白藜芦醇联合间充质干细胞改善损伤内皮细胞的代谢记忆效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：白藜芦醇联合间充质干细胞是否能够进一步改善高糖诱导内皮细胞产生的不良记忆目前鲜有报道。
目的：验证不同浓度的白藜芦醇联合间充质干细胞对高糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤代谢记忆效应的保护作用。
方法：将人脐静脉内皮细胞分为10组：正常对照组、甘露醇对照组、高糖组、白藜芦醇低剂量组(0.1 μmol/L)、白藜芦醇中剂量组(1 μmol/L)、白藜芦醇高剂量组(10 μmol/L)、干细胞组、白藜芦醇低剂量+干细胞组、白藜芦醇中剂量+干细胞组及白藜芦醇高剂量+干细胞组。分别于5.5 mmol/L葡萄糖培养第1，4，6天收集细胞培养上清液、提取细胞核蛋白，应用ELISA法检测细胞培养上清中血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1、纤溶酶原激活剂抑制剂1的表达水平，以Western blot法检测细胞内核因子κB的蛋白水平。
结果与结论：与正常对照组相比，高糖可诱导内皮细胞核因子κB表达上调，同时血管细胞黏附分子1 、单核细胞趋化蛋白1和纤溶酶原激活剂抑制剂1水平升高，且在糖浓度恢复正常后仍持续上升。与高糖组相比，白藜芦醇及其联合干细胞干预后可以使内皮细胞核因子κB表达及血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1和纤溶酶原激活剂抑制剂1水平呈白藜芦醇剂量依赖性降低。干细胞组上述指标与高糖组比差异无显著性意义，甘露醇组与正常对照组相比差异无显著性意义。结果提示白藜芦醇可能通过核因子κB通路降低血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1和纤溶酶原激活剂抑制剂1水平，改善高糖代谢记忆效应介导的内皮细胞损伤。而间充质干细胞发挥内皮细胞保护作用可能不仅有赖于核因子κB通路。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 间充质干细胞, 白藜芦醇, 人脐静脉内皮细胞, 代谢记忆, 核因子κB

Abstract:

BACKGROUND: There are rare reports concerning whether resveratrol combined with mesenchymal stem cells is able to further improve the bad memory caused by high glucose-induced endothelial cell injury.
OBJECTIVE: To explore the effects of resveratrol combined with mesenchymal stem cells on high glucose-induced human umbilical vein endothelial cell injury.
METHODS: The human umbilical vein endothelial cells were divided into 10 groups: normal control glucose; mannitol control group; high glucose group; low-dose resveratrol group (0.1 μmol/L); middle-dose resveratrol group (1 μmol/L); high-dose resveratrol group (10 μmol/L); stem cells group; low-dose resveratrol+stem cells group; middle-dose resveratrol+stem cells group; high-dose resveratrol+stem cells group. Cell supernatants were collected to extract nuclear proteins on days 1, 4, 6 after culture in 5.5 mmol/L glucose. Western blot was used to investigate the expression of nuclear factor κB of human umbilical vein endothelial cells. Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the secretion of vascular cell adhesion molecule-1, monocyte chemoattractant protein-1, plasminogen activator inhibitor-1.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal control group, hyperglycemia memory up-regulated the expression of nuclear factor κB and increased the levels of vascular cell adhesion molecule-1, monocyte chemoattractant protein-1, plasminogen activator inhibitor-1, which could still continue to rise after culturing in normal glucose. Resveratrol alone or combined with mesenchymal stem cells down-regulated the expression of
nuclear factor κB and decreased the levels of vascular cell adhesion molecule-1, monocyte chemoattractant protein-1, plasminogen activator inhibitor-1 in a dose-dependent manner, which were lower than those in the high glucose group. There were no significant differences in nuclear factor κB, vascular cell adhesion molecule-1, monocyte chemoattractant protein-1, plasminogen activator inhibitor-1 levels between stem cells group and high glucose group. Resveratrol can attenuate high glucose-induced injury to endothelial cells. The metabolic memory induced by high glucose may be mediated by nuclear factor κB pathway, which may be independent in the efficacy of mesenchymal stem cells in protecting endothelial cells.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, endothelial cells, umbilical veins

中图分类号:

R394.2

丁慧，王鹏，王颜刚. 白藜芦醇联合间充质干细胞改善损伤内皮细胞的代谢记忆效应[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2232-2237.

Ding Hui, Wang Peng, Wang Yan-gang. Resveratrol combined with mesenchymal stem cells improves the metabolic memory effects on endothelial cell injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2232-2237.

图/表（结果） 2

2.1 细胞形态观察人脐静脉内皮细胞融合后呈多角形或短梭形，排列紧密，边界清晰，在倒置显微镜下呈单层铺路石样。选择生长良好的第3-5代人脐静脉内皮细胞用于实验。30 mmol/L葡萄糖刺激16 h后，细胞边界略肿胀，圆缩。经白藜芦醇预处理或联合间充质干细胞干预后，随着前者浓度增加，细胞形态得以改善。随着干预天数延长，可见细胞皱缩，并有死亡细胞及细胞碎片。

2.2 内皮细胞核因子κBp65表达情况正常组细胞核内核因子κBp65表达不明显，高糖组与正常组相比核因子κB p65表达明显增多(P < 0.05)，高剂量白藜芦醇及其联合干细胞组、甘露醇组与正常组相比差异无显著性意义。与高糖组相比，白藜芦醇及联合干细胞干预后内皮细胞核因子κB p65表达呈剂量依赖性降低(P < 0.05)，而干细胞组与高糖组相比核因子κB p65水平差异无显著性意义(图1)。

2.3 内皮细胞培养上清中血管细胞黏附分子1水平人脐静脉内皮细胞于高糖环境培养16 h后，血管细胞黏附分子1水平高于正常组(P < 0.05)，甘露醇组血管细胞黏附分子1水平与正常对照组相比差异无显著性意义。恢复正常糖浓度培养后，高糖组血管细胞黏附分子1水平持续上升，高于正常组(P < 0.05)，甘露醇组与正常对照组相比血管细胞黏附分子1水平差异无显著性意义。干细胞组与高糖组相比血管细胞黏附分子1水平差异无显著性意义，而用白藜芦醇或白藜芦醇联合干细胞干预后，与高糖组相比血管细胞黏附分子1水平大致呈白藜芦醇剂量依赖性降低(P < 0.05)，但低剂量白藜芦醇组及低剂量白藜芦醇+干细胞组与高糖组比较差异无显著性意义(表1)。

2.4 内皮细胞培养上清中单核细胞趋化蛋白1水平人脐静脉内皮细胞于高糖环境培养16 h后，单核细胞趋化蛋白1水平高于正常组(P < 0.05)，甘露醇组单核细胞趋化蛋白1水平与正常对照组相比差异无显著性意义。恢复正常糖浓度培养后，高糖组单核细胞趋化蛋白1水平持续上升，高于正常组P < 0.05)，甘露醇组与正常组相比单核细胞趋化蛋白1水平差异无显著性意义。低剂量白藜芦醇组在第4天以及中、高剂量白藜芦醇单用或联合干细胞组单核细胞趋化蛋白1水平低于高糖组(P < 0.05)，低剂量白藜芦醇组、干细胞组及两者联合组在第6天单核细胞趋化蛋白1水平低于高糖组，但差异无显著性意义(表1)。

2.5 内皮细胞培养上清中纤溶酶原激活剂抑制剂1水平与正常对照组相比，高糖培养16 h后，内皮细胞上清液中纤溶酶原激活剂抑制剂1水平升高(P < 0.05)，而甘露醇组纤溶酶原激活剂抑制剂1水平与正常对照组相比差异无显著性意义。恢复正常糖浓度培养后，高糖组纤溶酶原激活剂抑制剂1水平持续上升，且高于正常组(P < 0.05)，干细胞组和与正常组相比纤溶酶原激活剂抑制剂1水平差异有显著性意义 (P < 0.05)，甘露醇组与正常组相比纤溶酶原激活剂抑制剂1水平差异无显著性意义。低、中剂量白藜芦醇组及低剂量白藜芦醇+干细胞组在第4天纤溶酶原激活剂抑制剂1水平低于高糖组，但差异无显著性意义，低、中剂量白藜芦醇组

第6天和高剂量白藜芦醇组及其联合干细胞组纤溶酶原激活剂抑制剂1水平均低于高糖组(P < 0.05)，见表1。

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引言

糖尿病患者由于早期血糖控制不佳，即使后期血糖降至理想水平，血管并发症仍持续进展，这一现象称为高血糖的“代谢记忆效应”。长期高血糖所致的血管并发症，尤其是动脉粥样硬化，是糖尿病患者病死率高的主要原因之一^[1]。因此，早期干预“代谢记忆”的形成无疑是改善糖尿病患者生活质量，降低糖尿病患者病死率的重要手段。

研究表明，白藜芦醇预处理能使血液中血管生成因子增加，使核因子κB、特异性蛋白1的基因表达增加，起到抗凋亡作用和抗心肌损伤的作用，其主要机制是硫氧还蛋白1和血红素加氧酶1在体内外的促进血管生成的作用。冠状小动脉经白藜芦醇预处理后，其内皮细胞能使HO-1和血管内皮细胞生长因子的表达显著增加，Trx-1表现出显著的加速管样结构形成的作用。锡原卟啉 Ⅸ是HO-1抑制剂，能抑制血管内皮细胞生长因子的表达以及下调血管生成反应，然而，经过白藜芦醇预处理后，大鼠心肌细胞中Trx-1的表达并没有受到锡原卟啉作用的影响，血管内皮生长因子、Trx-1和HO-1均有显著的表达。研究发现，白藜芦醇预处理的实验组心肌梗死面积显著降低，在梗死的心肌周围有新生毛细血管形成^[2]。

近来研究发现，白藜芦醇具有改善糖尿病血管内皮细胞功能的作用^[3-6]，间充质干细胞可通过多种方式促进受损血管再生修复，但两者联合是否能够进一步改善高糖诱导内皮细胞产生的不良记忆目前鲜有报道。内皮细胞分泌血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1和纤溶酶原激活剂抑制剂1是造成内皮细胞损伤的重要因素。而核因子κB参与了上述相关基因表达的调控。

有研究证实，高糖状态可使体内活性氧自由基增多^[7]，进而上调核因子κB表达并进入细胞核，与血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1、纤溶酶原激活剂抑制剂1等靶基因启动子区特异的κB序列结合，编码多种炎症相关基因，诱发血管内皮损伤。同时，高血糖环境可以促进蛋白质非酶糖基化形成的糖基化终产物含量增加^[8]，糖基化终产物能够与糖基化终产物受体结合，参与细胞内活性氧族的生成，进而活化核因子κB^[9]。El-Osta等^[10]发现高糖通过表观遗传修饰途径亦可激活核因子κB通路。

因此，实验以高糖诱导的人脐静脉内皮细胞为研究对象，研究不同浓度的白藜芦醇联合间充质干细胞对核因子κB通路以及血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1、纤溶酶原激活剂抑制剂1分泌的影响，为糖尿病血管代谢记忆损伤的防治用药提供依据。

材料方法

设计：分组对照观察，细胞学实验。

时间及地点：实验于2012年10月至2013年8月在青岛大学医学院附属医院痛风实验室完成。

材料：白藜芦醇以二甲基亚砜溶解，配制成浓度为 100 mmol/L的母液备用，使二甲基亚砜在终培养液中的终浓度小于0.1%，该浓度对细胞生长无影响^[11]。

白藜芦醇联合间充质干细胞改善损伤内皮细胞的代谢记忆效应实验用细胞及试剂：
细胞及试剂	来源
原代人脐静脉内皮细胞(ATCC)	美国菌种保藏中心
人脐带间充质干细胞	青岛大学医学院附属医院干细胞中心
白藜芦醇、二甲基亚砜、D-葡萄糖	Sigma公司
胎牛血清、DMEM培养基、胰酶、 Transwell小室	HyClone公司
青霉素-链霉素溶液	杭州吉诺生物医药技术有限公司
Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒	康为世纪
小鼠抗人核因子κBp65 抗体	CST公司
辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG、β-Actin抗体	北京中杉金桥生物技术有限公司
人血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1、纤溶酶原激活剂抑制剂1检测试剂盒	BD公司

实验方法：

实验分组：将人脐静脉内皮细胞置于DMEM完全培养基(体积分数10%胎牛血清，1%霉素-链霉素溶液)中，于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养。取生长良好的第3-5代细胞用于实验。待细胞达80%左右融合时开始实验，实验开始前无血清同步化过夜。

干细胞与内皮细胞共培养：将人脐静脉内皮细胞悬液以2.5×10⁷ L^-¹的细胞浓度1.5 mL接种于Transwell下室，待细胞达80%左右融合时，换无血清培养液孵育24 h，使细胞生长同步化，然后给予上述干预16 h后，将人脐带间充质干细胞以2×10⁷ L^-¹0.5 mL接种于Transwell上室，置于 37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养。

将人脐静脉内皮细胞分为10组：
组别	干预方法
(1)正常对照组(NG)	5.5 mmol/L葡萄糖×6 d
(2)甘露醇对照组(MA)	5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇×16 h后转为 5.5 mmol/L葡萄糖×6 d
(3)高糖组(HG)	30 mmol/L葡萄糖×16 h后转为5.5 mmol/L葡萄糖×6 d
(4)白藜芦醇低剂量组(LR)	30 mmol/L葡萄糖+低剂量(0.1 μmol/L)白藜芦醇×16 h 后转为5.5 mmol/L葡萄糖×6 d
(5)白藜芦醇中剂量组(MR)	30 mmol/L葡萄糖+中剂量(1 μmol/L)白藜芦醇×16 h 后转为5.5 mmol/L葡萄糖×6 d
(6)白藜芦醇高剂量组(HR)	30 mmol/L葡萄糖+高剂量(10 μmol/L)白藜芦醇×16 h 后转为5.5 mmol/L葡萄糖×6 d
(7)干细胞组(M)	30 mmol/L葡萄糖×16 h后转为5.5 mmol/L葡萄糖+ 干细胞×6 d
(8)白藜芦醇低剂量+干细胞组(ML)	30 mmol/L葡萄糖+低剂量白藜芦醇×16 h后转为 5.5 mmol/L葡萄糖+干细胞×6 d
(9)白藜芦醇中剂量+干细胞组(MM)	30 mmol/L葡萄糖+中剂量白藜芦醇×16 h后转为 5.5 mmol/L葡萄糖+干细胞×6 d
(10)白藜芦醇高剂量+干细胞组(MH)	30 mmol/L葡萄糖+高剂量白藜芦醇×16 h后转为 5.5 mmol/L葡萄糖+干细胞×6 d

表注：各组分别于5.5 mmol/L葡萄糖培养第1，4，6 天收集细胞培养上清液，提取细胞核蛋白进行以下指标检测。

Western blot法检测细胞内核因子κBp65表达：于 5.5 mmol/L葡萄糖培养第6天将各组人脐静脉内皮细胞使用预冷PBS洗涤后，使用细胞刮快速收集细胞于EP管中，按照Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒步骤提取细胞核蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。各组取50 μg蛋白行12%SDS-PAGE电泳及转膜。以核因子κBp65抗体 (1∶1 000)或β-Actin抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(1∶6 000)室温孵育1 h，ECL化学显影，应用Image Pro Plus软件进行灰度分析。

ELISA法检测细胞培养上清中血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1、纤溶酶原激活剂抑制剂1水平：各组分别于5.5 mmol/L葡萄糖培养第1，4，6天收集细胞培养上清液，按照ELISA检测试剂盒说明书步骤进行，于450 nm波长处测定各孔的吸光度值(A)，根据A值计算血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1、纤溶酶原激活剂抑制剂1的含量。

主要观察指标：①细胞形态观察。②内皮细胞核因子κBp65表达情况。③内皮细胞培养上清中血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1及纤溶酶原激活剂抑制剂1水平。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行处理，各数据以x(_)±s表示，若方差齐性，各组均数比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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讨论

实验参考El-Osta等^[9]的方法建立高血糖“代谢记忆”模型，发现高糖诱导人脐静脉内皮细胞中核因子κB表达上调，其上清液中血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1和纤溶酶原激活剂抑制剂1产生增多，且在糖浓度恢复正常后仍持续上升，这与Piga等^[12]的研究结果一致。

高糖诱发血管内皮细胞受损，继而趋化单核细胞黏附并迁移至内皮下间隙是动脉粥样硬化形成早期的关键事件^[13]，这在内皮细胞代谢记忆损伤机制中扮演着重要角色。而内皮细胞分泌的趋化因子如血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1等在上述过程中起重要作用。同时，血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1等也可刺激内皮细胞和单核细胞等炎性细胞分泌更多的炎性细胞因子^[14]，从而加剧内皮细胞损伤的发生和发展。此外，内皮细胞分泌的纤溶酶原激活剂抑制剂1是调节纤溶系统活性的重要因子，其增加可以加剧糖尿病患者动脉粥样硬化血栓形成的风险^[15]。

白藜芦醇又名3，5，4三羟基反二苯代乙烯，是一类存在于葡萄皮、百合科、蓼科等多种药用植物中的多酚类化合物，以虎杖中的含量较高。近来研究发现^[3]，白藜芦醇具有改善糖尿病血管内皮细胞功能的作用，那么其联合具有自我更新能力的间充质干细胞是否能够进一步改善高糖诱导产生的不良记忆呢？

实验结果显示，应用白藜芦醇预处理人脐静脉内皮细胞可以降低高糖诱导的内皮细胞的核因子κB水平，减少炎症因子血管细胞黏附分子1、单核细胞趋化蛋白1、纤溶酶原激活剂抑制剂1的产生，且该作用在糖浓度恢复正常后仍持续存在，这可使单核细胞向内皮细胞黏附降低，进一步减轻血管炎症反应，这一结果提示白藜芦醇逆转高糖诱导的内皮细胞损伤记忆可能与核因子κB通路有关。

κB抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)是核因子κB的激活物。IKK可使IκB磷酸化而激活核因子κB。研究发现，白藜芦醇可以通过上述途径，抑制核因子κB通路，发挥抗炎作用^[16]。另外，白藜芦醇也可能通过抑制β干扰素toll∕白细胞介素1受体结构域衔接蛋白(TRIF)和TANK结合激酶1(TBK1)的表达，调节核因子κB的激活程度^[17]，进而抑制炎症因子产生。Schober等^[18]发现，白藜芦醇还可以通过对microRNA的调节来发挥抗内皮细胞损伤的作用，为治疗糖尿病血管病变提供了新的思考方向。

此外，本研究结果显示干细胞组中上述蛋白及因子水平变化与高糖组相比有所降低，但差异无统计学意义，白藜芦醇联合间充质干细胞干预人脐静脉内皮细胞较白藜芦醇预处理组差异无统计学意义，提示间充质干细胞发挥内皮细胞保护作用可能不仅有赖于核因子κB通路。在短期内，间充质干细胞缺乏足够时间生长、分化形成新组织，其修复损伤内皮细胞的机制可能与细胞旁分泌有关^[4-5,19]。尽管促进干细胞旁分泌的机制尚未完全阐明，但近来研究多表明其受JAK/STAT、p38MAPK等多种细胞通路、表观遗传学及细胞代谢特点改变的影响。

综上所述，白藜芦醇可能通过抑制核因子κB通路改善高糖诱导的内皮细胞代谢记忆损伤，间充质干细胞发挥内皮细胞保护作用可能不仅有赖于核因子κB通路。由于白藜芦醇作用机制复杂，且具有一定的剂量和组织特异性，其血管保护作用有待进一步研究，同时干细胞旁分泌的机制也有待进一步阐明，但其仍为防治糖尿病血管并发症的发生、发展提供了新思路。