新生CD-1小鼠雌性生殖干细胞的建系及生物学特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.022

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (19): 3088-3093.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.022

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

新生CD-1小鼠雌性生殖干细胞的建系及生物学特征

毕海委¹，吴际^1，2

1上海交通大学Bio-X研究院，遗传发育与精神神经疾病教育部重点实验室，上海市 200240
2宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004

修回日期:2014-03-27 出版日期:2014-05-07 发布日期:2014-05-07
通讯作者: 吴际，教授，博士生导师，上海交通大学Bio-X研究院，上海市 200240
作者简介:毕海委，男，1988年生，河南省商水县人，汉族，2011年河南农业大学毕业，硕士，主要从事雌性生殖干细胞分化机制方面的研究。
基金资助:
国家重大科学研究计划 (2013CB967401)；国家自然科学基金(81370675)

Establishment and characterization of CD-1 neonatal female germline stem cell lines

Bi Hai-wei¹, Wu Ji^{1, 2}

1Key Laboratory for the Genetics of Developmental & Neuropsychiatric Disorders (Ministry of Education), Bio-X Institutes, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
2Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Revised:2014-03-27 Online:2014-05-07 Published:2014-05-07
Contact: Wu Ji, Professor, Doctoral supervisor, Key Laboratory for the Genetics of Developmental & Neuropsychiatric Disorders (Ministry of Education), Bio-X Institutes, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Bi Hai-wei, Master, Key Laboratory for the Genetics of Developmental & Neuropsychiatric Disorders (Ministry of Education), Bio-X Institutes, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Supported by:
the National Basic Research Program of China, No. 2013CB967401; the National Natural Science Foundation of China, No. 81370675

摘要/Abstract

摘要：

背景：传统观点认为雌性哺乳动物出生后不再产生新的卵母细胞，近年来多项研究表明出生后哺乳动物卵巢中存在能再生卵子的雌性生殖干细胞。
目的：从新生CD-1小鼠卵巢中分离、纯化雌性生殖干细胞并建系及进行生物学特征研究。
方法：通过两步酶消化法和免疫磁珠分选从新生CD-1小鼠卵巢中分离与纯化雌性生殖干细胞并体外长期培养，然后通过RT-PCR、细胞免疫荧光化学和核型分析鉴定其生物学特征。
结果与结论：从3-5 d龄CD-1小鼠卵巢中分离出雌性生殖干细胞并建立细胞系，目前已在体外长期培养15个月，共传代70多次。该细胞系表达Mvh，Dazl，Oct-4，Stella，Blimp1，Fragilis等生殖细胞标志物，同时通过Fragilis和BrdU的双免疫荧光实验证实了其增殖活性和生殖细胞特性；核型分析发现该细胞系也具有正常的二倍体核型。因此CD-1小鼠卵巢中存在具有有丝分裂活性和正常的核型的雌性生殖干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 雌性生殖干细胞, 分离, 纯化, 鉴定, 生物学特征, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In traditional view, the germ cells in mammal ovaries were considered to lose the capacity of self-renew after birth. However, recent studies have showed the existence of female germline stem cells (FGSCs) which take the responsibility for regenerating oocytes in the ovaries of postnatal mammals.
OBJECTIVE: To establish the FGSC line and to explore the biological characterization of the FGSC line from neonatal CD-1 mouse ovaries.
METHODS: Using two-step enzymatic digestion and immunomagnetic purification, Fragilis-positive cells were isolated from neonatal CD-1 mice ovaries and subjected to long-term culture. Then their biological characteristics were studies with RT-PCR, fluorescent immunocytochemistry and cytogenetic analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: FGSCs from neonatal CD-1 mice aged 3-5 days were isolated and long-term cultured for 70 passages to establish a cell line. This cell line expressed Mvh, Dazl, Oct-4, Stella, Blimp1, Fragilis, and was proven to be mitotically active germ cells by BrdU/Fragilis dual immunofluorescence analysis. Moreover, cytogenetic analysis by Gimsa staining confirmed their normal karyotype. In all, these results indicate the existence of FGSCs with mitotic activity in neonatal CD-1 mouse ovaries.

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Key words: stem cells, reproduction, germ cells, cell proliferation, oocytes, biology

中图分类号:

R394.2

毕海委，吴际. 新生CD-1小鼠雌性生殖干细胞的建系及生物学特征[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 3088-3093.

Bi Hai-wei, Wu Ji. Establishment and characterization of CD-1 neonatal female germline stem cell lines[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 3088-3093.

图/表（结果） 2

2.1 体外分离纯化雌性生殖干细胞 利用Fragilis从CD-1小鼠卵巢分选出的细胞呈圆形或者椭圆形，核质比率较高，直径在10-20 μm(图1A)。由于选择的分选标志物蛋白Fragilis在不同时期的生殖系细胞中都有表达，因此会分选到少数直径大于 20 μm 的细胞，根据形态学判断可能是卵母细胞。在培养这些潜在的雌性生殖干细胞的过程中，观察到随着培养时间的延长，进行有丝分裂的细胞数目增加。在第2天时，就有少数细胞出现分裂现象(图1B)；在第4天可以明显看出有些细胞正在进行有丝分裂，两个细胞紧密连接还未完全分开(图1C)；在第6天观察到四至五个细胞连成串珠状，成簇生长的现象(图1D)。由此可以看出，在体外培养的第1周就已经有少数细胞在进行有丝分裂。把分选出的细胞在体外培养3周后，通过免疫荧光双标记染色实验来检测生殖细胞标志物Fragilis的表达情况和细胞的增殖活性。结果显示，培养的细胞能同时检测到Fragilis和BrdU的信号(图2)。这说明通过Fragilis标志物蛋白分选出的细胞经过3周体外培养后，均为具有增殖活性的生殖细胞即生殖干细胞。

2.2 体外长期培养雌性生殖干细胞 纯化后细胞铺在预先制备好的STO饲养层培养，每2 d更换1次培养液，每五六天传一次代。吸附在细胞上的磁珠在下次传代时可以用磁珠分选架去除。在细胞培养初期，少数细胞出现有丝分裂，但增殖不明显，有一部分细胞逐渐凋亡，最终破碎消失。体外培养两三周后，细胞增殖明显，有些会成簇生长，但这些细胞集落与胚胎干细胞集落不同，而是与精原干细胞集落相似(图3A)。此后细胞稳定生长，每四五天可以传代，具体情况可根据细胞生长速度和密度调整。按照目前的培养体系，细胞已经在体外培养15个月之久，传代70次以上，现在细胞仍然能正常分裂增殖(图3B)。在此期间，细胞经过冻存后复苏依然可以继续培养，并且保持良好的增殖活性。
2.3 体外长期培养的雌性生殖干细胞的免疫荧光检测 为了进一步验证实验长期培养的能正常进行有丝分裂增殖的细胞依然是雌性生殖干细胞，实验对体外培养长达1年的细胞进行MVH免疫荧光检测。结果所培养的细胞均能检测到MVH信号(图3C)，证明实验所培养的细胞仍为雌性生殖干细胞。

2.4 体外检测雌性生殖干细胞标志基因 从培养的细胞中抽提总RNA，并通过反转录聚合酶链式反应从mRNA的水平检测雌性生殖干细胞标志基因的表达情况。以5 d龄小鼠卵巢总cDNA为阳性对照，以STO细胞的总cDNA为阴性对照，检测了Mvh，Dazl，Oct-4，Stella，Blimp1，Fragilis的表达。检测结果显示，实验培养的细胞表达生殖细胞标志物(图4A)，因此可以证实体外长期培养的细胞是雌性生殖干细胞。

2.5 细胞核型分析 通过核型分析检测，发现所培养的细胞染色体数目为40条(图4B)，属于正常的二倍体核型，表明细胞在体外培养至40代细胞期间可以保持正常核型。

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引言

由于雄性哺乳动物一生均能进行精子发生以补充不断消耗的精子，因此人们很早就认识到雄性哺乳动物中精原干细胞的存在^[1-2]。然而长期以来，人们普遍认为出生后雌性哺乳动物的生殖细胞不具备增殖活性。Waldeyer早在1870年就提出雌性哺乳动物固定卵子库的定论，他认为雌性哺乳动物在出生时或出生不久就停止卵子发生，卵子库总数固定不再更新^[3]。随而人们对雌性哺乳动物出生后是否有卵子发生进行激烈争论。1921年，出生时卵子数量已固定的论断被Pearl等再次确认^[4]。1951年，Zuckerman对当时的数据总结后认同Waldeyer提出的经典定论^[5]。因此，学术界普遍接受这一论断。2004年Johnson等^[6]经过测定出生后不同天数小鼠未闭锁卵泡数和闭锁卵泡数后发现卵泡闭锁发生率要高于未闭锁卵泡数量的减少率等，提示出生后哺乳动物卵巢中存在卵泡再生现象。然而，次年(2005 年)同一课题组即Johnson等^[7]对用白消安和环磷酰胺处理得到的雌性不育小鼠进行骨髓或外周血移植，发现在不育雌鼠体内产生了供体的生殖细胞并进入到正常的卵子发生周期而维持较长时间。因此，他们得出结论：导致上述成年小鼠卵巢的卵泡再生活动是来源于骨髓和外周血的类生殖系干细胞。Eggan 研究组骨发现共用循环系统的小鼠并不能产生嵌合卵泡，从而否定骨髓或外周血是卵泡再生来源的结论^[8]。

2009年作者实验室从新生和成年小鼠卵巢中成功分离纯化出一种具有有丝分裂活性的生殖细胞，并在体外培养长达15个月^[9]。将这种细胞移植到药物处理的不育小鼠卵巢内，可以使其恢复生殖能力并产生正常后代。因此推断，这类细胞就是雌性哺乳动物卵巢内类似于精原干细胞的生殖系干细胞，于是将其命名为雌性生殖干细胞。2010年作者实验室用病毒转染的方法将带有外源基因GFP，Oocyte-G1等导入雌性生殖干细胞，再将这些雌性生殖干细胞移植到不孕小鼠卵巢内成功构建成转基因小鼠^[10]。这种方法的转基因效率高达30%左右，而且只需要2个月便能得到转基因后代，既高效又节省时间，在哺乳动物转基因方面有很广阔的应用前景。紧接着在2011年作者实验室研究发现使用Fragilis能有效提高雌性生殖干细胞的分选效率，这一发现为雌性生殖干细胞的研究工作有很大的促进作用^[11]。2010年Pacchiarotti等^[12]也从小鼠卵巢中分离出一种生殖系干细胞并在体外培养1年之久。同年，日本科学家Nakamura等^[13]在清鳉鱼中也发现了支持卵子再生并能产生后代的生殖系干细胞；2013年有研究人员报道在斑马鱼发现雌性生殖干细胞^[14]。2012年美国科学家Tilly课题组按照作者实验室的培养方法与分选原理^[15]，发现在成年育龄妇女卵巢中也存在能进行卵子发生的生殖干细胞他们命名为卵巢干细胞。

最近，作者实验室最新研究发现为在大鼠卵巢中也存在雌性生殖干细胞，目前越来越多的证据表明出生后的哺乳动物卵巢内存在能进行自我更新并支持卵子发生的生殖干细胞^[16]。然而，从CD-1小鼠卵巢中分离纯化雌性生殖干细胞并对其进行生物学特征性分析还未见报道。因此，本文将探讨新生CD-1小鼠卵巢中雌性生殖干细胞的生物学特征。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：体外细胞培养实验。

时间及地点：于2011年9月至2013年11月在上海交通大学Bio-X研究院分子生殖与干细胞实验室完成。

材料：

实验动物：健康3-5 d龄CD-1雌性小鼠8只，购自复旦大学医学院实验动物科学部，实验过程中对动物处理均按照国家实验动物护理和使用指南(National Research Council Guide for Care and Use of Laboratory Animals)进行。

实验方法：

雌性生殖干细胞的分离、纯化：依次用断颈法处死8只CD-1小鼠，将小鼠置于超净台上，用体积分数75%乙醇棉球擦洗小鼠腹部，进行消毒，尽快将小鼠剖腹并取出双侧卵巢，将取出的卵巢置于含少量体积D-Hank’s液的冰浴35 mm平皿中。用“两步酶消化”法分离雌性生殖干细胞。用剪刀剪碎收集的卵巢，加入4 mL D-Hank’s缓冲液配制的胶原酶中，在37 ℃水浴锅中震荡消化25 min后1 000 r/min离心5 min去上清，再用PBS洗2次，然后加入3 mL D-hank’s缓冲液配制的胰蛋白酶中消化6 min。当大部分细胞分散开时，用体积分数10%胎牛血清终止消化，于1 000 r/min离心5 min，吸去上清，用PBS重悬细胞，移去絮状组织团块，即可进入下一步骤。

在一个2 mL无菌离心管中加入200 μL PBS、2 μL羊抗兔二抗磁珠(5×10⁸/mL)，1 μL兔抗-Fragilis 一抗混匀，封口置于300 r/min、室温摇床震荡孵育30 min；将孵育好的抗体磁珠混合液在磁珠分选架上放置2 min，待磁珠紧贴离心管内壁后，吸去所有液体并用PBS再洗2次，然后将粗分离的细胞重悬液加入到上述离心管中，再用200 μL PBS洗1次，转到离心管中，封口置于300 r/min、室温摇床震荡孵育30 min；将离心管置于磁珠分选架上，室温静置三四分钟，然后轻轻吸去所有液体；再加400 μL PBS到离心管中，润洗1次，吸去所有液体，从而除去未与磁珠结合的细胞，获得纯化的细胞；加400 μL细胞培养液到离心管中，轻轻重悬细胞转移到STO饲养层上，置于37 ℃细胞培养箱中培养。

雌性生殖干细胞的体外培养：雌性生殖干细胞以丝裂霉素C处理后的STO细胞作为饲养层，在37 ℃，体积分数5% CO₂的培养箱中培养。每两天更换一次培养液，每五六天传1次代。STO细胞培养基为89%高糖DMEM，1%的非必需氨基酸，10%的胎牛血清，30 mg/L的青霉素。STO细胞用丝裂霉素C处理3 h，然后PBS洗5次，接种到0.2%明胶包被的48孔板中。雌性生殖干细胞的培养基成分为85% MEM-α，体积分数10%胎牛血清，1 mmol/L丙酮酸钠，1%的非必需氨基酸，2 mmol/L谷氨酰胺，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，10 μg/L白血病抑制因子，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，10 μg/L表皮生长因子，10 μg/L胶质细胞源性神经营养因子，15 mg/L的青霉素。

双免疫荧光鉴定：在室温下，用4%的PFA固定雌性生殖干细胞15 min，然后用体积分数10%的山羊血清(用PBS配制)封闭，37 ℃下封闭10 min，吸去封闭液加入anti-Fragilis一抗(polyclonal antibody，1∶150)和anti-BrdU一抗(monoclonal antibody，1∶200)于4 ℃孵育过夜。吸去一抗，避光加入FITC结合的羊抗兔IgG二抗 (1∶200)和羊抗鼠IgG二抗(1∶200)，37 ℃孵育30 min后吸去二抗，用PBS洗两次后加入DAPI染色10 min，显微镜下观察结果。或吸去封闭液后加入anti-MVH一抗(polyclonal antibody，1∶150)，随后加二抗步骤同前。

RT-PCR检测已知的标记基因：按照生产商说明步骤，用Trizol抽提总RNA。两步法进行RT-PCR反应，以GAPDH基因为内参，以STO为阴性对照，以卵巢总RNA为阳性对照，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，引物序列见表1。

核型分析：加入含0.1 mg/L秋水仙素的培养液处理对数期的雌性生殖干细胞3 h，弃去培养液，PBS洗1次，0.05%胰酶消化2 min，1 000 r/min离心5 min，吸去上清，用PBS重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，吸去上清；低渗：沿管壁加入少量37 ℃预热的低渗液(75 mmol/L KCL)轻弹管壁并缓慢加入更多的低渗液使总体积达到5 mL，37 ℃低渗15 min，每隔5 min轻弹1次，沿管壁加入新鲜配制的Carnoy固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1，体积比)200 μL，轻弹混匀，进行预固定；1 000 r/min离心5min；固定：吸去上清，轻弹管壁使细胞重悬，沿管壁加入少量固定液，轻弹使细胞完全重悬，加入更多的固定液使体积达到4 mL；室温固定细胞30 min，每10 min轻弹；固定2次；滴片：最后一次固定后吸去上清，用固定液将细胞团块重悬，从1 m高处向-30 ℃乙醇中浸泡的载玻片上滴片，使细胞较均匀分布，然后至60 ℃烤干；G显带：室温老化3 d后，将玻片放在60 ℃烘箱中过夜，在预热的37 ℃的0.025%胰酶溶液中消化，自来水漂洗终止胰酶消化，Giemsa染色10 min，自来水冲洗干净，风干后油镜观察。

主要观察指标：①雌性生殖干细胞体外培养与形态观察。②雌性生殖干细胞标志物检测。③雌性生殖干细胞的核型分析。

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讨论

有研究表明，雄性小鼠睾丸中精原干细胞的数量是不断变化的，小鼠从出生到5-12 d，精原干细胞总数增加了6.4倍，到成年时增加了近39倍之多^[17]。虽然精原干细胞数量有所增加，但是其在全部睾丸细胞总数中所占比例却在降低，比如在新生小鼠睾丸中精原干细胞的比例在1.41%左右，而在成年小鼠睾丸中该比例仅为0.03%^[18]。由此可见，选择合适大小的雄性小鼠来分离精原干细胞将有利于取得最佳效果，而有研究表明，6 d小鼠最适于分离精原干细胞^[19]，因该时期的雄性生殖细胞全部为精原干细胞。相比于精原干细胞，雌性生殖干细胞在卵巢全部细胞中所占比例更低。有研究报道，在刚刚成年的小鼠卵巢中雌性生殖干细胞所占比例大约为0.014%^[15]。因此，选择合适大小的雌性小鼠来分离雌性生殖干细胞显得更为重要。然而, 选择哪组年龄分离雌性生殖干细胞为最佳需进一步探索。

文章通过两步酶消化法从3-5 d CD-1小鼠卵巢中成功分离出雌性生殖干细胞并纯化培养，成功在体外长期培养15个月(传70代)以上。同时对已建立的分离与培养条件进行优化，发现适当延长胶原酶消化时间，减少胰蛋白酶消化时间以及减少卵巢表面脂肪组织有利于粗分离细胞；纯化后的初始培养在48孔板中进行。在体外长期培养过程中，实验选择MEM-α培养基为基础，然后添加体积分数10%胎牛血清、细胞生长因子如白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子^[20-21]、非必须氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸钠、β-巯基乙醇等成分，并且用丝裂霉素C处理后的STO细胞作为饲养层细胞。这和精原干细胞的培养条件较为相似^[21-23]。在细胞培养初期，由于细胞的生长环境突然由体内变为体外，细胞的生长很慢，甚至停滞，但是当细胞适应体外培养环境后，会逐渐恢复正常生长。恢复正常生长的雌性生殖干细胞有些会成簇生长，其在形态和大小与本实验室前期报道的精原干细胞特征极为相似^[24-25]。

通过反转录聚合酶链式反应检测体外培养的细胞能够表达Mvh，Dazl，Oct-4，Stella，Blimp1，Fragilis等生殖细胞的标志物，细胞免疫荧光化学显示培养3周时的细胞是BrdU和Fragilis双阳性，对体外培养传代40次左右的细胞进行免疫荧光检测，发现该细胞仍是MVH阳性。这些结果说明该细胞是一种能进行有丝分裂的生殖细胞，即雌性生殖干细胞。

小鼠是二倍体物种，染色体为40条，小鼠的配子经过减数分裂是单倍体，染色体为20条。做饲养层用的STO细胞是经过遗传改造过的小鼠成纤维细胞，其染色体会发生变异，不规则^[26]。所以培养的如果是雌性生殖干细胞，那么它应该是正常的二倍体。通过核型分析发现，体外培养的细胞具有稳定的正常二倍体核型。

总之，实验成功建立了CD-1小鼠雌性生殖干细胞系。在基础研究方面，雌性生殖干细胞系的建立为雌性生殖干细胞在体内外增殖和分化调控机制的研究奠定了基础；在应用研究方面，雌性生殖干细胞系的建立将为经生殖干细胞途径构建基因修饰模型鼠提供材料，对生殖相关药物筛选提供细胞来源。

新生CD-1小鼠雌性生殖干细胞的建系及生物学特征

Establishment and characterization of CD-1 neonatal female germline stem cell lines

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