干细胞的临床应用：缺少大动物模型和人体试验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.022

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (14): 2269-2274.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.022

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干细胞的临床应用：缺少大动物模型和人体试验

冯涛，考晓明，嵇武

南京大学医学院临床学院，解放军南京军区南京总医院全军普通外科研究所，江苏省南京市 210002

收稿日期:2014-03-14 出版日期:2014-04-02 发布日期:2014-04-02
通讯作者: 嵇武，博士，主任医师，教授，博士生导师，南京大学医学院临床学院，解放军南京军区南京总医院全军普通外科研究所，江苏省南京市 210002
作者简介:冯涛，男，1987年生，山东省潍坊市人，汉族，南京大学在读硕士，主要从事肠黏膜损伤修复方面的研究。
基金资助:
南京市科技发展计划(201104027)

Clinical application of stem cells: a lack of large animal models and human trials

Feng Tao, Kao Xiao-ming, Ji Wu

Research Institute of General Surgery, Jinling Hospital, Clinical School of Medicine, Nanjing University/Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

Received:2014-03-14 Online:2014-04-02 Published:2014-04-02
Contact: Ji Wu, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Research Institute of General Surgery, Jinling Hospital, Clinical School of Medicine, Nanjing University/Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
About author:Feng Tao, Studying for master’s degree, Research Institute of General Surgery, Jinling Hospital, Clinical School of Medicine, Nanjing University/Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Scientific Development Plan of Nanjing City, No. 201104027

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来干细胞的基础和临床应用研究取得了一系列突破性进展。细胞替代疗法可以用来治疗传统治疗方案难以治愈的疾病，具有不可估量的临床应用价值。
目的：综述干细胞在临床应用研究中的新进展。
方法：使用计算机检索Pubmed数据库及中国学术期刊全文数据库(CNKI)2006至2014年有关干细胞临床应用的研究文献。英文检索词为“stem cells, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, stem cell transplantation, neurodegenerative diseases, myocardial infarction, intestinal stem cells, inflammatory bowel disease, acute lung failure "，中文检索词为“干细胞，诱导性多能干细胞，造血干细胞，骨髓间充质干细胞，干细胞移植，神经退行性疾病，心肌梗死，肠道干细胞，炎症性肠病，急性肺衰竭”。排除陈旧性、与研究目的无关和内容重复的文献，收集到47篇相关文献纳入综述。
结果与结论：干细胞是一类具有自我更新能力的多向分化潜能细胞，根据干细胞的分化阶段，其可以分为胚胎干细胞和成体干细胞，也可以通过导入特定的转录因子将分化的体细胞重编程为诱导性多能干细胞。诱导性多能干细胞具备与胚胎干细胞类似的功能，是一种特殊的干细胞。在干细胞应用过程中，应重视可能出现问题的解决，例如社会伦理问题、干细胞的获取与存活、特异性诱导分化等，积极推动干细胞的应用。今后应多着眼于转化医学研究，建立大动物模型，填补人体试验和动物实验之间的证据，同时更多标志性的原始创新性工作急待开展。

关键词: 干细胞, 移植, 诱导性多能干细胞, 造血干细胞, 骨髓间充质干细胞, 干细胞移植, 神经退行性疾病, 心肌梗死, 肠道干细胞, 炎症性肠病, 急性肺衰竭

Abstract:

BACKGROUND: In the past few years, progress being made in stem cell studies has incontestably led to the hope of developing cell replacement therapy which has immeasurable clinical application value for diseases deficient in effective treatment by conventional ways.
OBJECTIVE: To review the new clinical progresses in stem cells.
METHODS: The first author retrieved PubMed database and CNKl database for articles regarding basic and clinical research on progresses of stem cells. The key words were “stem cells, induced pluripotent stem cells, hematopoietic stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, stem cell transplantation, neurodegenerative diseases, myocardial infarction, intestinal stem cells, inflammatory bowel disease, acute lung failure” in English and Chinese, respectively. Outdated, irrelevant and repetitive studies were excluded, and 47 literatures were included for summarization.
RESULTS AND CONCLUSION: Stem cells are characterized as multilineage differentiation potential and self-renewal ability. According to the differentiation stage, stem cells can be divided into embryonic stem cells and adult stem cells. The induced pluripotent stem cells function similarly to embryonic stem cells and become another special stem cells, which are obtained by reprogramming of differentiated somatic cells induced by specific transcription factors. We should attach great importance to solve the possible problems in the application of stem cells, such as social ethics problem, harvesting and survival, specific differentiation, and actively promote the application research of stem cells. Future research should focus more on translational medicine and the establishment of large animal models to fill the evidence between human and animal trials. At the same time, more iconic, original and creative work should be carried out.

Key words: stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, stem cell transplantation, myocardial infarction

中图分类号:

R318

冯涛，考晓明，嵇武. 干细胞的临床应用：缺少大动物模型和人体试验[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2269-2274.

Feng Tao, Kao Xiao-ming, Ji Wu. Clinical application of stem cells: a lack of large animal models and human trials[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2269-2274.

图/表（结果） 1

2.1 干细胞治疗血液疾病血液系统疾病包括一系列因血液细胞谱系的改变而导致的急性或慢性血液病，例如白血病、贫血、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和黑色素瘤等。到目前为为止，造血干细胞移植仍然是治疗某些血液系统遗传疾病惟一可行、有效的治疗方案^[5-6]。多发性骨髓瘤对传统化疗反应率低，并且大剂量化疗加重了患者免疫功能缺陷，中位生存期为二至三年，沙利度胺及其衍生物和硼替佐米等新药联合自体造血干细胞移植显著延长了患者的缓解率及总生存率，为多发性骨髓瘤患者的治疗带来了新的希望^[7-8]。治疗非遗传性血液疾病，如再生障碍性贫血，因为没有病理突变存在，诱导性多能干细胞衍生的造血干细胞非常适合自体移植，而不必进行任何遗传操作。对于遗传性血液疾病，如地中海贫血、镰状细胞性贫血，在患者的诱导性多能干细胞中修复病理突变对于基因校正是必须的。迄今大多数的基因校正工作是在患有血红蛋白病的患者诱导性多能干细胞中进行的。因基因突变致病的基因校正多是在原位通过同源重组进行基因修复或者是在一个安全的基因位点通过转基因技术导入健康的基因^[9-12]。

2.2 干细胞治疗神经退行性疾病由于神经元或者是神经胶质细胞功能障碍引起的神经系统疾病，如帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病以及脑卒中等通常后果严重，甚至危及生命^[13-15]。目前尚无有效治疗方案治愈这些疾病，但是细胞替代疗法可以明显缓解症状，是将来最具疗效的治疗方案。帕金森病是目前研究最充分和效果最肯定的，由于帕金森病的病变主要是黑质多巴胺神经元的变性导致纹状体内多巴胺水平下降所致，目前的药物治疗和外科手术均不能从根本上解决这个问题，近来发展较快的治疗方法则包括干细胞移植及基因治疗等^[16]。另据报道，将能够产生多巴胺受体神经元的人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞移植到啮齿类动物帕金森病模型可以明显改善动物行为障碍^[17-19]。应用锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶、定期聚集空隙短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关系统(CAS)^[20-21]，或依赖辅助腺病毒载体等基因校正技术可进一步提高利用诱导性多能干细胞治疗神经系统疾病的缓解率，而引起微弱的免疫排斥反应^[22-23]，以上研究表明，应用干细胞替代疗法治疗帕金森病或其他神经系统疾病能有效地纠正致病性的遗传缺陷。

2.3 干细胞治疗心脏疾病心脏衰竭是因各种原因，包括心肌梗死和慢性心功能障碍等导致的病理损伤性疾病。成年哺乳动物心肌细胞先天的再生能力非常有限，这使得心脏损伤后的恢复极其困难。传统的治疗方法，例如药物干预和心脏移植等起到的疗效欠佳，而可以抢救心力衰竭患者的干细胞治疗已经在世界范围内引起了极大的关注^[24]，诱导性多能干细胞使再生心肌细胞治疗心脏衰竭等成为可能^[5]。在成人心肌组织中包含有表达酪氨酸激酶受体的心脏干细胞，自我更新、克隆性、多功能性是其三大属性。心脏干细胞最终可以分化为3种主要的心肌细胞，即肌细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞。在心肌梗死后心力衰竭动物模型中进行心脏干细胞移植可以显著减弱心肌细胞重塑，并可以显著改善急慢性心肌梗死患者的左心室功能^[25-26]。另有研究表明，对心肌纤维化患者进行胚胎干细胞移植可以显著抑制心肌细胞凋亡和心肌纤维化，进而逆转心肌重塑和改善心肌梗死后患者心脏功能。这一系列治疗效果得益于胚胎干细胞移植后胶原蛋白沉积的减少、心肌再生的增加以及胚胎干细胞潜在的旁分泌因子，包括抗细胞凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、骨桥蛋白、凝聚素以及抗组织纤维化金属蛋白酶抑制剂1^[27-28]。骨髓间充质干细胞移植可以通过影响心肌细胞形成和心肌血管再生，改善心脏结构的重构和心功能，自体移植应用时无免疫排斥反应，可在体外大量扩增，避免伦理争论。另外骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的研究仍处于初期阶段,随着研究深入，如果找到临床应用有效、安全的剂量，其必将为防治缺血性心脏病提供全新的治疗手段^[29]。间充质干细胞可以向心肌细胞及脉管系统分化，在心血管疾病的治疗过程中越来越体现出其优越性，其可通过旁分泌作用分泌一系列的细胞活素类物质及生长因子，并且动员内在的心肌干细胞，从而起到改善心功能，诱导逆向重塑，降低心梗面积的作用^[30]。

2.4 干细胞治疗肠道疾病炎症性肠病、放射性肠炎、肝移植相关性肠病等利用传统方法治疗疗效欠佳，且常产生严重的不良反应及并发症。干细胞具有强大的增殖分化能力、多向分化潜能以及向损伤组织定向修复的功能，因而在细胞移植方面具有广阔的应用前景。肠道干细胞主要位于肠黏膜隐窝内，其与肠道黏膜上皮的更新和修复密切相关。研究影响肠道干细胞增殖分化的因素，进而分离、获取、培养肠道干细胞，用于有关肠道损伤疾病的治疗具有重要的临床价值。当前，相关研究的最大障碍是缺乏特异性的肠道干细胞标志物，近年来有研究结果表明Lgr5、Bmi1、Musashi-1等可以作为公认的肠道干细胞标志物，尤其是Lgr5特异性较高^[31-32]。在过去的5年中关于干细胞疗法治疗消化道疾病的实验研究数量增加了10倍之多，其中在克罗恩病、各种消化道瘘、肝衰竭等方面取得了突破性进展，有些已进入了三期临床研究阶段^[33-34]。研究表明对于难治性炎症性肠病，特别是肠瘘患者，进行骨髓间充质干细胞移植可以显著减轻患者痛苦，提高患者生活质量。骨髓间充质干细胞移植也应用于治疗放射性肠炎，取得了良好的效果^[35]。骨髓间充质干细胞移植对Th-1或Th-17异常激活导致的炎症性肠病主要是通过以下几个方面：①归巢并在受伤部位存活。②发挥免疫调节作用，控制炎症进展。③加速肠黏膜再生。④促进Th-1细胞和Th-17细胞向Th-2细胞转化并增强调节性T细胞在肠组织对局部炎症的抑制^[36]。有研究发现骨髓间充质干细胞移植对胃肠道手术后吻合口有促进愈合作用，作用主要体现在吻合口张力强度增加、羟脯氨酸水平表达增加、局部新生血管形成以及骨髓间充质干细胞释放的旁分泌介质因子——血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、白细胞介素6等^[37]。对乙肝肝硬化失代偿期患者进行自体骨髓间充质干细胞移植，结果表明在传统口服核苷类似物抗病毒等综合治疗乙肝肝硬化基础上联合自体骨髓间充质干细胞经肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化，能更有效地改善肝功能和凝血功能，患者症状明显好转^[38]。

2.5 其他应用在肾移植的后续治疗中，基于抗体的诱导治疗和钙调神经磷酸酶抑制剂显著降低了移植肾急性排斥反应的发生率，但是机会性感染及钙调神经磷酸酶抑制剂毒性反应仍然不容忽视。Tan等^[39]研究发现，自体间充质干细胞移植联合抗白细胞介素2受体抗体诱导治疗能够显著降低肾移植患者急性排斥反应的发生率及机会性感染，并且1年后肾功能较对照组有显著改善，这主要是利用间充质干细胞的抑制T细胞增殖、单核细胞分化为树突状细胞，调节B细胞功能以及抑制自然杀伤细胞毒作用等免疫调节活性。危重症患者中，急性肺损伤或者急性呼吸窘迫综合征是导致急性肺衰竭最常见原因之一，因间充质干细胞可以分泌生长因子等可溶性因子来调节内皮细胞和上皮细胞的通透性、抗炎性因子以及抗菌肽等，间充质干细胞移植被认为是将来治疗急性肺损伤或者急性呼吸窘迫综合征的理想选择^[40]。另有研究表明，间充质干细胞移植在一定程度上能改善慢性阻塞性肺通气功能障碍患者肺功能，这主要是通过以下几点实现：①下调促炎递质(肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素6)及蛋白酶(基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶12)。②上调血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2及降低肺细胞凋亡的转化生长因子β1^[41]。干细胞在眼科也得到了应用，在眼角膜受到外伤后，角膜间充质干细胞可以迁移分化为角膜基质细胞，这使得其在角膜生物再生工程中备受青睐^[42]。干细胞工程的兴起为视网膜变性、视网膜光毒性损伤、晚期青光眼等难治性疾病的治疗展现了新的曙光，干细胞具有视网膜组织修复和再生的潜能，是目前眼科学领域的研究热点之一^[43]。干细胞在感觉神经性耳聋及组织工程化骨等领域也有着应用^[44-45]，推动了组织工程学的发展。

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引言

在成体细胞中，大部分高度分化的细胞已失去了再分化的能力，而特定组织正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生，这种具有自我更新和分化为某一特定组织或器官成熟细胞功能的细胞即为干细胞。细胞替代治疗在临床领域具有不可估量的应用价值，可以用来治疗传统治疗方案难以治愈的疾病，骨髓移植治疗白血病就是最好的例子。在许多成体组织中包含干细胞群落，其在人体受到创伤、自身病变或者是衰老时进行自我更新、分化，这些细胞位于所谓的干细胞库中(stem cell reservoirs)。

根据干细胞的分化阶段，其可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞的增殖分化是构成机体发育的基础，而成体干细胞的进一步分化是机体组织和器官修复再生的基础。通过导入特定的转录因子可将分化的体细胞重编程为一类特殊的细胞，即诱导性多能干细胞。诱导性多能干细胞是一种特殊的干细胞，它具备与胚胎干细胞类似的功能，成为干细胞研究的热点领域之一。

胚胎干细胞最早在小鼠胚胎着床前囊胚的胚胎内细胞层，其是多能干细胞，意味着它们在体外能够无限制地增殖、分化，同时无论在体内还是体外的3种胚层中都保持有分化为子代细胞的能力。因为通过转基因技术和基因敲除技术使得哺乳动物基因功能的研究可以在体内顺利进行，小鼠胚胎干细胞成为发育生物学中的重大突破^[1]。胚胎干细胞在体外条件下可以建立稳定的干细胞系，并保持高度未分化状态，可以分化形成机体的各种组织和器官。目前胚胎干细胞因伦理学争议、免疫排斥和实验条件限制阻碍了其在临床疾病治疗中的应用。

成体干细胞存在于许多成体组织和器官中，它们通过产生新的细胞以弥补或修复成体组织和器官的缺失，自我更新和多潜能性是成体干细胞最基本的特征^[2]。在特定条件下，成体干细胞通过不对称分裂成子代干细胞和具有定向分化能力的功能细胞，从而使得组织和器官维持生长和衰退的动态平衡。近年来关于成体干细胞研究，在分离、培养、定向诱导和应用基础研究方面取得了诸多突破性进展，部分干细胞产品已进入临床应用，为诸多疑难病症治疗带来了希望^[3]。成体干细胞可以实现自体干细胞移植而避免了胚胎干细胞应用的伦理学争议和移植免疫排斥问题，已成为诸多国家研究的重点，目前发现的成体干细胞主要有造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、肿瘤干细胞、肝脏干细胞、皮肤干细胞、肠上皮干细胞、肌源干细胞等。

2007年美国和日本科学家相继报告利用基因重编程改造体细胞培育出诱导性多能干细胞，诱导性多能干细胞的应用研究使得干细胞替代疗法在治疗人类疾病方面得到进一步提升，是生命科学领域的一次巨大革命^[4]。与胚胎干细胞一样，诱导性多能干细胞能够自我更新并维持未分化状态，在体内可分化为3个胚层来源的所有细胞，进而参与形成机体所有组织和器官。在体外，诱导性多能干细胞可定向诱导分化出多种成熟细胞。基因重编程技术可由皮肤细胞再诱导分化为心肌细胞、神经元细胞、角膜上皮细胞、血管平滑肌细胞、听神经祖细胞等。诱导性多能干细胞已在临床疾病治疗方面展现出广阔的应用前景。

干细胞应用于疾病的治疗得到了越来越多研究的证实，动物实验及临床试验已取得令人鼓舞的研究成果。现将干细胞在疾病治疗中的应用研究进展作一综述。

材料方法

讨论

3 小结 Conclusion

3.1 干细胞在临床应用过程中存在的问题在进行干细胞研究的同时，应该清晰认识到目前为止除了造血干细胞治疗血液疾病，许多其他领域还尚未彻底证明其治疗效果及安全性，干细胞研究与临床应用之间还有较大差距。因此应重视干细胞应用过程中可能出现的问题的解决，包括以下几个方面。

3.1.1 干细胞应用的社会伦理问题因胚胎干细胞的来源途径是以破坏胚胎为代价，这受到了伦理学家、宗教界的质疑与反对，干细胞研究到临床应用还需一段很长的路，科学家们面临的最大挑战并非技术上或理论上的问题，而是关于胚胎干细胞的来源、生殖性克隆、传统的伦理观念等。而成体干细胞应用则涉及患者的知情同意、治疗前后的解释和异体细胞使用权等问题^[46]。诱导性多能干细胞的出现避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题，促进了干细胞研究领域的发展。

3.1.2 干细胞的获取及存活缺乏特异性干细胞标志物严重制约了干细胞的分离及体外培养，并且体外培养的干细胞所处环境与干细胞“原居住地”——Niche之间的差别严重影响了干细胞的存活、自我复制、激活和增生。另外，体外培养的干细胞之间缺乏相互调节作用也降低了干细胞的存活能力。有研究将干细胞去分化，使细胞重塑为更早期、更原始的状态，从而具有更高的细胞存活率，提高了它们的临床应用潜力，这需要更进一步的研究去证实其可行性。

3.1.3 干细胞的特异性诱导分化干细胞移植的最终目标是将干细胞定向诱导为特定的组织或者器官，以针对性地治疗某种疾病，从而恢复机体功能。然而胚胎干细胞的生长发育受到一个复杂、精确体系的调控, 它们相互协作共同促进胚胎干细胞的生长。在胚胎干细胞的定向诱导分化过程中, 许多调控机制尚未完全明了, 还需要进一步深入探索。到目前为止, 所有体外诱导胚胎干细胞定向分化的物质只能提高某一分化组织在分化群落中的比例, 不能诱导形成单一组织。同样，成体干细胞也面临着严峻的挑战，对成体干细胞如何增殖分化构成一个实质性器官仍知之甚少，关于成体干细胞的跨系，甚至跨胚层分化的能力，即成体干细胞的可塑性仍存在不少争议，成体干细胞异质性假说和细胞融合假说对干细胞的可塑性提出了质疑^[47]。利用反转录病毒和慢病毒载体诱导生成诱导性多能干细胞时，可能会引起外源基因整合到体细胞基因组，引起插入突变。蛋白直接诱导诱导性多能干细胞在重编程过程中不会涉及任何的遗传修饰，且蛋白容易失活，从诱导性多能干细胞临床应用的安全角度来看，它是目前最安全的方法，但是需要进一步提高其诱导效率才有可能被广泛应用。

3.1.4 临床试验研究的技术问题及监管干细胞的临床研究既需要系统和科学的设计，更需要医学观察结果的完整性、科学性和准确性。尽管干细胞基础研究发展迅速，但研究技术及层次全球范围内参差不齐，缺乏被广泛认可的规范指南，干细胞临床应用中出现了一些问题障碍，比如干细胞“畸形分化”、干细胞移植所面临的终生免疫抑制药物应用、免疫排斥及机会性感染等，都需要进一步研究。

干细胞的获取、定向诱导分化、应用的可操作性以及一系列社会伦理问题等须在全球领域得到广泛的重视和严格的监管。干细胞治疗是世界范围内的热门研究方向，相比欧美等发达国家，由于科学技术的快速发展和研究领域的不断更新，国内对干细胞应用管理相对迟缓，临床研究数量明显较少，而且创新性不大。国家对干细胞临床研究项目的管理办法指引国内干细胞研究的重新启动即将进入实质阶段，提高了干细胞研究的准入门槛。
3.2 前景与展望干细胞疗法在机体生长、发育及器官组织修复过程中已经表现出巨大的潜力，充分认识组织再生修复工程中干细胞介导的生物学机制是利用这一潜力的关键。最近在分子生物学、基因工程、材料科学等方面取得的突破性进展加深了对干细胞的理解，并加快了其步入临床应用领域的步伐。在血液病、神经退行性疾病、心脏疾病、肠道疾病等治疗中取得了一定的效果。一批创新性、突破性实验研究优化了干细胞的确定、分离、体外培养的方法等，这将有助于将其转化为有效的临床应用治疗。今后研究应多着眼于转化医学研究，建立大动物模型，填补人体试验和动物试验之间的证据，同时更多的标志性的原始创新性工作急待开展。3.2 前景与展望干细胞疗法在机体生长、发育及器官组织修复过程中已经表现出巨大的潜力，充分认识组织再生修复工程中干细胞介导的生物学机制是利用这一潜力的关键。最近在分子生物学、基因工程、材料科学等方面取得的突破性进展加深了对干细胞的理解，并加快了其步入临床应用领域的步伐。在血液病、神经退行性疾病、心脏疾病、肠道疾病等治疗中取得了一定的效果。一批创新性、突破性实验研究优化了干细胞的确定、分离、体外培养的方法等，这将有助于将其转化为有效的临床应用治疗。今后研究应多着眼于转化医学研究，建立大动物模型，填补人体试验和动物试验之间的证据，同时更多的标志性的原始创新性工作急待开展。

干细胞的临床应用：缺少大动物模型和人体试验

Clinical application of stem cells: a lack of large animal models and human trials

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