胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合移植保护胰岛

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：胰腺干细胞可在体外维持胰岛的结构，减少胰岛细胞坏死及凋亡，延长胰岛的体外存活时间，保护胰岛的活性。
目的：探索胎鼠胰腺干细胞与胰岛共移植体内保护移植胰岛，提高胰岛移植疗效的可行性。
方法：将成年大鼠35只随机等分为联合移植组、单独胰岛移植组、单纯胰腺干细胞移植组、模型组及对照组，前4组均腹腔注射链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液建立糖尿病模型。联合移植组、单独胰岛移植组、单纯胰腺干细胞大鼠分别在左侧肾包膜下移植分离纯化孕16 d SD大鼠胎鼠胰腺干细胞和/或成年SD大鼠胰岛。
结果与结论：联合移植组大鼠移植后5 d内血糖可降至正常，血浆胰岛素达到正常水平，胰岛存活时间(18.2±2.4) d；单独移植组大鼠血糖可于移植后1周内降至正常，胰岛存活时间(14.4±2.1) d；两组胰岛存活时间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。而其他组糖尿病大鼠血糖均未能降至正常范围。说明胎鼠胰腺干细胞与胰岛共移植可延长胰岛体内存活时间，保护胰岛功能，提高移植疗效。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 胎鼠, 胰腺干细胞, 胰岛, 胰岛移植, 联合移植, 糖尿病

Abstract:

BACKGROUND: Pancreatic stem cells can maintain the islet structure in vitro, reduce necrosis and apoptosis of islet cells, in vitro prolong islet survival, and keep islet activity.
OBJECTIVE: To observe the possibility of preserving viability of islets in vivo by co-transplanting fetal rat pancreatic stem cells and islets so as to improve the outcome of islet transplantation.
METHODS: Thirty-five adult rats were randomly divided into five groups, including co-transplantation, islet transplantation alone, pancreatic stem cell transplantation alone, diabetes control and normal control groups. Diabetic models were established in the former four groups by intraperitoneal injection of streptozotocin-citrate buffer. Pancreatic stem cells from the fetal rats at pregnant 16 days or islets from adult Sprague-Dawley rats.
RESULTS AND CONCLUSION: In the co-transplantation group, the levels of blood glucose and plasma insulin returned to the normal after 5 days of co-transplantation, and the survival time of islets was (18.2±2.4) days. In the islet transplantation alone group, the level of blood glucose was reduced to normal after 1 week of transplantation, and the survival time of islets was (14.4±2.1) days. Significant different was found between the survival time of islets between this two groups (P < 0.05). However, the level of blood glucose was still abnormal in the other groups. These findings indicate that the co-transplantation of fetal rat pancreatic stem cells and islets can prolong the survival time of islets in vivo, protect viability of islets and improve the outcome of islet transplantation.

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Key words: islets of langerhans, islets of langerhans transplantation, pancreas, insulin

中图分类号:

R394.2

张育森，鲍世韵，张悦，李富荣. 胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合移植保护胰岛[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 3054-3059.

Zhang Yu-sen, Bao Shi-yun, Zhang Yue, Li Fu-rong. Co-transplantation of fetal rat pancreatic stem cells and islets of langerhans to preserve viability of islets[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 3054-3059.

图/表（结果） 1

2.1 培养的胎鼠胰腺干细胞 胎鼠胰腺接种于培养板中，可见细胞自组织块中爬出、贴壁生长，细胞呈长梭形，类似成纤维细胞，胞核大近椭圆形，胞核胞浆比例大致相等，随着培养时间延长，细胞可增殖生长并爬满瓶底；取第3代细胞经免疫细胞化学染色可见巢蛋白阳性细胞，证实为胰腺干细胞；经计数可见巢蛋白阳性细胞约占80%。经流式细胞术鉴定巢蛋白阳性细胞约占74.1%，纯度满足进一步实验要求。见图1A，B。

2.2 分离纯化的胰岛 分离纯化后经双硫腙染色，胰岛呈猩红色，圆形或椭圆形，大小不等，包膜完整。15只SD大鼠中，每只胰腺消化后可获得(784±51)个胰岛，Ficoll-400纯化后获得(361±32)个胰岛；回收率平均为46.1%，纯度达90%以上。见图1C，D。

2.3 实验动物数量分析 所有大鼠均进入结果分析。糖尿病模型大鼠腹腔注射40 mg/kg 链脲霉素后，均于3 d内出现多饮症状，3 d后随机血糖均大于16.7 mmol/L，并一直维持高血糖状态。胰腺干细胞和胰岛移植过程顺利，未出现手术相关死亡(术后1周内死亡)，模型成功率100%，见图2A。

2.4 胰腺干细胞和胰岛移植后糖尿病大鼠血糖及血胰岛素水平的变化 联合移植组大鼠均于术后第3天起血糖开始下降，血浆胰岛素水平逐渐升高，术后5 d内血糖可降至正常，血清胰岛素升高至正常水平；单独胰岛移植组大鼠血糖可于术后1周内降至正常，同时血清胰岛素达到正常水平；而观察期间单纯胰腺干细胞移植组大鼠的血糖及胰岛素一直未达到正常。

经重复测量设计的方差分析表明各组间血糖及血胰岛素随时间变化的趋势不同(P < 0.05)，联合移植组大鼠血糖降至正常及血胰岛素升至正常时间均快于单独胰岛移植组，且维持时间更长(P < 0.05)；联合移植组胰岛存活时间明显长于单独胰岛移植组(P < 0.05)。而单纯胰腺干细胞移植组大鼠观察期内移植处于高血糖状态，且血胰岛素水平低(图3)。

2.5 胰腺干细胞和胰岛移植后糖尿病大鼠肾脏组织的病理变化 苏木精-伊红染色显示，联合移植组及单独胰岛移植组大鼠肾下极包膜下均可见残存胰岛，周围可见多量炎症细胞浸润，提示存在排斥反应，部分胰岛已基本破坏，但联合移植组大鼠肾脏组织中的炎症反应较单独胰岛移植组稍轻，且残存胰岛较单独胰岛移植组稍多；而单纯胰腺干细胞移植组大鼠肾下极包膜下可见少量炎症细胞浸润，未见明显胰岛样细胞团形成(图2B)。

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引言

1型糖尿病是一种由于内源性胰岛素分泌缺乏所导致糖代谢紊乱综合征。胰岛素治疗是目前治疗糖尿病的主要方法之一，但在部分脆性1型糖尿病患者，即使是给予最严密的监测和最优化的胰岛素治疗仍难以很好地控制血糖的稳定。对于这些脆性糖尿病患者，利用胰腺移植或者是胰岛细胞移植替代缺失的β细胞是重要的选择之一。过去几十年的经验证明胰腺移植或者胰肾联合移植可以避免常规胰岛素治疗所致的不良反应并延缓糖尿病相关并发症的发生，是1型糖尿病的重要治疗手段；但在外分泌腺处理上的复杂性和手术并发症的严重性亦制约其广泛应用。因此，几乎是与开始利用胰腺移植治疗糖尿病的同时，科学家即开始尝试单纯胰岛细胞移植来替代丢失的β细胞，从而彻底地根治糖尿病。随着2000年埃德蒙顿方案的提出，胰岛移植重新成为人们研究及应用的热点。Edmonton方案来自Alberta大学人体胰岛移植计划，其初步结果显示7例移植患者平均追踪1年，可使100%的受者1年内完全脱离外源性胰岛素^[1]。但在临床实践中，由于胰岛分离技术复杂、分离时间较长以及移植后短时间缺乏血供建立，造成胰岛凋亡及死亡，故常需两三个供者的胰岛才能使患者完全脱离胰岛素^[2-5]。如何延长移植胰岛寿命，降低胰岛使用量，在胰岛移植临床工作中具有重要的意义。

最近研究表明干细胞除了具有较强的增殖分化能力之外，还具有促进损伤组织的修复，促进细胞增生、增殖，维持组织细胞的功能。如间充质干细胞可通过转分化、分泌各种细胞因子、增强组织内源性前体细胞增殖、细胞融合或者线粒体转运等方式而起到修复损伤组织的作用^[6-13]。实验通过观察胎鼠胰腺干细胞与胰岛共移植的疗效，探讨胰腺干细胞体内保护胰岛、延长胰岛寿命的可行性，为临床胰岛移植中保护胰岛提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2007年7月至2008年7月在暨南大学第二临床医学院临床研究中心完成。

材料：

实验动物：选择10周龄、体质量250-300 g的雌性SD大鼠70只，体质量500 g的孕16 d雌性SD大鼠1只，均由广东省实验动物中心提供，动物合格证：SCXK(粤)2003- 0002。实验符合动物伦理学要求。

方法：

胎鼠胰腺干细胞分离、纯化和培养：孕16 d SD大鼠行剖宫产，取出胎鼠。沿胎鼠腹部正中切开腹壁，显露胰芽并切取之。将胰芽修剪至约1 mm³大小，接种于培养瓶中，加入DMEM培养基(含体积分数10%的胎牛血清)，置于二氧化碳培养箱中培养。细胞传代3次后，细胞涂片行巢蛋白免疫组化染色：取培养第3代之胰腺组织细胞，经胰酶消化制成2×10⁵细胞悬液，细胞涂片机涂片，以40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗涤。体积分数3%H₂O₂-甲醇溶液室温孵育5 min，PBS洗涤，静置避光，以去除内源性过氧化物酶活性。用体积分数1%山羊血清蛋白封闭30 min。加入体积分数1%牛血清蛋白稀释的兔抗鼠抗巢蛋白单克隆抗体，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤。加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育30 min。DAB显色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，中性树胶封固。镜下观察，100倍下随机选取10个视野，计数细胞总数及巢蛋白阳性细胞数。

流式细胞术检测巢蛋白阳性细胞比例：取培养第3代之胰腺组织细胞，经胰酶消化，以PBS制成10¹⁰ L^-¹的细胞悬液，吸取100 µL，加入1 µg小鼠抗大鼠巢蛋白单克隆抗体，冰浴30 min，离心弃上清，PBS洗涤2次，每次5 min，洗除多余未结合抗体；加入FITC标记兔抗小鼠二抗，冰浴 30 min，PBS洗涤2次，每次5 min，并重悬于500 µL 10 g/L多聚甲醛的PBS中。采用流式细胞仪及其配套软件进行取数和分析。

胰岛的分离与纯化：选取35只成年SD大鼠术前禁食 12 h，麻醉后切开腹壁，充分暴露胰腺及胆总管；于胆总管近端结扎胆总管，取1 g/L的胶原酶Ⅴ溶液6 mL经胆总管远端逆行注入，使胰腺完全膨胀，完整切取胰腺，移入预置的Hank’s液中，37 ℃水浴中消化9 min；稍加振荡，见大量细沙样组织悬浮，以4 ℃体积分数10%的新生牛血清10 mL中止消化；洗涤过滤；含体积分数10%胎牛血清的DMEM重悬制成组织悬液。以Ficoll不连续密度梯度离心法进行胰岛的纯化^[14]。收集1.096 g/mL与1.067 g/mL及1.067 g/mL与1.034 g/mL Ficoll界面的细胞团，取100 μL消化物双硫腙染色计数。

实验动物分组：取10周龄雌性SD大鼠35只，随机等分为联合移植组、单独胰岛移植组、单纯胰腺干细胞移植组、模型组及对照组。

糖尿病大鼠模型制备：取联合移植组、单独胰岛移植组、单纯胰腺干细胞移植组和模型组大鼠，以40 mg/kg链脲霉素-柠檬酸盐缓冲液腹腔注射1次。每日尾静脉末梢采血行快速血糖测定，以大鼠出现消瘦、多饮，随机血糖大于16.7 mmol/L并维持3 d以上作为成模标准。对照组大鼠常规饮食饲养。造模后1周进行移植。

胰腺干细胞与胰岛联合移植：联合移植组、单独胰岛移植组和单纯胰腺干细胞移植组分别将2×10⁵个胎鼠胰腺干细胞、800个胰岛、单纯800个胰岛+单纯2×10⁵个胎鼠胰腺干细胞分别移植至糖尿病大鼠模型左肾包膜下。

移植后大鼠大体情况、生存期、空腹血糖及血胰岛素水平的检测：观察移植后大鼠大体情况，包括体质量、进水量等，比较各组大鼠存活情况。移植后每隔3 d尾静脉采血行快速血糖测定。血糖降至7.8 mmol/L以下为正常，血糖小于16.7 mmol/L的时间为胰岛存活时间。每隔3 d眶下静脉丛采血0.5 mL，置于EP管中，待其凝固后，1 000 r/min离心4 min，留取血清至1 mL EP管，编号，置于-20 ℃冰箱保存；按大鼠胰岛素ELISA试剂盒说明检测大鼠胰岛素含量。

将所有试剂及待测样品取出置于室温下，取试剂盒配套抗胰岛素反应板(96孔)一块，选取前12孔为标准曲线孔，2孔空白对照孔，其余为样本孔；酶标液的准备：取存储酶结合液0.6 mL，加入6 mL酶结合缓冲液，充分混匀，即得酶标液。加样：前12孔依次加入含不同胰岛素浓度的标准液(0，0.15，0.4，1，3，5.5 μg/L)，其中0 μg/L的标准液每孔加样25 μL，其余浓度的标准液每孔5μL，每一标准液加2孔。样本加样，每孔5 μL，每一样本3孔。每孔加入酶标液5 μL，室温温育避光振荡2 h；弃去反应液，在每一孔中加入350 μL洗版缓冲液，充分吸干；重复5次；每孔加入200 μL过氧化物酶底物，避光温育30 min；每孔加入50 μL终止反应液，振荡5 s混匀；将反应板置于酶标仪中，450 nm下测吸光度并计算结果。

移植后肾脏组织病理学检查：移植后第14天分别取联合移植组、单独胰岛移植组和单纯胰腺干细胞移植组大鼠各2只，处死后留取肾脏行送病理科行病理切片，苏木精-伊红染色观察残存胰岛情况。切片在二甲苯中脱蜡5-10 min。移入二甲苯和纯乙醇(1∶1)混合液中5 min左右。入体积分数100%，95%，85%，70%乙醇，各级为3 min。最后经蒸馏水转入染液。苏木精染液染色10 min。水洗玻片上多余染液，体积分数0.5%盐酸乙醇(体积分数70%乙醇配制)分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10 s。流水冲洗20 min，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。蒸馏水短洗。0.1%-0.5%伊红染液染色3 min，依次经体积分数70%，85%，95%，100%乙醇脱水，各级脱水时间为3 min，在95%以下浓度的乙醇中伊红易脱色，应适当缩短时间。二甲苯透明约 10 min。封固。

主要观察指标： ①胎鼠胰腺干细胞的培养及鉴定。②胰岛的分离鉴定。③培养胰岛的形态学观察及存活情况观察。④移植后大鼠的血糖及血胰岛素水平检测。⑤病理切片观察。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，数据以x(_)±s表示，采用两样本t 检验及重复测量设计的方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

如何保护胰岛功能是胰岛移植中重要的研究内容之一。最近有很多研究表明干细胞可通过分泌一些细胞因子或者通过细胞-细胞接触、融合等方式促进损伤组织的修复，促进细胞成熟和增殖，维持正常组织细胞的功能。如间充质干细胞可通过转分化、提供细胞因子、增强组织内源性前体细胞增殖、细胞融合或者线粒体的转运而起到修复损伤组织的作用。Lee等^[10]证实间充质干细胞注入糖尿病小鼠体内后可在受损的胰腺富集并促进小鼠胰岛分泌更多胰岛素。Fraidenraich等^[15]将胚胎干细胞注入1 d敲除小鼠(其存在先天多发性心脏缺陷，胚胎多于孕13.5 d前流产)，其可通过分泌胰岛素样生长因子1和wnt5α信号通路逆转1 d敲除小鼠的心肌表型，改善预后；Kerr等^[16]的实验表明胚胎生殖细胞可通过分泌转化生长因子α及脑源性神经营养因子促进受损运动神经元的恢复；又如Lladó等^[17]证明神经祖细胞与临近部位的成熟神经元共培养时，神经祖细胞可通过分泌神经生长因子等促进神经元轴突生长，保护神经元免受外源性毒素的损伤，延长神经元寿命。这些结果为利用干细胞保护成熟组织细胞、促进损伤后组织细胞的修复，促进组织细胞再生等提供了扎实的理论及实践基础。

通过将各种其他来源的细胞与胰岛联合移植延长移植物体内存活时间，可能提高移植疗效。Johanson等^[18]将胰岛与主动脉内皮细胞共培养，使内皮细胞包绕胰岛，包绕有内皮细胞的胰岛移植后可显著减轻血液介导的即时炎症反应。贺德等^[19]将大鼠睾丸Sertoli细胞与胰岛联合移植入大鼠肝脏，利用Sertoli细胞诱导局部免疫豁免而延长胰岛移植物的存活时间。又如Soto-Montenegro等^[20]细胞混和物或肝纤维细胞与胰岛联合移植后，肝细胞可能通过局域免疫调节延长移植胰岛的存活时间。而Yin等^[21]的研究表明肝卫星细胞与胰岛联合移植时，其可通过促进移植胰岛的血管再生从而延长胰岛的寿命。Oh等^[22]将骨髓内皮样祖细胞与胰岛联合移植可促进胰岛的再血管化、保存胰岛形态。Rackham等^[23-25]的实验证明骨髓间充质干细胞可促进移植胰岛的再血管化，保护胰岛功能、保存胰岛形态。Olerud等^[26]发现神经嵴干细胞与胰岛联合移植可促进胰岛β细胞的增殖，改善胰岛功能。这些实验主要利用其他来源的细胞减轻炎症反应、免疫调节、促进再血管化、保持胰岛形态等机制，而达到保护胰岛，延长移植物寿命的作用。

此前作者所在课题组从体外实验的显示胰腺干细胞可在体外维持胰岛的结构，减少胰岛细胞坏死及凋亡，延长胰岛的体外存活时间，保护胰岛的活性^[27-28]，为探讨胰腺干细胞在体内是否亦可保护移植胰岛、提高疗效，在体内实验中作者设计了将胰腺干细胞与胰岛联合移植，并与单纯胰岛移植及单纯胰腺干细胞移植作对比。结果显示通过将胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合移植可以明显延长胰岛体内存活的时间，维持大鼠血糖及血胰岛素正常的时间更长；原因可能包括以下几个方面：①胎鼠来源的胰腺干细胞分泌各种促进损伤修复、营养支持的可溶性因子或细胞-细胞接触减少胰岛细胞死亡或凋亡，保护胰岛功能。②胰腺干细胞通过直接转分化或者促进胰岛内在前体细胞转分化而促进胰岛的再生修复。③胰腺干细胞可能存在免疫调节作用。既往很多研究已经表明无论是胚胎干细胞、间充质干细胞抑或是神经干细胞都可通过诱导淋巴细胞凋亡、抑制淋巴细胞的活化增殖等方式起到免疫调节作用^[29-33]。因此，有理由相信巢蛋白阳性的胰腺干细胞也具有免疫调节作用，而实验中的病理切片中联合移植组的炎症反应较单纯胰岛移植组稍轻亦初步地证实了这一点。

实验显示将胎鼠胰腺干细胞与胰岛共移植后可延长移植胰岛的体内存活时间，维持受体血糖正常的时间更长，这可能与胰腺干细胞分泌的各种促进损伤修复、营养支持的可溶性因子或细胞-细胞接触作用对胰岛起到的保护作用有关。利用胰腺干细胞与胰岛共移植保护移植胰岛，延长胰岛体内存活时间可为胰岛移植的更广泛开展提供有益的借鉴。

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巢蛋白是一种中间丝蛋白，在细胞骨架形成、细胞重排、促进未分化细胞迁移及分裂等方面起着重要作用；最初在发育的神经系统中被发现，被认为是神经干细胞的标志，其在中枢神经发育中的作用已被很好阐明，在胚胎发育过程中，其在神经上皮样干细胞中充分表达，而在成熟中枢神经细胞中几乎不表达。进一步的研究表明巢蛋白不仅在发育的神经系统，在胚胎间充质及血管、骨髓间质细胞中亦广泛存在。而将分离的巢蛋白阳性神经干细胞与肌肉体外共培养，其可迅速分化为肌细胞；这表明巢蛋白阳性细胞的可塑性远超出最初发现时的想象。最近几年越来越多的证据表明，在胰腺实质内亦存在巢蛋白前体细胞。Hunziker 和Street 的研究分别表明在巢蛋白在胰岛及胰腺导管中均有表达；同时Abraham和Huang的研究证实在胚胎发育时，巢蛋白的表达先于β细胞的出现。Street的实验显示新生儿的胰腺切片中胰岛内巢蛋白阳性数较成人胰岛多，这表明巢蛋白这一细胞标志在胰腺发育中可能起到一定的作用；而Yashpal的研究显示在胚胎发育的过程中，巢蛋白及胰岛素常在同一局部表达，提示成熟的β细胞可能来源于一群表达巢蛋白的细胞。更重要的证据来自Zulewski及Lumelsky的实验。Zulewski证实成年大鼠和人胰岛中均存在巢蛋白阳性细胞，而且具有多向分化的潜能，体外培养可分化为胰腺内分泌细胞、外分泌细胞、导管细胞以及肝细胞；而Lumelsky的实验表明巢蛋白表达是胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中中间步骤，在一定的培养条件下，选择性扩增的巢蛋白阳性细胞能够形成三维结构的具有内分泌细胞表型的类胰岛样细胞团。此外，另一研究也表明从人胰岛内扩增所得的巢蛋白阳性细胞表达转运蛋白ATP结合盒转运蛋白G2及多重耐药基因1，这提示这些细胞可能具有与多能干细胞一致的特性。综上所述，可认为巢蛋白是胰腺发育过程中极为重要的分子标记之一。

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