复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥的细胞相容性及毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (16): 2519-2525.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.010

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复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥的细胞相容性及毒性

王金宁，皮斌，王鹏，朱雪松，杨惠林

苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006

修回日期:2014-02-01 出版日期:2014-04-16 发布日期:2014-04-16
通讯作者: 朱雪松，副研究员，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006 杨惠林，教授，博士生导师，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006
作者简介:王金宁，男，1987年生，辽宁省锦州市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事生物材料，脊柱外科研究并列第一作者：皮斌，男，1985年生，湖南省常德市人，汉族，2012年中南大学毕业，博士，医师，主要从事脊柱外科生物材料研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81071451、81171689、81301559)；江苏省自然科学基金资助项目(BK2011264、SBK201341421)；江苏省教育厅研究生创新计划(CXZZ11_0123)

Cytocompatibility and cytotoxicity of a novel composite bone cement material composed of chitosan microsphere, alpha-tricalcium phosphate and silk fibroin

Wang Jin-ning, Pi Bin, Wang Peng, Zhu Xue-song, Yang Hui-lin

Department of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Revised:2014-02-01 Online:2014-04-16 Published:2014-04-16
Contact: Zhu Xue-song, Associate investigator, Department of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Yang Hui-lin, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Wang Jin-ning, Studying for master’s degree, Department of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Pi Bin, M.D., Physician, Department of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Wang Jin-ning and Pi Bin contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81071451, 81171689, 81301559; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK2011264, SBK201341421; the Graduate Innovative Plan of Jiangsu Provincial Educational Bureau, No. CXZZ11_0123

摘要/Abstract

摘要：

背景：磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性和骨传导性，已被应用于临床，但其不良的力学性能和缺乏骨诱导性限制了其进一步发展和应用。

目的：制备壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥，验证其细胞相容性及细胞毒性。

方法：分别以含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基、苯酚、100%及50%复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥材料的浸提液培养MC3T3-E1细胞，采用MTT法评估细胞生长增殖情况，采用乳酸脱氢酶活性检测法判断复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥材料的毒性。将MC3T3-E1细胞系与复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥材料共培养，扫描电镜观察细胞在材料表面的附着及生长。

结果与结论：复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥材料浸提液对MC3T3-E1细胞的生长增殖无明显影响，无明显细胞毒性。MC3T3-E1细胞在复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥材料表面生长良好，伸展充分，在材料表面伸出伪足，与材料贴附紧密，表明壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥细胞相容性良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 丝素基磷酸钙骨水泥, 壳聚糖微球, 浸提液, MC3T3-E1细胞, 细胞增殖, MTT法, 乳酸脱氢酶活性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: With excellent biocompatibility and osteoconduction, calcium phosphate bone cement has been used in clinic, but the poor mechanical properties and lack of osteoinduction restrict its further use.

OBJECTIVE: To investigate the cytocompatibility and cytotoxicity of a novel drug-carrying composite of bone cement composed of chitosan microsphere, α-tricalcium phosphate and silk fibroin.

METHODS: MC3T3-E1 cells were cultured in vitro in minimum essential medium alpha medium (α-MEM), which was supplemented with 10% fetal bovine serum, and 1% streptomycin sulfate, extract of the cement material at concentrations of 100% and 50%, and 6.4 mL/L phenol. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay was used to measure cell proliferation and the cytotoxicity was assessed by the activity of lactate dehydrogenase. The MC3T3-E1 cells cultured in vitro were collected and seeded on the composite cement material, and cell morphology was observed by scanning electron microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: The extract of composite cement material had no influences on the MC3T3-E1 cell proliferation, showing no obvious cytotoxicity. The scanning electron microscope image showed MC3T3-E1 cells adhered and proliferated well on the composite cement material composed of chitosan microsphere, α-tricalcium phosphate and silk fibroin, and pseudopodia out of the cells were closely attached to the material surface. In conclusion, the cement composite was proved to have satisfactory cytocompatibility and no obvious cytotoxicity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, calcium phosphates, chitosan, silk

中图分类号:

R318

王金宁，皮斌，王鹏，朱雪松，杨惠林. 复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥的细胞相容性及毒性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(16): 2519-2525.

Wang Jin-ning, Pi Bin, Wang Peng, Zhu Xue-song, Yang Hui-lin. Cytocompatibility and cytotoxicity of a novel composite bone cement material composed of chitosan microsphere, alpha-tricalcium phosphate and silk fibroin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(16): 2519-2525.

图/表（结果） 2

2.1 壳聚糖微球-丝素基载药磷酸钙骨水泥材料浸提液的MTT检测结果 各组在培养1，3，5 d后的MTT法检测结果见图1a，100%浸提液组、50%浸提液组、阴性对照组A值随着培养时间的增加递增，而阳性对照组A值则基本保持不变。100%浸提液组、50%浸提液组与阴性对照组1，3，5 d的A值比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，阳性对照组与阴性对照组的A值比较差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.2 各组细胞上清液乳酸脱氢酶活性检测 各组在培养1，3 d后的乳酸脱氢酶活性检测结果见图1b。培养 1，3 d时，100%浸提液组、50%浸提液组与阴性对照组细胞上清液的乳酸脱氢酶活性比较差异无显著性意义 (P > 0.05)，阳性对照组的乳酸脱氢酶活性高于其他3组 (P < 0.05)。

2.3 各组细胞光镜检测 在培养1，3，5 d时采用荧光倒置显微镜对各组细胞进行观察(图2)，结果显示1，3，5 d时，100%浸提液组、50%浸提液组的细胞呈多角形或纺锤型，生长良好，与阴性对照组的细胞形态无明显差异，而阳性对照组中的细胞大都已经崩解坏死，显微镜下仅可见少数细胞碎片。

100%浸提液组、50%浸提液组、阴性对照细胞数量随着时间递增，而阳性对照组基本见不到完整细胞，仅有少量细胞碎片。

2.4 MC3T3-E1细胞系在材料表面的电镜扫描观察结果 对接种有MC3T3-E1细胞系的壳聚糖微球-丝素基载药磷酸钙骨水泥的扫描电镜结果显示，细胞在材料表面生长良好，伸展充分，细胞在材料表面伸出伪足，与材料贴附紧密(图3)，图3A-F显示细胞在材料表面伸展良好，能伸出伪足黏附于材料表面。

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引言

随着社会不断的发展，现代化水平的不断提高，外伤、肿瘤、骨质疏松等疾病的患者人数逐年增加，骨质疏松性椎体压缩性骨折及其他部位的骨缺损患者逐年递增。椎体压缩性骨折目前较多采用经皮椎体后凸成形、经皮椎体成形的手术方式在椎体内填充植骨材料，以达到恢复椎体高度，缓解症状的目的，而其他部位的较大骨缺损同样需要使用植骨材料进行填充，因此，植骨材料在骨科临床实践活动中具有重要作用。

理想的骨缺损填充材料应具有骨传导性和骨诱导性^[1]。植骨材料包括自体骨、同种异体骨及人工合成材料等。自体骨移植是骨移植的金标准，具有免疫反应小、成骨性好的优点。但是其造成的创伤大、手术时间长、可能出现局部感染等缺点限制了其应用。同种异体骨移植具有一定的骨传导性，但是其来源受到限制，可引发免疫反应，造成感染等^[2]。人工合成材料中的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥虽具有较好的生物力学性能和注射性，但其在凝固过程中会产生热量，损伤周围组织和细胞，另有报道称聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥颗粒能够对椎间盘细胞的活性、细胞周期、凋亡等生物学行为产生影响^[3]。磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性、理想的降解速率，近年来已有若干文献报道了数种性质各异的磷酸钙骨水泥材料^[4-13]，但总体质地较脆、生物力学性能不理想，限制了磷酸钙骨水泥在临床中的应用^{[5, 9, 14-15]}。

目前，对于磷酸钙骨水泥的改性成为研究热点之一。丝素作为蚕丝脱胶后的产物，因其不存在抗原性，并且具有比较理想的生物力学强度，可以用于增强无机物的生物力学性能^[16-17]。但是，将丝素与磷酸钙相混合而得到的丝素基磷酸钙骨水泥只具备骨传导性，不能携带外源性的成骨诱导因子，不具有骨诱导性，成骨效果不尽如人意。骨的再生需要较长的时间，在此过程中不仅需要成骨诱导因子的参与，还需成骨诱导因子在较长一段时间内维持在一定的浓度^[18]，这就需要一种局部缓释系统的参与。

有研究表明，微球作为一种药物缓释系统已被广泛应用于多肽及蛋白质类药物的缓释^[19]。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，生物相容性好，可降解，抗菌，其表面带有的亲水基团利于细胞黏附，是制作微球的理想材料^[20]。将壳聚糖微球、丝素与α-磷酸三钙相混合得到的壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥既保留了传统磷酸钙骨水泥良好的骨传导性，又可以通过包含其中的壳聚糖微球负载多种成骨活性因子，使其具有一定的骨诱导性，符合理想骨缺损填充材料的特征，具有一定的研究前景。实验拟使用MC3T3-E1前成骨细胞系对壳聚糖微球-丝素基α-磷酸三钙载药骨水泥的细胞相容性及细胞毒性进行评估，以初步探讨该种材料应用于骨缺损填充的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：随机对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年2至11月在苏州大学骨科研究所完成。

材料：MC3T3-E1细胞株购于中科院上海细胞库，经检测不含有支原体、细菌、酵母和真菌。

微米级α-磷酸三钙粉末购置于北京恩赛公司。家蚕生丝购于南通新丝路公司。医药食品级壳聚糖购于南通兴城生物制品厂。

实验方法：

丝素溶液及壳聚糖微球的制备：在2 L水煮沸中加入4.24 g碳酸钠，而后加入5 g家蚕丝，煮30 min后放入冷水中冷却，温水搓洗5次，去离子水搓洗2次，脱去丝胶。将脱去丝胶后的蚕丝溶解于9.3 mol/L的溴化锂溶液中，而后转移至透析袋内，将透析袋放入去离子水中透析72 h后取出，以去除丝素溶液中的溴化锂，之后使用聚乙二醇对丝素溶液进行浓缩，12 h后离心、取上清液，得到丝素溶液，储存于4 ℃备用^[21]。壳聚糖微球的制备采用经典的乳化交联法，配制一定浓度的壳聚糖－乙酸溶液，静置2 d以上待用；于250 mL烧瓶中，分别加入油相液体石蜡、乳化剂Span-80，搅拌0.5 h后加入配制好的壳聚糖溶液，并调节一定的搅拌转速使其形成乳液。加入一定量的三聚磷酸钠溶液反应2 h。将溶液过滤并用石油醚充分洗涤，冷冻干燥即可得壳聚糖微球。

壳聚糖微球-丝素基载药磷酸钙骨水泥的制备及消毒：壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥的制备主要采用液-固法，将壳聚糖微球粉末与α-磷酸三钙粉末按照1∶99的质量比混合，使得微球在混合粉末中的质量分数为1%，而后加入无水乙醇，使得两种粉末混合均匀，自然干燥后，将混合粉末与丝素溶液按照0.4 mL/g的液固比混合，放入模具，制成直径为9 mm，厚度为2.5 mm的水泥材料，并用⁶⁰Co对材料进行辐照消毒。

浸提液的制备：按照ISO10993标准，材料表面积/液体体积=3 cm²/1 mL的比例制备浸提液，将已经消毒好的壳聚糖微球-丝素基载药磷酸钙骨水泥材料置于6孔板内，按照比例加入含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的α-MEM培养基，在37 ℃条件下浸提72 h后取出即得100%浸提液，无菌封装，保存于4 ℃。50%浸提液为100%浸提液稀释2倍后所得。

MC3T3-E1细胞系的培养：采用前成骨细胞系MC3T3-E1细胞，细胞培养于含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的α-MEM培养基中，在37 ℃，体积分数5%CO₂条件下培养，定时换液、待细胞生长至汇合时，传代。

MTT法检测细胞增殖：将MC3T3-E1细胞系用0.25%Trypsin-EDTA消化、计数，制成1×10⁷L^-1的细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种100 μL，再加入100 μL含有含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的α-MEM培养基。

培养24 h，而后弃去原培养液和未贴壁的细胞，按照100%浸提液组、50%浸提液组、阴性对照组、阳性对照组分别换入相应液体，其中100%，50%浸提液组分别加入100%，50%壳聚糖微球-丝素基载药磷酸钙骨水泥材料浸提液，阴性对照组中加入含有体积分数10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM培养基，阳性对照组加入体积分数6.4%苯酚。各组换入相应液体后，分别培养1，3，5 d。弃去原有培养液，加入新鲜相应培养液180 μL，再加入20 μL的 5 g/L MTT溶液，置于37 ℃，体积分数5%CO₂条件下培养4 h后弃去原来液体，每孔加入150 μL的二甲基亚砜，吹打，使生成的紫色结晶物充分溶解于其中，将吹打后的液体移入新96孔板，使用酶标仪检测各孔490 nm波长A值，并记录^[22-23]。

细胞培养液乳酸脱氢酶活性检测：将MC3T3-E1细胞系用0.25%Trypsin-EDTA消化、计数，制成浓度1×10⁷L^-1的细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种100 μL，再加入 100 μL含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的α-MEM培养基。培养24 h，弃去原培养液和未贴壁的细胞，按照MTT法检测细胞增殖分组分别换入相应液体。而后在24，72 h两个时间点随机取各组细胞培养液5份，每份40 μL，使用乳酸脱氢酶活性检测试剂盒分别检测各组细胞培养液的乳酸脱氢酶活性，并记录。

倒置荧光显微镜观察各组细胞系生长情况：将MC3T3-E1细胞接种于96孔板，每孔细胞数为1 000，培养24 h，按照如上分组分别换相应液体，在1，3，5 d使用40 g/L多聚甲醛对各组细胞固定、使用吖啶橙染色试剂盒进行荧光染色，在荧光倒置显微镜下观察各组细胞的生长状态。

扫描电镜观察生长于材料表面的细胞形态：将消毒后的材料放置于48孔板内，将MC3T3-E1细胞系用0.25%Trypsin-EDTA消化、制成细胞悬液，按照细胞数10 000/孔将细胞接种于材料表面，定时换液，培养72 h后用40 g/L多聚甲醛溶液对细胞进行固定，并使用体积分数50%，70%，90%的乙醇及无水乙醇对样品进行梯度脱水，采用扫描电镜对材料表面的细胞形态进行观察。

主要观察指标：①各组MC3T3-E1细胞增殖情况及细胞形态。②各组MC3T3-E1细胞上清液乳酸脱氢酶活性。③MC3T3-E1细胞在材料表面的细胞形态。

统计学分析：采用SPSS16.0对实验数据进行处理，采用组间两两对比采用单因素方差分析(LSD法和S-N-K法)，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

骨组织的再生是由多种因子共同参与的一系列过程，包括间质干细胞的分化，成骨细胞的增殖，细胞外基质的形成和矿化等^[24]。目前存在的人工植骨材料多种多样，但其总体上都不能完全满足临床需求。传统磷酸钙骨水泥具有良好的骨传导性，实验拟以传统磷酸钙骨水泥为基础，通过加入丝素和壳聚糖微球得到复合壳聚糖微球-丝素基α-磷酸三钙骨水泥材料，有望克服现有植骨材料在缺乏骨诱导性的不足，有一定的研究意义。生物相容性是植骨材料应该具有的重要特性之一，实验所使用的基础材料为α-磷酸三钙，有研究表明磷酸钙骨水泥普遍具有生物相容性，因此理论上实验使用的基础材料具有生物相容性，不具有细胞毒性。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，为天然大分子材料，不具有细胞毒性，生物相容性好。丝素为家蚕丝脱胶后的产物，生物相容性良好，不具有细胞毒性。综上所述，壳聚糖微球-丝素基α-磷酸三钙骨水泥理论上生物相容性良好，不具有细胞毒性，故可先假设壳聚糖微球-丝素基载药磷酸三钙骨水泥生物相容性良好，不具有细胞毒性。为了验证以上假设，实验采取了随机对照细胞学实验，对材料进行了细胞相容性及细胞毒性的研究。

植骨材料在植入体内之后，成骨细胞是与材料发生作用的主要细胞之一，实验拟选用成骨细胞进行壳聚糖微球-丝素基载药磷酸钙骨水泥的细胞相容性和细胞毒性研究。目前存在的可被用于体外实验的成骨细胞系主要有SaOs-2、MG-63、MC3T3-E1等^[25]。MG63细胞系是由近皮质骨肉瘤细胞演变而来，与正常人类成骨细胞有较大差异^[26]，SaOs-2细胞系与正常人类成骨细胞相似，但是更适用于成骨细胞细胞外基质相关实验的研究^[25]。相关研究表明MC3T3-E1细胞系的生长速率与人类成骨细胞相似，已经越来越多的被应用在生物材料研究领域^[27-33]。因此课题选择了小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞系作为复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥材料的生物相容性和细胞毒性检测细胞。

MTT法是用于评价细胞毒性的常用方法，MTT能够被活细胞的线粒体脱氢酶还原为难溶于水的紫色结晶，该结晶能够被二甲基亚砜所溶解，使用酶标仪检测其490 nm波长的A值，可以得出相应实验分组细胞的线粒体脱氢酶活性，反映细胞的增殖活性，进而评估细胞毒性。在实验中使用MTT法检测4组1，3，5 d的A值，结果显示，100%浸提液组、50%浸提液组、阴性对照组在培养1，3，5 d的A值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，且随着时间推移逐渐增加，阳性对照组A值显著低于同时间点的其他3组(P < 0.05)，同时阳性对照组A值基本不随时间推移而发生变化。以上结果提示壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥材料浸提液对细胞的生长增殖无明显影响，材料不具有明显细胞毒性。

乳酸脱氢酶是进行细胞毒性评估的重要标记之一，在细胞膜受损或细胞裂解时能够从胞液中释放出来^[34-40]。细胞受损越严重，乳酸脱氢酶活性越高。检测细胞上清液的乳酸脱氢酶活性能够从一定程度上反应出细胞的受损情况，从而推测细胞毒性。在实验中分别检测了4组在培养 1，3 d后的乳酸脱氢酶浓度，结果显示100%浸提液组、50%浸提液组与阴性对照组细胞培养液的乳酸脱氢酶活性差异无显著性意义，而阳性对照组细胞培养液的乳酸脱氢酶活性高于100%浸提液组、50%浸提液组、阴性对照组，且与以上3组存在统计学差异。提示材料浸提液对细胞无明显不良影响，材料无明显细胞毒性。

对100%浸提液及50%浸提液中生长的MC3T3-E1细胞进行荧光染色后，显示其细胞形态与阴性对照组无明显差异，而阳性对照组中的细胞大多都破裂坏死，提示复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥浸提液不具有明显的细胞毒性，进而提示材料本身不具有明显细胞毒性。

骨组织工程主要通过材料与相关细胞的相互作用而达到骨组织再生，因此细胞能否黏附于材料表面，能否在材料表面生长、增殖至关重要。在本实验中，作者将MC3T3-E1细胞系接种于壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥材料表面，培养72 h后使用扫描电镜观察，结果显示MC3T3-E1细胞系能伸出伪足黏附于材料表面，并且在材料表面生长良好，提示该材料适合于细胞的黏附、生长，细胞相容性良好。

综上所述，复合壳聚糖微球-丝素基载药磷酸三钙骨水泥细胞相容性良好，不具有细胞毒性。其可携带多种成骨相关的细胞因子，有着较广阔的研究前景，有望作为植骨材料进一步进行相关的基础和临床研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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复合壳聚糖微球-丝素基载药α-磷酸三钙骨水泥的细胞相容性及毒性

Cytocompatibility and cytotoxicity of a novel composite bone cement material composed of chitosan microsphere, alpha-tricalcium phosphate and silk fibroin

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