增多(P < 0.05)。结果证实，促红细胞生成素修饰的骨髓间充质干细胞尾静脉移植对脑梗死大鼠脑梗死疗效较好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 促红细胞生成素, 骨髓间充质干细胞, 大鼠, 脑梗死

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that erythropoietin can protect neurons and promote nerve regeneration.

OBJECTIVE: To explore the therapeutic effect of erythropoietin gene-modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation via caudal vein on rat cerebral infarction.

METHODS: Western blot assay was used to identify the expression of exogenous erythropoietin in bone marrow mesenchymal stem cells. A model of middle cerebral artery occlusion was established in Wistar rats using thread method. And then, model rats were randomly divided into model group (PBS injection via the caudal vein), transplantation group (transplantation of bone marrow mesenchymal stem cell suspension), erythropoietin group (transplantation of erythropoietin-transfected bone marrow mesenchymal stem cell suspension). Neurologic function was assessed at 3 days, 1, 2, 3, 4 weeks after cell transplantation. Four weeks after transplantation, the rats were decapitated after anesthesia to take brain tissues for RT-PCR detection of Bcl-2/Bax gene expression. Cell apoptosis was measured by TUNEL. Hematoxylin-eosin staining and fluorescence microscopy were employed to observe the survival and distribution of PKH26-labeled bone marrow mesenchymal stem cells.

RESULTS AND CONCLUSION: Western blot results showed that erythropoietin-transfected bone marrow mesenchymal stem cells could express the erythropoietin in vitro. At 1, 2, 3, 4 weeks after transplantation, the neurological defect scores in the transplantation group and erythropoietin group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05, P < 0.01). The expression of bcl-2 gene in the infarct region was significantly higher in the erythropoietin group than the transplantation and model groups (P < 0.05), but the expression of bax was significantly decreased (P < 0.05). In the erythropoietin group, the number of apoptotic cells was reduced, and the number of PKH26 positive cells was increased as compared with the other two groups (P < 0.05). These findings indicate that the transplantation of erythropoietin-modified bone marrow mesenchymal stem cells via caudal vein can significantly improve the neurological function in the rats with cerebral infarction.

全文链接：

Key words: stem cells, transplantation, bone marrow, mesenchymal stem cells

中图分类号:

R394.2

李金艳，王亮. 促红细胞生成素基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(23): 3664-3669.

Li Jin-yan, Wang Liang. Therapeutic effect of erythropoietin gene-modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on rat cerebral infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(23): 3664-3669.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠100只，无死亡和感染，均进入结果分析。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞形态 培养第5天时培养瓶底骨髓间充质干细胞集落数目明显增多，传3代的骨髓间充质干细胞增殖活跃。见图1A。

流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD105等表达阳性，CD34、CD80、CD86阴性，骨髓间充质干细胞均一性好，纯度达96%以上。PKH-26标记的骨髓间充质干细胞在荧光显微镜下呈红色荧光，见图1B。Western blot鉴定结果显示，在转染了pcDNA3-促红细胞生成素质粒的骨髓间充质干细胞中可检测到促红细胞生成素蛋白的表达，见图1C，其蛋白条带位置(相对分子质量：34 000)与阳性对照即人胎肝细胞LO2一致，而未经转染的骨髓间充质干细胞中无促红细胞生成素蛋白的表达。

2.3 大鼠神经功能变化 移植后第3天，促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组与骨髓间充质干细胞组、模型组比较差异无显著性意义；在移植后2-4周开始，与模型组和骨髓间充质干细胞组比较，促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组大鼠神经学缺损评分均降低(P < 0.01，P < 0.05)，骨髓间充质干细胞组神经学缺损评分低于模型组(P < 0.05)，见表1。

2.4 大鼠脑梗死区组织bcl-2和bax基因的表达 将PCR产物条带进行扫描统计分析显示bcl-2和bax mRNA在模型组中相对表达量分别为0.348±0.060，0.962±0.102；在骨髓间充质干细胞组中相对表达量分别为0.692±0.093，0.586±0.132；在促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组中相对表达量分别为1.135±0.146，0.273±0.028。与骨髓间充质干细胞组及模型组相比，促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组bcl-2的表达明显增高(P < 0.05)，bax的表达明显降低(P < 0.05)，见图2。

2.5 大鼠脑梗死区组织细胞凋亡情况 细胞核内存在棕黄色颗粒者为凋亡细胞。光镜下细胞散布于整个缺血区内，病灶边缘可见成堆的阳性细胞，有染色质边集及核固缩现象，某些区域可见凋亡小体。TUNEL法测定，促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组和模型组凋亡细胞数(400倍视野下)分别为(16.46±1.67)，(25.4± 1.63)，(36.67±2.69)个，促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组棕黄色颗粒的凋亡细胞明显少于骨髓间充质干细胞组及模型组(P < 0.05)。见图3。

2.6 大鼠脑梗死区组织形态及的PKH26的表达 苏木精-伊红染色显示，移植4周后，模型组可见梗死处脑组织被胶质细胞和胶质纤维充填，形成胶质瘢痕，局部脑萎缩，软化灶形成(图4A)。骨髓间充质干细胞组见在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变，组织瘢痕和软化灶小于模型组，而大于促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组(图4B)。促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组出现典型的神经细胞样形态学改变且软化灶消失，有少量瘢痕(图4C)。

荧光显微镜观察结果显示大鼠损伤灶脑组织中的PKH26 阳性细胞数：模型组(图4D)为(0±0.00)个/高倍视野，骨髓间充质干细胞组(图4E)为(23.28±3.52)个/高倍视野，促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组(图4F)为(31.47±3.46)个/高倍视野，各组之间均差异有显著性意义(P < 0.05)。

参考文献

[1] 王小红,郑美霞.438例脑梗死患者自身免疫性抗体检测的结果分析[J].放射免疫学杂志,2013,26(1):118-119.
[2] 崔立玲,黄国志,王康玲,等.重复经颅磁刺激联合高压氧治疗脑梗死患者的初步研究[J].中华物理医学杂志,2013,35(3):193-196.
[3] Li J, Zhu H, Liu Y, et al. Human mesenchymal stem cell transplantation protects against cerebral ischemic injury and upregulates interleukin10 expression in Macaca fascicularis. Brain Res. 2010;1334:65-72.
[4] 张婷勇.骨髓间充质干细胞移植并用单唾液酸神经节苷脂治疗大鼠脑梗死[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(14): 2557-2561.
[5] 张洪连,吴晓牧.骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死及存在问题[J].中华脑血管病杂志,2010,4(4):300-307.
[6] Wen J, Feng X. Patterns of Nogo-A, NgR, and RhoA expression in the brain tissues of rats with focal cerebral infarction. Transl Res. 2009;154(1):40-48.
[7] 周国庆,金怡,张鹏.沉默RhoA基因对骨髓间充质干细胞静脉移植治疗脑梗死大鼠的作用[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,45(14):8416-8420.
[8] 郭敏,巨容,刘秀香,等.重组人促红细胞生成素治疗新生儿缺氧缺血性脑病疗效分析[J].中华神经医学杂志,2007,6(5):523-525.
[9] 肖峰,胡涛.促红细胞生成素对脑出血神经再生影响的临床研究[J].现代预防医学,2011,38(17):3576-3578.
[10] 孟玮,顾兵.重组人促红细胞生成素与神经疾病[J].中国药理学通报,2011,27(12):1640-1643.
[11] 袁丽丽,杜红梅,管英俊,等.促红细胞生成素体外培养鼠胚脑皮质神经干细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,(49): 9174-9177.
[12] 叶夷露,俞月萍,张琦,等.促红细胞生成素鼻腔给药对大鼠慢性脑缺血后血管生成的作用[J].浙江预防医学,2011,23(3):16-18.
[13] Peng Y, Zhang QM, You H, et al. Growth-associated protein 43 and neural cell adhesion molecule expression follow-ing bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in a rat model of ischemic brain injury. Neural Regen Res. 2010; 5(13):975-980.
[14] Chu K, Kim M, Park KI, et al. Human neural stem cells improve sensorimotor deficits in the adult rat brain with experimental focal ischemia. Brain Res. 2004;1016(2): 145-153.
[15] Laing RJ, Jakubowski J, Laing RW. Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best? Stroke. 1993;24(2):294-297.
[16] Li Y, Chen J, Chen XG, et al. Human marrow stromal cell therapyfor troke in rat: Neurotrophins and functional recovery. Neurology. 2002;59(4):514-523.
[17] Kim SS, Yoo SW, Park TS, et al. Neural induction withneurogenin1 increases the therapeutic effects of mesenchymalstem cells in the ischemic brain. Stem Cells. 2008; 26(9):2217-2228.
[18] 柳太云,熊符,林军,等.人骨髓间充质干细胞移植促进脑梗死大鼠神经细胞再生和神经功能恢复[J].黑龙江医学,2011,35(9):663-664.
[19] 孟文格,陈小贺.依达拉奉在急性脑梗死时抗氧化及神经内皮保护作用的研究[J].河北医药,2010,32(1):9-10.
[20] Kim SS, Yoo SW, Park TS, et al. Neural induction with neurogenin1 increases the therapeutic effects of mesenchymal stem cells in the ischemic brain. Stem Cells. 2008;26(9):2217-2228.
[21] 赵小妹,刘永刚.骨髓间充质干细胞与上清液治疗大鼠脑梗死的疗效[J].新乡医学院学报,2012,29(8):571-574.
[22] Li Y, Chen J, Chen XG, et al. Human marrow stromal cell therapyfor troke in rat: neurotrophins and functional recovery. Neurology. 2002;59(4):514-523.
[23] 李伟,薛荣亮.转bcl-2基因大鼠全脑缺血再灌注后c-Myc蛋白的表达[J].山西医科大学学报,2011,42(10):793-796.

引言

脑梗死是由缺血、缺氧引起的局限性脑组织软化坏死的一种常见病，是世界性的多发性疾病，也是致残率和死亡率最高的疾病之一^[1-3]，其发病机制与能量代谢障碍、脂类介质的毒性、自由基移植等因素有关，其中自由基移植是脑梗死发生的关键性因素。大面积脑梗死即使可经治疗后挽救生命，但是大面积脑梗死所造成的重度残疾和持续性植物状却给家庭与社会造成了巨大的经济和精神负担，如何解决此问题，多年来一直是神经外科界面临的难题之一^[4-7]。目前对脑梗死所致的缺氧缺血性脑移植缺乏有效的治疗手段，仍采取以支持治疗为主的综合治疗方法。

近年来，促红细胞生成素的神经保护作用也逐渐被认识^[8]。在神经细胞中，促红细胞生成素引起的促红细胞生成素受体的激活是由初始事件的复杂级联反应引起的，此受体属于Ⅰ型细胞因子受体超家族，由2个二聚体和同源性。当促红细胞生成素与促红细胞生成素受体发生二聚化时，酪氨酸蛋白激酶2(Janus酪氨酸激酶2的磷酸化，自动JAK-2效应)和受体则被激活。JAK-2的激活导致下游信号通路发生磷酸化，这些通路包括Ras-有丝分裂-激活-蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和信号传导-转录活化因子-5(singal transducer and activator of transcription-5，STAT-5)途径，这些路径中促红细胞生成素的神经保护作用是非常重要的。此外在神经元中，JAK-2和NF-κB信号转导系统之间也可发生相互作用，促进促红细胞生成素保护一氧化氮的毒性和诱导细胞凋亡的神经元兴奋^[9-11]。因此，通过复杂的细胞通路调控可维持促红细胞生成素的保护效果。如果细胞中的线粒体释放细胞色素C，可激活半胱氨酸蛋白激酶(Caspases)，导致细胞DNA片段化和磷脂酰丝氨酸(PS)暴露残膜^[11-12]，会加速细胞死亡，而Akt的活化有助于神经元的存活。

实验在以往研究的基础上探讨促红细胞生成素修饰的骨髓间充质干细胞尾静脉移植后对脑梗死大鼠神经移植的治疗作用，为指导临床治疗脑梗死提供理论及实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年10月至2012年10月在天津市第五中心医院动物实验室完成。

材料：清洁级10周龄Wistar大鼠100只，雌雄各半，体质量250-300 g，购自中国医学科学院动物实验室，动物质量合格证号：SCXK20070035。

方法：

骨髓间充质干细胞的培养和标记：取Wistar大鼠10只处死，全身浸入体积分数75%乙醇中消毒，约10 min。无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪除骨端，10号注射器抽取1 mL DMEM完全培养基自一端冲洗，制成单细胞悬液，以3×10⁷ L^-¹细胞浓度接种至100 mL培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5% CO₂及饱和湿度孵育箱中，24 h后全量换液，以后每隔3 d换液1次。并按1∶2比例传代。经多次传代扩增培养，使骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化和扩增。应用流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原表达进行鉴定后。取经鉴定的骨髓间充质干细胞，以体积分数0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，无血清DMEM/F12培养基洗涤细胞1次，按PKH26染色说明书操作。锥虫蓝1∶10稀释后计数细胞，观察细胞的生存率。活细胞率%=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。标记后即刻取1×10⁵个细胞，PBS洗涤1次，多聚甲醛固定，FCM检测细胞标记率。同时荧光显微镜观察标记培养24 h后的细胞特征。

pcDNA3-促红细胞生成素重组质粒稳定转染骨髓间充质干细胞：选择P3代骨髓间充质干细胞，采用脂质体介导转染方法转染促红细胞生成素基因，按照Lipofectamin^TM 2000试剂说明书进行。转染24 h后按1∶10接种到6孔板中，加入新鲜的完全培养基。次日换液，加入质量浓度400 mg/L的G418的筛选培养基培养6 d，再换用含质量浓度 200 mg/L G418培养基培养，2周后阳性克隆形成，挑取单个克隆扩大培养和传代。

促红细胞生成素-UC-MSCs体外表达促红细胞生成素的Western blot检测：取生长良好的稳定转染pcDNA3-促红细胞生成素的骨髓间充质干细胞 1×10⁷，加入RIPA缓冲液(含质量浓度10 g/L PMSF)，冰浴后4 ℃离心取上清。用同样方法从培养的胎肝细胞系LO2中抽提蛋白质。测定蛋白浓度后进行100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后将蛋白转移至PVDF膜上，封闭液封闭，加入兔抗人促红细胞生成素多克隆抗体(1∶200)结合，洗膜后加入HRP-羊抗兔IgG(1∶5 000)结合，再次洗膜后加入Western blot化学发光试剂，放置1 min后于暗室内用X射线片进行化学发光白显影，洗片后采用图像分析仪扫描。

大脑中动脉栓塞模型的建立和分组：以线栓法制作大脑中动脉栓塞模型^[13-14]：建模前禁食12 h，不禁水。大鼠用体积分数4%异氟醚吸入麻醉，保留自主呼吸。取颈部正中切口，逐层分离并暴露右侧颈总、颈内和颈外动脉后结扎颈总动脉和颈外动脉，于颈总动脉近分权处剪一“V”字形切口，将多聚赖氨酸或明胶处理过的1.8号鱼线由切口插入右颈内动脉，进线深度为(18.0±0.5) mm，阻断大脑中动脉起始段及其所有血液供应。大鼠即刻出现右侧Horner征即为模型成功的标志。

将90只大脑中动脉阻塞大鼠模型随机区组法等分成3组，建模6 h后通过尾静脉分别注入移植液：模型组为注射1 mL 培养液组；骨髓间充质干细胞组为注射1 mL骨髓间充质干细胞(2.5×10⁹ L^-¹)悬液移植；促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组尾静脉注射等量转染促红细胞生成素的骨髓间充质干细胞悬液(2.5×10⁹ L^-¹)。

大鼠神经功能评价：在尾静脉注入移植液后3 d及移植后1，2，3，4周，采用改良神经功能评分(modified neurological severity scores，mNSS)对神经功能缺失进行评测^[15-16]。mNSS分为运动、感觉、平衡和反射4个部分，满分为18分，以神经功能缺失评分在6-12分进入实验分组。正常大鼠为0分，评分越低表示神经运动功能恢复越好，评分越高，表示症状越重。

RT-PCR检测：伤后4周取每组各取6只大鼠约100 mg/只脑组织制备匀浆, 用Trizol提取RNA，紫外分光光度仪测定RNA含量，通过MMLV试剂盒中步骤将RNA反转录成cDNA再将cDNA进行RT-PCR分析。按照Trizol (Invitrogen 公司)试剂说明书介绍的方法提取组织总RNA，以总RNA 为模板、Oligo (dT)为引物, 通过RT-PCR两步法试剂盒(大连宝生生物公司)将mRNA反转录成cDNA，反应参数为：30 ℃，10 min→2 ℃，30 min→99 ℃，5 min→5 ℃， 5 min。将cDNA -20 ℃保存。以反转录所得cDNA为模板。引物上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，40 μL体系。

扩增参数：94 ℃，2 min,→(94 ℃，30 s→56 ℃，30 s→72 ℃，30 s)×35循环→72 ℃，5 min。取PCR产物通过琼脂糖电泳后采用FR200图像分析系统分析。以bcl-2或bax与β-actin的吸光度比值表示相对bcl-2的相对表达水平。

TUNEL法染色：各组于移植4周后随机各取6只大鼠取脑梗死区组织，切片经石蜡包埋、脱蜡水化后，PBS漂洗 5 min×3，于37 ℃的蛋白酶K处理切片。入通透液(体积分数0.3% Triton PBS配，含体积分数3%羊血清4 ℃孵育 20 min。将TUNEL I和Ⅱ液按1∶9混合滴于铺片上，37 ℃恒温箱内孵育2 h。入荧光抗体37 ℃ 1 h，PBS漂洗5 min× 3，滴入固红呈色液，显微镜下监视，约58 min停止反应。PBS漂洗5 min×3终止反应，甘油封固，光学显微镜观察。

苏木精-伊红染色：于骨髓间充质干细胞移植梗死模型大鼠后4周，在每组随机各取大鼠6只，取材行梗死处组织学检查以证实恢复程度。取梗死处组织，经心脏灌注40 g/L多聚甲醛，固定10 min，行常规冰冻切片，组织切片进行苏木精-伊红染色、室温干燥后，荧光显微镜观察(先低倍后高倍观察)。在高倍镜(×200)下任取每张切片10个视野，对每个视野中的PKH26阳性细胞数进行计算，取其均值作为各组的PKH26阳性细胞数。

主要观察指标：RT-PCR检测各组脑组织中bcl-2/bax基因表达变化，用TUNEL法测定各组细胞凋亡情况、苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察各组PKH26标记的骨髓间充质干细胞的存活和分布情况。

统计学分析：实验数据均以x(_)±s表示，应用SPSS 11.5统计软件包进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间数据比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

脑梗死是各种栓子随血流进入颅内动脉使血管腔急性闭塞，引起相应供血区脑组织缺血坏死及脑功能障碍。脑梗死发生后脑组织因缺血、缺氧导致神经功能的损害，长期的神经功能损伤引起脑神经功能的永久性缺陷^[17-20]。近年来，经大量基础实验研究表明骨髓间充质干细胞能够促进神经损伤功能的恢复，为缺血性脑血管病的治疗提供了新的思路。骨髓间充质干细胞特性稳定，来源充足，易于冷冻保存和传代培养扩增，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能。大量骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的实验表明骨髓间充质干细胞可分泌多种细胞因子，发挥抗凋亡和抗炎作用，促进脑损伤组织内源性修复等的作用^[21-22]，是理想的组织工程干细胞。但单纯骨髓间充质干细胞移植的修复脑梗死作用仍不理想，还需与药物、理疗及生物工程等手段结合进行综合治疗^[13]。

最近促红细胞生成素在神经系统中的作用逐渐引起研究者的重视^[19]。促红细胞生成素在中枢神经系统是一个新的有发展前景的神经保护剂，它通过结合神经细胞表面特异性的细胞受体促红细胞生成素受体来发挥作用。促红细胞生成素及其受体在脑组织中分布广泛，通过自分泌或旁分泌的方式而发挥作用，当大脑组织脑缺血、缺氧性损伤后促红细胞生成素受体的表达显著上调起到内源性保护作用，外源性的促红细胞生成素可增强其保护作用，同时相关实验发现促红细胞生成素对神经元凋亡及中枢神经炎性反应有很强的抑制作用。有研究报道在脑梗死脑组织损伤中，促红细胞生成素能够抑制自由基链式反应，改善损伤细胞内Ca²⁺超载，减轻多种内源性致伤因子对脑组织细胞的损伤，对脑细胞凋亡有明显的抑制作用。故实验通过红细胞生成素修饰的骨髓间充质干细胞尾静脉移植治疗脑梗死大鼠神经损伤，将干细胞与促红细胞生成素联合应用。根据骨髓间充质干细胞和促红细胞生成素这些特点，实验将骨髓间充质干细胞经促红细胞生成素基因修饰后移植到脑梗死的大鼠脑损伤处，来提高骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的效果。实验的研究结果证明，促红细胞生成素基因修饰骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑梗死具有神经保护作用，能进一步提高骨髓间充质干细胞移植的治疗大鼠脑梗死的效果，为脑梗死的治疗提供了新的实验依据。

实验观察了接受骨髓间充质干细胞移植治疗4周后大鼠梗死区病理结构的变化，在脑梗死模型组可见梗死处脑组织被胶质细胞和胶质纤维充填，形成胶质瘢痕。骨髓间充质干细胞组见在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变。促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组出现典型的神经细胞样形态学改变且软化灶消失，有少量瘢痕，提示神经元处于修复状态。bcl-2/bax是细胞凋亡的重要调控基因。bcl-2的超表达使细胞生存期延长，bcl-2是具有抗凋亡特性的蛋白, 参与调控神经细胞凋亡发生的过程，bcl-2表达增加可起到抑制细胞凋亡的作用^[23]；而bax的超表达则使细胞凋亡，二者不同程度的表达在神经细胞的凋亡、分化中起重要作用。实验分子生物学研究表明，在促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞组中，bcl-2的表达明显高于骨髓间充质干细胞组及模型组；bax的表达明显低于骨髓间充质干细胞组及模型组。表明促红细胞生成素-骨髓间充质干细胞移植对神经损伤的修复可能通过bcl-2/bax途径发挥作用。

总之，促红细胞生成素修饰的骨髓间充质干细胞尾静脉移植治疗大鼠脑梗死，可使移植的骨髓间充质干细胞在损伤部位更好的存活、增殖分化与迁移，还可有效提高细胞移植治疗的有效率，促进脑梗死后大鼠神经功的恢复。为今后临床开展治疗脑梗死的研究提供理论依据和实验基础。

文章快阅

延伸阅读

近年来，促红细胞生成素的神经保护作用也渐被认识。在神经细胞中，促红细胞生成素引起的促红细胞生成素R的激活是由初始事件的复杂级联反应引起的。受体属于Ⅰ型细胞因子受体超家族，由两个二聚体和同源性。当促红细胞生成素与促红细胞生成素R，诱导的受体二聚化，酪氨酸蛋白激酶2(Janus酪氨酸激酶2的磷酸化，自动JAK-2效应)和受体的激活。JAK-2激活导致下游信号通路的磷酸化，包括Ras-有丝分裂-激活-蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)途径，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)途径和信号传导-转录活化因子-5(singal transducer and activator of transcription-5，STAT-5)途径。这些路径的促红细胞生成素的神经保护作用是非常重要的，因为特定的MAPK和PI3K信号通路抑制剂废除缺血模型中增加促红细胞生成素神经元存活。此外在神经元，JAK-2和NF-κB信号转导系统之间的相互作用κ通道。通过这条道路，促红细胞生成素保护一氧化氮的毒性和诱导细胞凋亡的神经元兴奋，并通过负反馈调节的JAK-2或我表达成B的过度表达的主导作用，或通过к转染NK-B抑制剂对这种阻滞作用。NK细胞在神经元的抗凋亡作用κB，涉及Akt的活化，双酚A双水杨酸酯磷酸化(坏)和Bcl-XL的调节。另一方面，也可以通过PI3K AKT-1，但是激活，MAPK和stat-5 bcl XL上调控制。因此，通过复杂的相互衔接和细胞通路调控之间完成的促红细胞生成素的保护效果的维持。Akt的活化有助于神经元的存活率，通过稳定线粒体膜电位，细胞色素c释放和防止。一旦从线粒体释放细胞色素C，半胱氨酸蛋白激酶(Caspases)激活和执行家庭激活细胞死亡，导致DNA片段化和磷脂酰丝氨酸(PS)暴露残膜。在自由基移植模型中，通过对PS和DNA薄膜暴露提供保护细胞凋亡神经元激活的促红细胞生成素的断裂，细胞色素C和线粒体膜电位，细胞调节caspase-1，3，8的活性。实验在以往研究的基础上探讨促红细胞生成素修饰的骨髓间充质干细胞尾静脉移植后对脑梗死大鼠神经移植的治疗作用，为指导临床治疗脑梗塞提供理论及实验依据。

全文链接：