制备心肌梗死大鼠模型方法的改进

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.18.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：心肌梗死动物模型对于研究人类冠心病的发病机制、病理生理改变以及对治疗方法的评估具有重大意义，提高存活率及制模成功率是许多研究者追求的目标。
目的：对大鼠心肌梗死模型制备方法进行改进。
方法：选取Wistar大鼠100只，分为模型组(n=80)和假手术组(n=20)。3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，气管切开，小动物呼吸机辅助呼吸，左侧胸部开胸，第4肋间入胸，结扎左冠状动脉前降支。假手术组大鼠只穿线不结扎。逐层关胸，撤除呼吸机，拔除气管插管。为防止窒息，不缝合气管及颈部切口。
结果与结论：通过观察心脏形态及苏木精-伊红染色鉴定证实心肌梗死模型制作成功率为98.6%。模型组术后3周成活率为88.75%，共死亡9只，其中术中及术后24 h内死亡7只，后期死亡2例，假手术组存活率为100%。通过对大鼠心肌梗死模型制作方法的改进，如麻醉方法、气管切开时采用纵行切口、术后不缝合气管切口，开关胸方法的改进等，提高了手术成功率及大鼠存活率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 心肌梗死, 大鼠, 存活率, 成功率, 改进

Abstract:

BACKGROUND: An animal model of myocardial infarction is of great significance for the study of the pathogenesis, pathophysiology and evaluation of treatment methods of human coronary artery disease. Many researchers aim to improve survival rate and the success rate of model induction.
OBJECTIVE: To improve the method of making a rat model of myocardial infarction.
METHODS: One hundred Wistar rats were divided into model group (n=80) and sham-operated group (n=20). The rats were intraperitoneally anesthetized with 3% sodium pentobarbital. Tracheostomy was operated. An automatic breathing apparatus was utilized for assisted breathing. A left anterior thoracotomy was performed at the fourth intercostal space. The left anterior descending coronary artery was ligated. Sham-operated rats underwent similar surgery but without coronary artery ligation. The thoracic cavity was closed layer by layer. The breathing apparatus was removed and tracheal intubation was also removed. To prevent suffocation, the trachea and the neck incision were not closed.
RESULTS AND CONCLUSION: Heart morphology and hematoxylin-eosin staining demonstrated that the success rate of establishing myocardial infarction model was 98.6%. The survival rate of model group at 3 weeks after surgery was 88.75%. Totally nine rats died, including seven dead rats during operation and within 24 hours after operation, and two dead rats in later stage. The survival rate of the sham-operated group was 100%. We modified the method of establishing a rat model of myocardial infarction and improved the operation success rate and survival rate of rats, such as anesthesia method, longitudinal incision during tracheotomy, without closing the trachea after operation, and the method of opening and closing the chest.

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Key words: myocardial infarction, models, animal, rats, Wistar, survival rate

中图分类号:

R318

赵传艳1，王昕2 . 制备心肌梗死大鼠模型方法的改进[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(18): 2886-2891.

Zhao Chuan-yan, Wang Xin. Modified method of establishing a rat model of myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(18): 2886-2891.

图/表（结果） 3

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引言

随着生活水平的日益提高和人口老龄化的发展，冠状动脉性疾病成为威胁人类健康的主要疾病，其中心肌梗死更是严重威胁人类生命。2010年全球冠心病死亡人数占总死亡率的15%^[1]。目前心肌梗死的临床治疗方法主要有药物治疗、手术治疗、基因治疗、细胞治疗等，而这些方法在临床应用前都要经过动物实验阶段。

心肌梗死动物模型对于研究人类心肌梗死的发病机制、病理生理改变、心电生理变化以及对治疗方法的评估都具有重大意义^[2]。造模成功率高、死亡率低、可重复性好、简单易行的制作急性心肌梗死动物模型的方法是许多研究者追求的目标。动物选择、麻醉方式、插管模式、制模术式等均可影响动物死亡率及造模成功率。

目前用于建立心肌梗死模型的动物，比较常见的是大鼠、兔和实验用小型猪^[3-6]。基于动物模型选择经济实用、可操作性强、模型稳定、尽量与人结构相近的原则，相对于其他动物，人们倾向于选择大鼠。大鼠心肌梗死模型运用于实验心脏病学的研究已有几十年的历史^[7]，它与临床心肌梗死和充血性心力衰竭的病理生理过程非常相似，同时其冠状动脉侧支循环缺乏，心肌坏死出现早，重复性、稳定性好，费用低廉，因而在临床科研中具有重要的价值，应用十分广泛。心肌梗死模型选择的大鼠多为SD和Wistar两个常用的品种，雌雄不限，实验过程中尚未发现品种和性别对造模成功率和大鼠死亡率的影响。大鼠的体质量以200-250 g为佳，体质量过小，动物心脏亦小，手术操作难度大，增加了手术创伤且对手术创伤的耐受性差；体质量过大，虽有利于手术操作，但由于鼠龄过大，术后死亡率明显增高，同时体质量过大的大鼠凝血功能差，不利于术中止血。

常用的麻醉方式有静脉注射、肌肉注射、腹腔注射以及吸入麻醉。从效果看，静脉和吸入复合麻醉效果最好，但所需仪器非常多，能满足这些条件的实验室少，较难开展^[8]。而肌肉和腹腔注射麻醉操作简单，单人就可完成，麻醉效果较好，持续时间较长。常用的麻醉药物有戊巴比妥钠、水合氯醛、乌拉坦、氯胺酮、利多卡因等，还有几种药物联合应用的方案。

气道的建立方法主要有两种：经口气管插管和气管切开插管，二者各有优缺点。经口气管插管创伤小，术后对鼠的呼吸功能影响小，感染发生率较低，但要求较高的操作技巧，新手应用此法会增加大鼠死亡率。而气管切开插管相对比较直观，成功率高，但术中由于气管切开时容易误伤血管出血，术后易导致气道分泌物过多，清理不好也会引起窒息死亡^[9]。

制模术式有冠状动脉结扎术，冠状动脉阻塞术，冠状动脉夹闭术、药物注射以及微量直电刺激法、冷凝、电灼烧、超声刀凝固法等物理方法^[10-15]，其中冠状动脉左前降支结扎法是最常用的一种。在实践中，由于麻醉和人工呼吸的使用不当、肺损伤以及左冠状动脉定位错误等各种原因，造成动物死亡或制模失败。因此提高存活率及制模成功率是解决心肌梗死动物模型的一个核心问题。Sia等^[16]及高琴等^[17]报道心肌梗死大鼠术后24 h成活率分别为49%和52.5%。本研究在制作大鼠心肌梗死模型时，采用冠状动脉前降支结扎法，从麻醉药选择、气道建立、开胸方法、结扎位置等细节方面加以改进，完善术后护理及饲养，心肌梗死模型大鼠存活率较上述报道明显提高，较好地解决了大鼠心梗模型的制备问题，现报道如下。

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材料方法

设计：单组设计，设假手术组对照。

时间及地点：实验于2011年9至12月在山东省立医院动物实验中心及山东省立医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性Wistar大鼠100只，体质量230-270 g，清洁级，由山东大学医学院实验动物中心提供。随机把所有大鼠按1-100编号，将编号为5的倍数的大鼠分入假手术组(n=20)，其余分入模型组(n=80)。动物实验遵守2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

制备大鼠心肌梗死模型所需主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
3%戊巴比妥钠溶液	山东省立医院动物实验中心提供
青霉素钠	鲁抗制药有限公司
苏木精	上海润成生物科技有限公司
自制吸痰管(直径2 mm，长约5 cm的塑料管)	由静脉留置针自行改造
小动物呼吸机(ALC-V8s型)	上海奥尔科特生物科技有限公司
乳突牵开器(耳鼻喉科器械)	上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂
心电图机(6511型)	上海光电医用电子仪器有限公司
显微眼科器械(普通剪刀，直头小镊子，弯头小镊子，持针器，医用缝合针，手术线)	山东省医疗器械研究所中试厂
病理切片机(RM2245型)、烘片机(HI1220型)	德国LeiCa公司
BX-51型光学显微镜	日本Olympus公司

实验方法：

麻醉及术前准备：大鼠称质量后，用3%戊巴比妥钠 (40 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉不宜过深，否则直接影响存活率。待动物呼吸平稳有力后仰卧固定于手术台上，四肢接心电图机导联并术前常规行心电图检测。颈部及左胸部去毛及消毒。

气管插管：用手术刀在颈部正中胸骨上缘1 cm处做一纵行切口，逐层分离后暴露气管，将一根0号线绕过气管后方备用。在第4、5软骨环处纵行开一小口，吸痰管清除出血及分泌物，插入呼吸机自带之小动物气管插管，接上呼吸机，采用容量控制模式，潮气量3 mL/100 g，呼吸频率60-70次/min，吸呼比1∶1。将备用之0号线打结固定气管插管。

开胸及暴露心脏：将大鼠调整为右侧卧位，在左侧胸部从右下至左上做一斜行切口，在切口下方，大鼠的身体下垫一个小纱布卷，逐层分离胸肌后，由第4肋间入胸，钝性分离肋间肌，用乳突牵开器牵开肋骨，撕开靠中部心包，由于下方垫的纱布卷，当心包撕开后，心尖即向上方翘起。

结扎血管：用棉签推开左心耳，在肺动脉圆锥和左心耳之间距主动脉根部约3 mm处，以左冠状静脉为标志，用6-0丝线连同一束心肌结扎左冠状动脉前降支，进针深度1.0-2.0 mm，在肺动脉圆锥旁出针。观察心电图变化，以肢体导联2个以上导联J点抬高，或者肉眼观察结扎处下方大面积心肌表面变得苍白，周围瘀血征出现，室壁搏动减弱为结扎成功标准。此时要观察心脏运动一小段时间，约 5 min，如果出现心律失常，可以在心脏表面滴少量的利多卡因或直接心脏按摩，多数心律失常能够恢复。假手术组大鼠只穿线不结扎，其余步骤同模型组。

关胸逐层缝合：用小纱布块将胸腔内的积血清除。用0号线在切口肌肉的一端缝合打结，然后连续缝合肌肉，缝合完毕时，将呼吸机的回气管道夹闭，使肺复张，然后收紧缝线、打结。缝合皮肤。用吸痰管吸掉口咽及气道的分泌物，然后拔除气管插管，胸外按压数下，帮助大鼠恢复自主呼吸。为防止气道狭窄及分泌物导致窒息，不缝合气管及颈部切口。手术过程见图1。

术中及术后护理：术中至术后12 h采用40 W灯泡照射保暖，室温控制在22-24 ℃，术后4 h内注意观察气管切口处分泌物，及时用吸痰管清除。术后前3 d肌内注射青霉素钠盐(40×10⁴U/d)预防感染。

组织病理学观察：术后3周静脉注射氯化钾处死大鼠，开胸取出大鼠心脏，剪去多余结缔组织及大血管，用生理盐水洗净血块，浸泡于体积分数为10%甲醛溶液中固定24 h，冠状动脉结扎线平面以下做一与房室沟平行的切面，取结扎以下部分常规制作石蜡切片(5 μm)用于苏木精-伊红染色。

主要观察指标：大体观察心脏形态、表面色泽、心室腔大小、室壁厚度。苏木精-伊红染色观察正常心肌及梗死区心肌组织病理变化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

心肌梗死的产生方式有很多种，如冠状动脉结扎术，冠状动脉阻塞术，冠状动脉夹闭术以及冷凝、电灼烧等物理方法。冠脉阻塞术需要在血管造影术的基础上来完成，不适合推广。冠脉夹闭术需要在大动物如犬身上进行^[18]。而物理方法造成的心肌梗死距离正常的生理状态差距过大，其参考意义有限。冠状动脉结扎法造成心肌损伤的病理生理、生化改变与临床心肌梗死更相似，可以人为反复造成心肌缺血或梗死后再灌注，模型的稳定性以及可重复性好^[19]。因此，综合考虑，冠脉结扎法心肌梗死模型是目前各种心肌梗死模型中最有价值、最易于推广的心肌梗死模型，但在造模过程中面临的主要问题是死亡率较高。大鼠死亡多发生于术中及术后24 h，其主要原因是心力衰竭、肺损伤、心律失常等^[2]。综合前人的研究，本实验在造模方法上主要从以下几方面做了改进。

麻醉方法：实验动物接受外科手术，由于无法进行语言安慰，为避免引起临床恐慌，避免产生一系列不利于实验的反应，均需施行麻醉。当然麻醉本身也会引起动物体的变化，但它们是能够预见和加以控制的，所以，在设计实验方法时应选用最适宜的麻醉方案。为保证实验的顺利进行要重视麻醉准备，在麻醉起效前最好不要打扰动物，使其保持安静5-7 min^[20]。戊巴比妥钠、水合氯醛、氯胺酮、乌拉坦是大鼠试验中常选用的麻醉药品。其中戊巴比妥钠与水合氯醛为短效麻醉药，乌拉坦为长效麻醉药。戊巴比妥钠与氯胺酮对大鼠呼吸有一定的抑制作用，需注意麻醉后保持大鼠气道通畅。戊巴比妥类药物在全麻剂量下，对血压有抑制作用，此类药主要在肝中代谢，不宜做肝病模型麻醉药，但对血糖无直接影响，适宜做血糖实验。水合氯醛可以导致大鼠室性心律失常，提高围手术期死亡率而联合使用利多卡因可以对抗大鼠室性心律失常，从而降低围手术期死亡率^[21]。乌拉坦作用温和持久，外科麻醉深度可持续4-6 h，对呼吸与循环无明显的抑制；但有学者报道静脉注入乌拉坦后红细胞破坏，HCT减小，全血黏度下降，所以在涉及血液流变学的实验选用乌拉坦要慎重考虑。而且此药毒性大，禁止长期反复接触，使用的动物要作为有害物处理^[22]。李贻奎等^[23]研究发现用戊巴比妥钠麻醉制作的大鼠心肌梗死模型麻醉起效时间、心肌梗死面积与水合氯醛组比较，差异无显著性意义，但戊巴比妥钠组大鼠苏醒时间明显缩短。从注射方式上讲，腹腔注射方法简单，操作方便，一人即可实施；且麻醉起效迅速。皮下注射方式药物吸收缓慢、麻醉效果温和持久，可以与腹腔注射麻醉方式配合使用，作为中长效的大鼠麻醉方法。本实验选择单纯用戊巴比妥钠进行麻醉。戊巴比妥钠麻醉通过腹腔给药，一次给药能持续较长的时间，麻醉过程比较平稳，对心肺功能影响较小，对呼吸抑制作用较小，诱导速度比较快，但戊巴比妥钠麻醉能使实验动物体温下降，所以术中必须要有保温措施，以保证实验结果的准确。作者在实验中发现，如一次麻醉不成功切勿追加剂量，即使追加很少剂量也容易使术后苏醒时间延长，增加死亡率，本研究中因麻醉意外死亡的1只即因追加剂量而致。因此作者主张，麻醉要一次到位，每一只动物均严格称质量，精确计算麻醉药量。对衰弱和过胖动物，将单位体质量所需剂量适当调小。

建立气道方法：气道的建立方法主要应用气管插管法，包括经口气管插管、气管切开插管。这两种方法以经口气管插管最符合生理状态，术后对鼠的呼吸功能影响最小，但经口气管插管要求技巧性比较高，操作的精细度高，拉舌、插管需要较多的次数训练，要求较高的手法，多次插管失败可造成喉头黏膜水肿，导致窒息。经口插管的确减少大鼠创伤，但有研究表明插管方式是影响大鼠心率的主要因素，采用经口插管时后大鼠心率明显下降，且在手术中常有心脏骤停死亡现象的发生，与初学者反复刺激大鼠咽喉部，导致兴奋迷走神经引起窦性停搏有关。气管切开插管比较直观、准确。以往的研究者手术结束时习惯缝合气管切口^[24]，容易造成气管狭窄或气管瘘，因气道内血和分泌物过多导致窒息，术后肺感染的可能性也大，这些都对术后鼠的存活率造成很大的影响。还有研究者采用非人工通气条件，此方法对呼吸道无损伤，但必须有助手密切配合，单人无法操作，且整个手术过程必须快速准确，新手操作成功率不高^[25]。阮红等^[26]采用套口套鼻法，发现此法操作简单，通气稳定，但必须专人维护。在本实验中，采用气管切开插管，尝试术后不缝合气管切口及颈部切口，术后在气管分泌物过多时仍可用吸痰管吸除，从而基本杜绝了因窒息死亡。气管切开时采用纵行切口，有利于其自行生长闭合，防止了气管塌陷。经观察，大多数大鼠的气管切口可在3 d内闭合，少数延迟闭合的亦不影响其呼吸及生存率。且采用此方法不增加甚至减少了肺部感染，本实验中仅有1只因肺部感染而死亡。需注意的是，在切开气道后，应及时清理分泌物，待气道通畅后再接呼吸机，术中及术后对气道的护理亦非常重要，及时吸除分泌物才能避免窒息及肺部感染的发生。

开胸术式：比较常见的开胸方法通常采用剪断肋骨，通过压迫胸腔和腹腔将心脏从胸腔内挤出，结扎后再将心脏放回，同时抽出胸腔内的气体^[27]。这种方法容易导致心脏和大血管受到牵拉而发生变形，增加急性心律失常的发生率，对胸腔内空气的排空以及剪断的肋骨容易造成进一步的肺损伤，增加术后鼠的死亡率。本实验参照以往报道稍作改进^[28]，通过侧开胸，从肋间隙钝性分离进入胸腔，用乳突牵开器撑开肋骨，局限性撕开心包，通过在大鼠身体下方垫的纱布使心脏暴露充分，而且在这种条件下，心尖自然上翘，心底的血管没有扭曲，减少了心律失常，同时由于心包被撕开，心尖上翘使肺自然被推到一边，减少手术操作可能对肺造成的损伤。于左胸部从右下至左上做皮肤切口，肌层开口逆肋间方向，各层肌肉开口处相应错开，这种术式使每个解剖层次的开口不在同一位置，关胸时各肌层自然黏合封闭胸腔，不必缝合肋间一层，避免了缝合时肺损伤的可能。采用连续缝合，在将缝线收紧之前，将呼吸机的回气管道夹闭，使肺复张，这种张肺方法可调控性强，又能减少对肺的损伤，有利于自主呼吸的恢复。

减少心律失常：李保等^[29]报道术中死亡发生原因最主要为心律失常，占术中总死亡的75%。为减少心律失常，采取如下措施。选择适当的结扎部位，在肺动脉圆锥和左心耳之间距主动脉根部约3 mm处结扎，太高则室颤的发生率增加。冠脉结扎10 min内是恶性心律失常发生的高危期，尤其是5 min内，一旦发生室颤成活的可能性很小。因此，结扎冠脉后观察5 min，如出现心律失常在心脏表面滴少量的利多卡因或直接心脏按摩纠正心律失常。也可术前腹腔内注射利多卡因8.3 mg/kg预防心律失常^[30]。冠脉结扎前及结扎后2 h肌肉注射利多卡因，也可明显减少心律失常，降低动物死亡率，并且利多卡因对心功能及梗死面积没有显著影响。

冠脉结扎部位及方法：冠状动脉结扎法制作的心肌梗死面积与结扎位置有严格的相关性^[31]。从心脏表面观察，左冠状动脉动脉近端通常潜伏行走于心肌内不可见，而与之伴行的左冠状静脉主干位置变异度小且表浅，易于肉眼观察，是非常有用的定位指标^[32]。冠脉结扎位置的高低对模型的制备至关重要。低位结扎时，即使固定结扎位置，由于冠状静脉变异也会对模型的成功率及稳定性产生较大影响，可能在后续研究中易对研究者造成误导；高位结扎时，容易扎到冠脉主干，模型成功率高且相对稳定，在较高位置结扎冠脉，建模效果较好，然而，结扎位置提高后，动物死亡率也明显提高。在肺动脉圆锥和左心耳之间距主动脉根部约3 mm处进针，进针深度1.0-2.0 mm，宽2.0- 3.0 mm跨越前室间沟出针打结，基本都能缝住左冠状动脉前降支，在此位置结扎如太靠上，梗死面积会较大，同时死亡率随之上升；若在此部位以下，则梗死面积较小，可能达不到试验要求的面积及心功能变化。结扎冠脉时动作要快，在30 s内完成，时间太长会改变心脏的前后负荷影响心脏射血，增加心律失常发生机会^[33]。

避免肺损伤：肺组织损伤是大鼠死亡的一个主要原因^[34-35]。肺损伤多发生在开胸和关胸时。开胸时将呼吸机潮气量暂时调小为1.5 mL/100 g，使充气的肺组织体积减小。开胸时最好用镊子破开胸膜，避免应用锐器。用纱布将肺组织与心脏隔开，乳突牵开器末端钩齿亦用纱布缠起，避免硬物接触肺。关胸时不缝合肋间一层。通过以上措施，较好地避免了肺损伤。

术中及术后保温：蒋正英等^[36]报道术中及术后进行保温可减少术后并发症，提高建立动物模型存活率。作者采用40 W灯泡照射保暖，使室温控制在22-24 ℃，大鼠术中皮温33-34 ℃，减少了大鼠并发症及死亡率。

综上所述，通过对麻醉方法、建立气道、气管插管、开胸术式、关胸方式等一些细节方面的改进，加之术后加强护理，改善饲养环境，进行保温、应用抗生素预防感染等措施，大鼠术后24 h存活率91.25%，3周存活率88.75%，制模成功率98.6%。本方法操作简单，创伤轻，成功率高，结果可靠，值得推广。