人胎盘不同组织分离间充质干细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：胎盘间充质干细胞来源稳定，正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源。
目的：比较从胎盘组织绒毛膜与绒毛滋养层分离获取人胎盘间充质干细胞生物学特性的差异。
方法：手术剪剥离人胎盘表面羊膜，分别剪取胎儿侧的绒毛膜与绒毛滋养层组织机械破碎后，分别加含Ⅱ型胶原酶的PBS消化液消化，分离为单个核细胞，用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、体积分数5%CO2、95%饱和湿度下培养，48 h后全量换液，去除非贴壁细胞，添加新鲜培养基，当细胞融合90%左右时，胰酶传代。通过观察原代细胞总数，细胞生长形态，以及间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105的流式细胞测定结果比较从不同胎盘组织分离获得胎盘间充质干细胞的差异。
结果与结论：流式细胞仪测定结果显示，从绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞间充质干细胞表面标记CD90、CD73以及CD105的阳性率都在90%以上，两种来源的细胞生长都呈现典型的成纤维细胞形态，这表明绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞都具有间充质干细胞的特性。提示消化时间相同，酶浓度相同，以及摇床转速相同的情况下，可从绒毛膜中可以得到更多的细胞，对于后续培养更易获得较多的细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 胎盘, 间充质干细胞, 绒毛膜, 绒毛滋养层, Ⅱ型胶原酶, 流式细胞仪, CD90, CD73, CD105

Abstract:

BACKGROUND: Human placenta is a stable source for mesenchymal stem cells, which is becoming a cell source in the regenerative medicine that attracts widespread attentions.
OBJECTIVE: To compare the biological characters of mesenchymal stem cells that separated from different components of human placenta (human chorion and villous trophoblast).
METHODS: The amniotic membrane of placenta surface was detached surgically. Human chorion and villous trophoblast in the fetal side was cut into pieces. After digestion with PBS containing collagenase II, mononuclear cells were separated and cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% fetal bovine serum in 37 ℃ and 5% CO2, 95% saturated humidity, after 48 hours the full amount in liquid, dislodge suspension cells. Forty-eight hours later, the medium was changed completed, and non-adherent cells were removed. When cell fusion reached about 90%, trypsin digestion was employed for cell passage. Biological characters of mesenchymal stem cells separated from different components of human placenta were compared through observation of total number of primary cells, cell morphology, and surface markers expression (CD90, CD73 and CD105).
RESULTS AND CONCLUSION: The flow cytometric analysis revealed that the cells separated from the human chorion and villous trophoblast were over 90% strongly positive for CD90, CD73, CD105. These two sources of cells showed typical fibroblast morphology, suggesting that the cells have the characteristics of mesenchymal stem cells. Under the same enzyme digestion time, enzyme concentration, and shaking speed, more cells are visible from the chorion, and the subsequent culture is easier to harvest cells.

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Key words: stem cells, placenta, mesenchymal stem cells, chorion, collagenases

中图分类号:

R394.2

洪艳，霍思维，陆瑶，章毅. 人胎盘不同组织分离间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 3082-3087.

Hong Yan, Huo Si-wei, Lu Yao, Zhang Yi. Biological characters of mesenchymal stem cells separated from different components of human placenta[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 3082-3087.

图/表（结果） 3

2.1 胎盘间充质细胞的分离及传代培养 从绒毛膜和绒毛滋养层分离细胞的原代及传代扩增培养比较：实验结果表明通过用Ⅱ型胶原酶消化相同体积的绒毛膜和绒毛滋养层都能够得到较均一的胎盘间充质干细胞(表1)。结果表明，相同体积的绒毛膜与绒毛滋养层在原代分离时，绒毛滋养层分离得到的细胞数，超过了绒毛膜分离得到的细胞数，但经过一段时间的培养，由于绒毛滋养层原代分离时，残留的血细胞太多，严重影响了间充质干细胞的贴壁和后续培养，从而导致绒毛滋养层组织细胞分离培养后，无法得到丰富的间充质干细胞，而绒毛膜在清洗的时候可以较为容易的清洗干净，残留的血细胞较少，经培养后得到丰富且状态较好的间充质干细胞。虽有些文献中提出可以添加红细胞裂解液处理，但是考虑到后续处理以及临床要求，这种处理方式是不可取的，故以上结果表面从胎盘组织中分离间充质干细胞选择绒毛膜要优于选择绒毛滋养层。

从绒毛膜和绒毛滋养层分离细胞形态比较：倒置相差显微镜下观察，原代细胞接种48 h后，大部分细胞贴壁，形态为典型成纤维细胞样，以长梭形为主，大量细胞呈涡旋状生长，未贴壁细胞圆而亮。其中图2A是从胎盘绒毛膜中分离的间充质干细胞经12 d的培养，细胞已经达到P2代，已经进行了至少2代的扩增繁殖，从图片上可以看出细胞仍然保留间充质干细胞的生长形态；图2B是从同一胎盘中同时期取绒毛滋养层组织分离的间充质干细胞，经12 d的培养，细胞量仍然很少。从绒毛膜中分离的原代间充质干细胞培养7 d左右，可见细胞克隆显著增多并融合成片，即可进行传代。传代培养的细胞接种2-4 h 即可贴壁。传代初期细胞形态以长梭形成纤维细胞为主^[31-33]。图2表明采集绒毛膜分离的细胞干净，生长快速，而绒毛滋养层组织中分离得到的原代的间充质干细胞经12 d的培养，细胞仍然很稀少，需要更多时间的培养，由此可见绒毛膜分离的间充质干细胞在细胞后续扩增培养研究方面具有很大优势。究其原因，推测可能是绒毛滋养层血细胞含量高，严重影响了间充质干细胞的贴壁生长，导致后期生长受限制，从前期的分离数据看无论是从绒毛膜还是从绒毛滋养层组织都能得到一定数量的细胞，但在后续培养过程中，从表1和图2表明从绒毛膜分离的间充质干细胞悬液在接种后更易培养。

2.2 胎盘间充质细胞干细胞特异性抗原的鉴定 为了进一步鉴定胎盘间充质细胞的干细胞特性，对胎盘间充质细胞进行了干细胞特异性表面抗原的鉴定。利用流式细胞仪对胎盘间充质细胞表面分子CD90、CD73、CD105进行分析，结果表明，胎盘间充质细胞表达CD90、CD73、CD10等间充质干细胞表面标志^[34]，证明其具有间充质干细胞特性(表2)。表2显示了从绒毛膜以及绒毛滋养层组织中分离间充质干细胞的CD90、CD73以及CD105的阳性表达率，结果表明无论是从绒毛滋养层还是从绒毛膜组织中分离的细胞，它们的CD90、CD73以及CD105的阳性率都在90%以上，充分说明分离得到的细胞具有间充质干细胞的特性。同时通过比较可以看到，从绒毛膜组织分离的间充质干细胞，在CD90、CD73以及CD105的阳性表达上比从绒毛滋养层组织分离的细胞的阳性率更高，尤其是CD90和CD105的阳性表达，此结果可以表明从绒毛膜中分离的间充质干细胞纯度较高。

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引言

间充质干细胞是干细胞的一种类型，具备干细胞的两个重要特征：很强的自我增殖能力和多分化潜能^[1]。间充质干细胞起源于中胚层，理论上讲它可以向中胚层组织分化^[2-5]。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景，也为不少患有癌症以及白血病的病患带来希望^[6-9]。目前已知对心肌梗死、心肌坏死、糖尿病、骨质疏松、骨坏死、骨囊肿、狼疮性肾炎、肝硬化、肝衰竭、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、帕金森病、脊髓损伤等有一定的治疗效果^[10]。

人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力^[11-13]。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，每10⁵-10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制^[14-16]。

起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源^[17]。

胎盘间充质干细胞在实验动物以及糖尿病伴有重度下肢缺血患者中均有治疗作用。干细胞治疗糖尿病足的机制如下：干细胞能分化成内皮祖细胞，后者可分化为血管内皮细胞，形成新生血管。干细胞移植到缺血的下肢肌肉内，逐渐分化并形成新的毛细血管，改善和恢复下肢血流，达到治疗下肢缺血的目的。干细胞同时可以分泌多种血管生长因子，可促进新生血管的形成，从根本上解决肢体供血问题，保全患病肢体。特别对因严重下肢动脉血管缺血引起的足部疼痛、溃烂、黑色坏疽，可以降低截肢平面或免除截肢痛苦^[18]。

目前胎盘或脐带间充质干细胞主要应用于抑制移植物抗宿主反应^[19]，大多数患者对于胎盘或脐带间充质干细胞具有天然的免疫耐受，这主要是因为：①胎盘在母儿体内起着重要的免疫屏障和激素分泌的作用，所以胎盘来源的间充质干细胞从理论上讲免疫原性更低，甚至不排除无免疫原性的可能，并且其分泌的免疫调节活性因子，对免疫功能排斥具有调节作用。②人胎盘间充质干细胞的HLA-DR表面标记阴性。HLA又称移植抗原，能启动免疫应答。参与T细胞的分化、诱导免疫应答，胎盘问充质干细胞的HLA-DR表面标记阴性提示了其低免疫原性的部分原因。因此，人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中，即便是人-鼠间的异种间移植．但由于存在天然的免疫耐受，对实验研究的结果影响甚小，这对于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。

为了有效地提高胎盘间充质干细胞的体外分离制备所获得的间充质干细胞，文章针对胎盘组织进行了研究。人足月娩出的胎盘由羊膜层、绒毛膜层、绒毛滋养层以及蜕膜层组成^[20]，目前有很多研究表明胎盘中含有大量的有核细胞，作者取胎盘绒毛膜层和绒毛滋养层的组织，分别采用酶消化的方法进行分离制备，结果都得到了丰富的间充质干细胞，但是经过培养发现从绒毛膜层中得到的细胞，更易培养，扩增更快，并且稳定保持间充质干细胞的特性。目前大多数研究者取胎盘小叶(包括绒毛层和绒毛滋养层)进行分离^[21]，往往会发现血细胞太多，使用红细胞裂解液对于间充质干细胞的损伤大，使用淋巴细胞分离液进行分离的可重复性较差，技术不稳定。文章的比较研究结果最终确定可以仅从胎盘绒毛膜层得到大量、可迅速扩增、稳定培养、保留分化功能的间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2013年3至6月在上海干细胞技术有限公司(嘉定中国干细胞大厦)技术中心研发实验室完成。

材料：

胎盘组织样本：胎盘组织来自上海长宁妇幼保健院临床足月正常剖宫产后胎盘，经与产妇及其家属签署知情同意书，在产房无菌条件下获取胎盘，立即浸入胎盘储存袋[含99%低糖DMEM，1%抗生素(双抗即青链霉素)的组织保护液]，在48 h内转移至实验室，胎盘组织结构图见图1^[22-23]。

方法：

胎盘间充质干细胞的分离：戴好手套，整理消毒生物安全柜，准备无菌敷料镊、手术剪，取出装胎盘的金属盒，置于生物安全柜台面上；用无菌镊子、手术剪剥离胎盘表面羊膜。

从胎盘绒毛膜组织中分离间充质干细胞的方法和步骤：①剪取胎儿侧的绒毛膜层组织10 mL^[24]，置于直径 10 cm培养皿，平皿中装有2/3体积的含有抗生素的(1%的青链霉素)PBS。②用手术剪剪开大的组织块，一边将大的组织块剪成小块^[25]，一边用手术镊夹持进行漂洗，避免溢出，如此重复3遍，至漂洗液清亮，弃漂洗液。③转移绒毛膜层组织至50 mL体积的离心管中，做好标记，用手术剪分别将绒毛膜层组织块剪成约5 mm³大小的碎块^[26]。④向各离心管中加入Ⅱ型胶原酶消化液，各加入Ⅱ型胶原酶10 mL (酶消化终浓度0.1%)^[27]，置于摇床内37 ℃、250 r/min振荡，约 90 min后终止消化。⑤加PBS至50 mL，300 r/min，5 min；收集上清，20 mL一管，加PBS至50 mL，2 000 r/min，10 min弃上清。⑥用10 mL PBS, 重悬细胞混匀并一管，加PBS至50 mL，2 000 r/min，10 min。⑦弃上清，加入10 mL完全培养基，取20 μL细胞悬液加入80 μL的红细胞裂解液用于细胞计数。⑧按照计数结果3×10⁶/皿，接种若干Ø100 mm 细胞培养皿，37 ℃体积分数5%CO₂培养。⑨48 h换液，以后每3 d换液1次，直至细胞可以进行传代。
从胎盘绒毛滋养层组织中分离间充质干细胞的方法和步骤：①剪取胎儿侧的绒毛膜层下面的绒毛滋养层组织 10 mL，置于直径10 cm培养皿，平皿中装有2/3体积的含有抗生素的(1%的青链霉素)PBS。②用手术剪剪开大的组织块，一边将大的组织块剪成小块，一边用手术镊夹持进行漂洗，避免溢出，如此重复3遍，至漂洗液清亮，弃漂洗液。③转移绒毛滋养层组织至50 mL体积的离心管中，做好标记，用手术剪将绒毛滋养层组织块剪成约5 mm³大小的碎块。④向离心管中加入Ⅱ型胶原酶消化液，各加入Ⅱ型胶原酶10 mL(酶消化终浓度0.1%)，置于摇床内37 ℃、250 r/min振荡，约90 min后终止消化。⑤加PBS至50 mL，300 r/min，5 min；收集上清，20 mL一管，加PBS至50 mL，2 000 r/min，10 min弃上清。⑥用10 mL PBS，重悬细胞混匀并一管，加PBS至50 mL，2 000 r/min，10 min。⑦弃上清，加入10 mL完全培养基，取20 μL细胞悬液加入 80 μL的红细胞裂解液用于细胞计数。⑧按照计数结果3×10⁶/皿，接种若干Ø100 mm 细胞培养皿，37 ℃体积分数5%CO₂培养。⑨48 h换液，以后每3 d换液1次，直至细胞可以进行传代。

胎盘间充质细胞的继代培养：细胞生长至80%时，每皿加入1.0-2.0 mL的0. 25%胰酶(含EDTA)进行消化传代。传代时，消化三至四分钟，加含有血清的细胞培养液终止消化，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，并补加PBS至50 mL，1 200 r/min，离心5 min，弃含消化液的上清，加入细胞完全培养液吹打混匀，计数，按照约1.5×10⁶/皿接种于细胞培养皿(100 mm)中，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养。

胎盘间充质细胞干细胞特异性抗原的鉴定：

细胞处理：选取处于指数生长期的第3代或冻存复苏后正常生长中的胎盘间充质细胞，每皿加入1.0-2.0 mL的0.25%胰酶(含EDTA)进行消化。消化三至四分钟，加含有血清的细胞培养液终止消化，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，并补加PBS至50 mL，1 200 r/min，离心5 min，弃含消化液的上清，加入1 mL PBS吹打混匀，计数，调整细胞总数为5×10⁶，补加PBS至50mL，再次离心1 200 r/min，5 min。

样品处理以及结果的获取：取6只试管，每管分别加5 μL 鼠抗人单克隆抗体CD90-FITC、CD44-PE、CD73-APC、CD105-PerCP-Cy^TM5.5，以鼠抗人IgG2a-PE、IgG1-PE作为阴性对照，再分别加入150 μL 细胞悬液混匀，室温避光放置30 min，之后再用PBS洗2次，1 000 r/min，离心 5 min，弃上清，加少量约300 μL PBS上机测试。流式细胞仪检测，Cellquest 软件获取结果并分析结果。间充质干细胞的CD90、CD73、CD105应呈强阳性标记^[28-30]。

主要观察指标：通过观察原代细胞总数，细胞生长形态，以及间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105的流式细胞测定结果比较从绒毛膜和绒毛滋养层分离获得胎盘间充质干细胞的差异。

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讨论

胎盘是由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官，其中除含有滋养细胞外，还含有大量血管及间充质成分。胎盘间充质干细胞是近年来新发现的从胎盘获取的一类干细胞，与从脐血或骨髓中提取的干细胞相比较，不但可提取干细胞数量多，而且可分化成更多种类的组织细胞^[35]。研究人员从细胞表面抗原分析发现，胎盘间充质干细胞是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的新种干细胞，它不太可能被受者的免疫系统拒绝^[36]。胎盘来源干细胞因取自生产后的胎盘组织，其收取过程对母体和新生儿不造成任何损伤，来源不受伦理学和临床医学的限制，是理想的干细胞保存与利用的资源^[37]。

本文中采用Ⅱ型胶原酶消化的方法从胎盘的不同组织绒毛滋养层和绒毛膜中分离出胎盘间充质干细胞。从绒毛膜中分离的间充质干细胞在连续传代培养过程中细胞形态始终保持一致，未发现分化细胞形态出现。而从绒毛滋养层中分离间充质干细胞，虽然从组织中获得的细胞不少，但是由于绒毛干中血细胞太多严重影响细胞的贴壁，导致后期培养过程中，细胞无法较好的生长增殖。当然经过一段时间的培养绒毛滋养层中分离的间充质干细胞也能够表现出干细胞快速生长的特性，从表1和图2中可以看出在2周内绒毛滋养层细胞还处于细胞稀少的原代，这是由于血细胞较多，需要多次换液，经过1周的培养细胞快速长满并进行传代扩增，间充质干细胞原代进行传代操作后细胞能在二至三小时内贴壁，二至三天进行再次扩增传代。

由于培养细胞的形状不能作为鉴别细胞类型的主要特征标志，因此，通常都采用流式细胞术对细胞表面抗原分子进行鉴定^[38]。本次实验中，对所获得的间充质干细胞表面抗原鉴定结果表明该细胞可表达CD90、CD73、CD105等间充质干细胞表面标志，证明所分离的细胞属于间充质干细胞，而且从流式细胞术的结果看，绒毛膜层组织分离得到的间充质干细胞的CD90、CD73、CD105分别达到了99.78%、100%、98.70%，绒毛滋养层的CD90、CD73、CD105分别达到90.54%、99.37%、95.78%具有相当高的阳性表达，两种组织所分离的细胞表达的CD90、CD73、CD105阳性率都达到90%以上，表明绒毛滋养层和绒毛膜中通过作者的分离方法得到的细胞主要是间充质干细胞。针对这样的细胞后续可以做很多的科研研究，通过诱导可以向成脂细胞、成骨细胞、软骨细胞进行分化。

本实验通过细胞培养以及细胞表面特异性抗原的分析鉴定可以得出以下结论：①分离过程中，从绒毛膜和绒毛滋养层得到的细胞量都很多，绒毛滋养层的细胞量甚至会超越绒毛膜的细胞量。②接种后培养，由于绒毛滋养层血细胞较多，血细胞难以处理，影响间充质干细胞的贴壁，无法贴壁就无法继续生长，由此导致后期细胞生长慢，收获细胞少。③通过测定间充质干细胞表面的特异性抗原确定从绒毛膜和绒毛滋养层分离得到的都是间充质干细胞，从绒毛膜中分离得到的间充质干细胞的纯度较从绒毛滋养层组织分离得间充质干细胞高。④总体表明从胎盘组织中制备分离间充质干细胞，取绒毛膜层组织具有显著优势。

胎盘间充质干细胞来源稳定，正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源。本文成功从胎盘组织的绒毛膜和绒毛滋养层中分离得到胎盘间充质干细胞，并通过对其连续传代过程中的遗传稳定性，以及细胞表面分子表达情况检测等验证了该细胞的干细胞特性，从而建立了较完善的细胞分离培养、保存及鉴定的体系，为进一步研究胎盘间充质干细胞的生物学和免疫学特性、分化能力，以及将其作为临床应用的种子细胞等提供了材料^[39]。同时胎盘在临床上为废弃物，具有取材方便，征得同意后应用不涉及伦理问题，与捐献骨髓或采集动员外周血相比，供者无痛苦，感染机会少，导入外源基因比较方便并能长期稳定表达且免疫原性较低等特点，将在创伤修复、局部缺血组织的血管再生和组织工程方面发挥不可估量的作用^[40]。