人脐带间充质干细胞的分离鉴定及多向诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (19): 3012-3016.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.19.010

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

人脐带间充质干细胞的分离鉴定及多向诱导分化

李茂，黄文

重庆医科大学附属第一医院血管外科，重庆市 400016

修回日期:2014-04-05 出版日期:2014-05-07 发布日期:2014-05-07
通讯作者: 黄文，博士，主任医师，教授，重庆医科大学附属第一医院血管外科，重庆市 400016
作者简介:李茂，男，1975年生，江西省抚州市人，汉族，2014年重庆医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的研究。
基金资助:
重庆市基金资助项目(2009-2-333)，项目名称：人鼠脊髓蛛网膜下腔移植人脐带间充质干细胞于脊髓损伤部位归巢的研究

Human umbilical cord mesenchymal stem cells: isolation, identification and multi-directional differentiation

Li Mao, Huang Wen

Department of Vascular Surgery, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Revised:2014-04-05 Online:2014-05-07 Published:2014-05-07
Contact: Huang Wen, M.D., Chief physician, Professor, Department of Vascular Surgery, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
About author:Li Mao, Master, Attending physician, Department of Vascular Surgery, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Supported by:
the Supporting Fund of Chongqing City, No. 2009-2-333

摘要/Abstract

摘要：

背景：脐带间充质干细胞取材方便、无创，不受伦理学限制，比一般干细胞原始，免疫原性小，其应用前景广阔，是一种理想的种子细胞。
目的：分离鉴定脐带间充质干细胞，并诱导其向成骨细胞和成脂细胞分化。
方法：组织块贴壁法分离纯化脐带间充质干细胞，取对数生长期的第3代细胞，观察细胞形态、生长方式；流式细胞仪检测干细胞表型CD90、CD105、CD34和CD45的表达情况，并在体外检测能否将其诱导分化为成脂细胞及成骨细胞。
结果与结论：用组织块法成功分离培养出脐带间充质干细胞，流式细胞学鉴定显示细胞强表达CD90和CD105，不表达CD34和CD45；能在体外将其成功诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果显示组织块贴壁法能够从人脐带中分离出间充质干细胞，该细胞可向成脂细胞及成骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 分化, 成脂细胞, 成骨细胞

Abstract:

BACKGROUND: The umbilical cord mesenchymal stem cells can be obtained conveniently, noninvasively, without ethical restrictions, which are more original that stem cells from other sources and have little immunogenicity. Therefore, umbilical cord mesenchymal stem cells are a kind of ideal seed cells with promising application prospects.
OBJECTIVE: To induce the differentiation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord into adipocytes and osteoblasts.
METHODS: The umbilical cord mesenchymal stem cells were isolated by tissue explants method. The morphology, proliferation and immunophenotype of the 3rd passage cells were analyzed, and then cells were induced to adipocytes and osteoblasts in vitro. The expressions of CD90, CD105, CD34 and CD15 were detected by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: The umbilical cord mesenchymal stem cells isolated by tissue explants method could be cultured and proliferated in vitro. Flow cytometry analysis revealed that the cells were strongly positive for CD90 and CD105, but negative for CD34 and CD45. The umbilical cord mesenchymal stem cells could be induced to adipocytes and osteoblasts in vitro. These findings indicate that mesenchymal stem cells can be successfully obtained from human umbilical cord by tissue explants method and have the potential of multi-directional differentiation.

全文链接：

Key words: umbilical cord, mesenchymal stem cells, cell culture techniques, cell differentiation, adipogenesis

中图分类号:

R394.2

李茂，黄文. 人脐带间充质干细胞的分离鉴定及多向诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(19): 3012-3016.

Li Mao, Huang Wen . Human umbilical cord mesenchymal stem cells: isolation, identification and multi-directional differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(19): 3012-3016.

图/表（结果） 3

2.1 人脐带间充质干细胞形态学及生长特点 利用组织块贴壁的方法培养人脐带间充质干细胞，一般在7-10 d可见到组织块周围有细胞游出，游出的细胞呈短棒状或呈短梭形，胞浆色深而浓密(图1A)，此时勿把组织块去除掉，继续培养10-15 d可见细胞围绕组织块呈集落样生长，此时再去除组织块继续培养3-5 d，可见细胞达80%融合，消化后可传第1代，传至第2，3代后细胞开始变为长梭形，细胞大小均一，胞质较第1，2代淡，镜下观察见细胞成漩涡状或单极向放射状生长(图1B)，细胞稳定性较好，传至七八代仍保持良好的细胞形态，8代后细胞出现变形。

第3代人脐带间充质干细胞培养达80%融合，消化后测量生长曲线、倍增时间和生长周期。由生长曲线可见0-2 d为潜伏期，第3天进入对数生长期，第4天进入平台期，第5至6天再进入对数生长期(图2A)，经计算其倍增时间较长，约为47 h，流式细胞仪测定细胞周期显示，80%-90%细胞处于G₀-G₁期，证明细胞增殖活跃(图2B)。

2.2 人脐带间充质干细胞表型的分析 利用流式细胞仪检测第3代人脐带间充质干细胞表面标记物CD90、CD105和CD34、CD45，结果显示脐带间充质干细胞高表达CD90和CD105，阴性表达CD34和CD45(图3)，符合干细胞的表型。

2.3 人脐带间充质干细胞向成脂和成骨细胞诱导分化鉴定 人脐带间充质干细胞分别在成脂细胞和成骨细胞诱导剂下培养，能成功诱导成脂肪细胞和成骨细胞。成脂肪诱导后实验组细胞胞浆内可见大小不等圆形光亮的脂滴形成(图4A)，而对照组镜下观察并未见到有脂滴形成(图4B)；实验组油红染色后可见胞浆内有大量红色的脂滴形成(图4C)，而对照组镜下观察未见有红色脂滴形成(图4D)。成骨诱导后实验组染色前可在镜下见到大量的暗蓝色的颗粒样物质(图4E)，而对照组镜下并未见到暗蓝色颗粒样物质(图4F)，实验组茜红素染色后见诱导后的细胞成阳性反应，胞质内可见到大量暗红色颗粒状样物质(图4G)，证实为钙盐沉积，而对照组在镜下并未见到暗红色颗粒状物质(图4H)；以上结果证明脐带间充质干细胞具有良好的多向分化能力。

参考文献

[1] Doorn J, Moll G, Le Blanc K,et al.Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells: paracrine effects and potential improvements.Tissue Eng Part B Rev. 2012;18(2):101-115.
[2] Vidal MA, Lopez MJ.Adipogenic differentiation of adult equine mesenchymal stromal cells.Methods Mol Biol. 2011;702: 61-75.
[3] Delorme B, Ringe J, Pontikoglou C,et al.Specific lineage-priming of bone marrow mesenchymal stem cells provides the molecular framework for their plasticity.Stem Cells. 2009;27(5):1142-1151.
[4] Scheideler M, Elabd C, Zaragosi LE,et al.Comparative transcriptomics of human multipotent stem cells during adipogenesis and osteoblastogenesis.BMC Genomics. 2008;9:340.
[5] Mueller MB, Blunk T, Appel B,et al.Insulin is essential for in vitro chondrogenesis of mesenchymal progenitor cells and influences chondrogenesis in a dose-dependent manner.Int Orthop. 2013;37(1):153-158.
[6] Rogers I, Casper RF.Umbilical cord blood stem cells.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2004;18(6):893-908.
[7] Hanson SE, Gutowski KA, Hematti P.Clinical applications of mesenchymal stem cells in soft tissue augmentation.Aesthet Surg J. 2010;30(6):838-842.
[8] Chen Y, Shao JZ, Xiang LX,et al.Mesenchymal stem cells: a promising candidate in regenerative medicine.Int J Biochem Cell Biol. 2008;40(5):815-820.
[9] Mi Z, Bhattacharya SD, Kim VM,et al.Osteopontin promotes CCL5-mesenchymal stromal cell-mediated breast cancer metastasis.Carcinogenesis. 2011;32(4):477-487.
[10] Mueller MB, Fischer M, Zellner J, et al.Hypertrophy in mesenchymal stem cell chondrogenesis: effect of TGF-beta isoforms and chondrogenic conditioning.Cells Tissues Organs. 2010;192(3):158-166.
[11] Levi B, Wan DC, Glotzbach JP,et al.CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor β1 (TGF-β1) signaling.J Biol Chem. 2011;286(45):39497-39509.
[12] Nurden AT.Platelets, inflammation and tissue regeneration. Thromb Haemost. 2011;105 Suppl 1:S13-33.
[13] Mitchell KE, Weiss ML, Mitchell BM,et al.Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.Stem Cells. 2003;21(1): 50-60.
[14] Troyer DL, Weiss ML.Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.Stem Cells. 2008;26(3):591-599.
[15] Kestendjieva S, Kyurkchiev D, Tsvetkova G,et al.Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord.Cell Biol Int. 2008;32(7):724-732.
[16] Secco M, Zucconi E, Vieira NM,et al.Multipotent stem cells from umbilical cord: cord is richer than blood!Stem Cells. 2008 Jan;26(1):146-150.
[17] Reger RL, Tucker AH, Wolfe MR.Differentiation and characterization of human MSCs.Methods Mol Biol. 2008; 449:93-107.
[18] Cassatella MA, Mosna F, Micheletti A,et al.Toll-like receptor-3-activated human mesenchymal stromal cells significantly prolong the survival and function of neutrophils. Stem Cells. 2011;29(6):1001-1011.
[19] Weiss ML, Medicetty S, Bledsoe AR,et al.Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 2006;24(3):781-792.
[20] Cirri P, Chiarugi P.Cancer-associated-fibroblasts and tumour cells: a diabolic liaison driving cancer progression.Cancer Metastasis Rev. 2012;31(1-2):195-208.
[21] Weiss S, Hennig T, Bock R,et al.Impact of growth factors and PTHrP on early and late chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.J Cell Physiol. 2010;223(1):84-93.
[22] Weiss ML, Medicetty S, Bledsoe AR,et al.Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 2006;24(3):781-792.
[23] Conconi MT, Burra P, Di Liddo R,et al.CD105(+) cells from Wharton's jelly show in vitro and in vivo myogenic differentiative potential.Int J Mol Med. 2006;18(6):1089-1096.
[24] Jung KH, Song SU, Yi T,et al.Human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells inhibit inflammation and reduce acute pancreatitis in rats.Gastroenterology. 2011; 140(3): 998-1008.

引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2012年3月至2013年1月在重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成。

材料：健康足月产婴儿脐带组织来源于重庆医科大学附属第一医院产科手术室，经产妇知情同意。产妇产前检查排除感染梅毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、支原体等，标本采集后保存于4 ℃冰箱内，并在6 h内完成实验。

实验方法：

人脐带间充质干细胞的分离与培养：取出脐带放入PBS中，反复冲洗，直至无血液及血块，先剔除外膜、脐动脉及静脉，剩余组织剪成为1.0-2.0 mm小块，将剪碎的组织块以适当的密度贴于培养瓶底，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，放置于饱和湿度、 37 ℃和体积分数为5%CO₂的培养箱内培养，第2天半量换液，以后每隔3 d全量换液1次；5 d后每天在倒置显微镜下观察组织块周围是否有细胞游出，若在显微镜下观察到呈集落状生长的梭形或短棒状的细胞时，可去除组织块换新的培养液继续培养；20 d左右细胞可达80%融合，用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液消化，以2×10⁴/cm²的密度传代培养。

细胞周期、倍增时间及生长曲线的测定：取对数生长期的第3代细胞，经含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液消化，以2×10⁴/cm²的密度接种于96孔板，每板连续接种5孔，每孔约100 μL，共计8板，每天取1板用MTT法检测活细胞数，连续培养8 d，期间所有细胞按正常培养方法换液；以培养时间为横坐标，以570 nm波长测得的吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

将5 mL体积分数为70%的乙醇加入离心好的细胞内悬匀，放置于4 ℃下过夜，次日加入RNase A液，在37 ℃下孵育20 min，再加入3 mg/L碘化丙啶，在4 ℃下放置 30 min，送流式细胞仪测定细胞周期。

取对数生长期的第3代细胞，按2×10⁴/cm²的密度分别接种于3个培养瓶，培养7 d后经含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液消化并计数，计算细胞的倍增时间。

细胞表型的测定：取对数生长期的第3代细胞，用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化液消化，离心后用PBS轻洗3次，再用PBS吹打悬匀，分装4个离心管，分别加入相应抗体并送流式细胞仪测定CD90、CD105、CD34和CD45的表达情况。

体外定向诱导分化：

向脂肪细胞诱导分化：取第3代脐带间充质干细胞，按2×10⁴/cm²密度接种于6孔板，3个对照孔，3个实验孔，实验组用含体积分数10%胎牛血清的F12培养液培养至100%融合，换为成脂诱导A液，3 d后换成成脂诱导B液，24 h后换成成脂诱导A液，如此3到5个循环，连续观察约在第3个循环后可看到细胞内有大小不等的光亮圆形脂滴形成，第4个循环后换成成脂诱导B液，每3 d换液1次，培养1周，最后吸干成脂诱导B液，PBS洗1次，40 g/L多聚甲醛固定约30 min，再次PBS洗涤后加入1 mL油红O染色 30 min，PBS洗2次或3次，镜下观察并摄片。

体外向成骨细胞诱导分化：取第3代脐带间充质干细胞，按2×10⁴/cm²的密度接种于6孔板，3个对照孔，3个实验孔，实验组用含体积分数为10%胎牛血清的F12培养液培养至80%融合，加入成骨诱导分化液，每3 d换液1次，连续培养三四周，连续镜下观察见细胞内有黑色不透光区域时去除诱导剂，PBS洗2次或3次，加入40 g/L多聚甲醛固定约30 min，PBS洗2次后加入1 mL茜红素染液，常温固定30 min后吸去染液，PBS洗3次后镜下观察并摄片。
主要观察指标：①人脐带间充质干细胞形态学及生长特点。②人脐带间充质干细胞表型的分析。③人脐带间充质干细胞向成脂和成骨细胞诱导分化鉴定。

全文链接：

讨论

目前，人脐带间充质干细胞主要分离自脐带中的沃顿氏胶(Wharton’s jelly)^[14-15]，有两种方法可获取该细胞，一种是酶消化法，此法操作复杂，实验费用较高，可控性差，细胞易受到酶的消化作用而损害，细胞活力受到影响，现已较少用；另一种是本次实验所采用的组织块贴壁法，此法简单，易于掌握，费用低，能很好的保持细胞活力；取材方便、无创，不受伦理道德限制。培养液简单，为体积分数为10%胎牛血清，减少了培养过程的干扰因素，培养过程细胞分化几率小，保持了细胞的纯一性；7-10 d可见到细胞从组织块中游出，超过15 d尚未见到细胞游出，则往往不再会有细胞游出；并且作者观察到，组织块足够小，贴壁越牢固，细胞游出的时间越短，作者观察到最短游出细胞的时间为5 d。

组织块贴壁法分离细胞成败的关键在于严格的无菌操作，取到含有细胞的组织块，并且这些组织在操作时剪得足够的小，小于1 mm³最佳，贴壁时要牢靠，作者的体会是把组织块放在少量的培养液中修剪，这样既能避免因操作时间过长造成细胞营养缺乏，又能增加组织块贴壁时的黏性；半量换液时，培养液的量以刚要没过组织块为宜，否则容易造成组织块飘起，从而不宜细胞游出；作者在观察细胞游出时，凡是细胞游出多的组织块，其与瓶壁贴合紧密，镜下显示为黑色；培养液中勿加抗生素，因为加抗生素易导致细胞分化，从而难以保持细胞的纯一性，作者观察到加抗生素培养的细胞，在传3代后就开始出现很多异型细胞。

目前对间充质干细胞的检测尚缺乏统一的标准，表面抗原较多，但都缺乏特异性，这些抗原在造血干细胞上不表达，但是在一些内皮细胞、基质细胞及表皮细胞中呈现阳性表达^[16]，其中阳性表达有CD90、CD105、CD44、CD59及CD71等，不表达有CD34、CD45、CD117等^[17-18]。由于表型缺乏特异性，故本实验只选择其中的CD90、CD105、CD34和CD45作抗原测定，流式细胞技术测定显示高表达CD90和CD105，阴性表达CD34和CD45，这符合干细胞的表型特点，与相关文献报道相符^[19]，证实实验所分离之细胞为人脐带间充质干细胞。

干细胞的重要特性为具备多向分化的潜能，人脐带间充质干细胞能向脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞等分化，是具备多向分化潜能的有力证据^[20]，作者此次在体外将人脐带间充质干细胞成功的诱导为成脂细胞及成骨细胞，前者诱导后可见胞浆内有大量光亮的脂滴，油红染色后可见胞浆内有红色脂滴，后者诱导后见胞浆内有大量暗蓝色颗粒样物质，经茜红素染色后胞浆内见大量暗红色的颗粒样物质；以上诱导的成功说明作者所分离的细胞确实具有多向分化的潜能，具备干细胞的的特征，符合了国际委员会制定的最低标准^[21]，达到细胞治疗的标准；有些学者证实人脐带间充质干细胞比较原始，表达一些原始干细胞的表型并可抑制淋巴细胞的增殖^[22-24]，说明其比一般成体干细胞更加原始，免疫原性更小，这提高了其移植治疗的范围。

细胞治疗作为一种全新的治疗方式已经越来越受到关注，临床上在肿瘤疾病、血管疾病和骨疾病等治疗上取得一定疗效，但其作用机制尚不清楚，对疗效的评估缺乏统一标准，用作治疗的种子细胞种类很多，最常用的为自体骨髓间充质干细胞，但是其取材有创，随着年龄的增长，细胞数量减少等限制其应用范围。脐带间充质干细胞取材方便、无创，不受伦理学限制，比一般干细胞原始，免疫原性小，其应用前景广阔，是一种理想的种子细胞。本实验方法可重复性和可操控性强，为其以后的研究和应用提供了理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

人脐带间充质干细胞的分离鉴定及多向诱导分化

Human umbilical cord mesenchymal stem cells: isolation, identification and multi-directional differentiation

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.