HLA单倍体相合与全相合外周血造血干细胞移植后的急性移植物抗宿主病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：异基因外周血造血干细胞移植成为造血干细胞移植的主要方式，近年来HLA单倍体相合造血干细胞移植因供者来源广泛在临床应用较多，急性移植物抗宿主病仍是影响移植成功率的主要因素。
目的：观察亲缘HLA单倍体相合与全相合异基因外周血造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的发生特点，探讨降低急性移植物抗宿主病发生率的方法及单倍体造血干细胞移植应用于临床的意义。
方法：行异基因外周血造血干细胞移植的患者52例，其中HLA全相合组31例，单倍体组21例。HLA单倍体组采用改良马利兰/环磷酰胺+兔抗人胸腺T细胞免疫球蛋白预处理方案，HLA全相合组采用改良马利兰/环磷酰胺预处理方案。移植物抗宿主病的预防采用短程甲氨蝶呤+环孢素A+吗替麦考酚酯的方案。
结果与结论：52例患者均获得完全持久干细胞植入。其中，急性移植物抗宿主病发病率为48%(25/52)，Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病发病率为23%(12/52)；全相合组及单倍体组急性移植物抗宿主病累积发病率分别为39%(12/31)和62%(13/21)(P > 0.05)；全相合组及单倍体组Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病累积发病率分别为10%(3/31)和43%(9/21)(P < 0.05)；发生于移植后+30 d、+31 d-+60 d、+61 d-+100 d的急性移植物抗宿主病类型分布差异无显著性意义(P > 0.05)；发生在移植后+30 d内的急性移植物抗宿主病发生率高于移植后 +31 d-+60 d和+61 d-+100 d；发生急性移植物抗宿主病组和无急性移植物抗宿主病组复发率、2年无病生存率差异无显著性意义(P > 0.05)，全相合组与单倍体组相比复发率差异无显著性意义(P > 0.05)，2年无病生存率前者高于后者(P < 0.05)。说明采用上述移植方案，单倍体组安全性与疗效接近全相合组；在缺乏HLA相合供者时，单倍体造血干细胞移植是治疗恶性血液病的重要方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 造血干细胞, 外周血, 干细胞移植, 异基因外周血造血干细胞移植, 2年无病生存率, 急性移植物抗宿主病, 单倍体, 全相合, 恶性血液病

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, the haploidentical allogeneic peripheral blood stem cell transplantation is popular as its donor source in clinical application. Acute graft-versus-host disease is still the main factor influencing the success rate of transplantation.
OBJECTIVE: To compare occurrence characteristics of acute graft-versus-host disease after compatriots HLA sibling-matched versus haploidentical allogeneic peripheral blood stem cell transplantation and to discuss the way to reduce the occurrence of acute graft-versus-host disease and the clinical significance of haploidentical allogeneic peripheral blood stem cell transplantation.
METHODS: Fifty-two patients undergoing allogeneic peripheral blood stem cell transplantation were retrospectively analyzed, including 31 cases of compatriots HLA sibling-matched cell transplantation and 21 cases of haploidentical allogeneic peripheral blood stem cell transplantation. Conditioning regimen in HLA sibling-matched patients was busulfan/cyclophosphamide+anti-thymocyte globulin for HLA sibling haploid-matched patients, and busulfan/ cyclophosphamide for compatriots HLA sibling-matched patients. Short-term methotrexate+cyclosporine A+mycophenolate mofetil was used for prevention of graft-versus-host disease.
RESULTS AND CONCLUSION: All patients successfully obtained persistent stem cell transplantation. 48% patients (12/52) suffered from acute graft-versus-host disease, and 23% patients (12/52) developed grade III-IV acute graft-versus-host disease. The cumulative incidence of acute graft-versus-host disease was 39% (12/31) in the sibling-matched group and 62% (12/21) in the sibling haploid-matched group (P > 0.05). The cumulative incidence of grade III-IV acute graft-versus-host disease was 10% (3/31) in the sibling-matched group and 42% (9/21) in the sibling haploid-matched group (P < 0.05). Type distribution of acute graft-versus-host disease occurring at 0-30 days, 31-60 days, 61-100 days after cell transplantation showed no difference (P > 0.05). The incidence of acute graft-versus-host disease occurring with 30 days after transplantation was higher than those within 31-60 and 61-100 days after cell transplantation. There were no differences in recurrence rate and 2-year disease-free survival in the patients with or without acute graft-versus-host disease (P > 0.05). Recurrence rate showed no difference between the sibling-matched group and sibling haploid-matched group, but the 2-year disease-free survival rate was higher in the former group (P < 0.05). Therefore, HLA haploidentical transplantation is a good way to increase the source of donors for the treatment of haematological malignancies.

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Key words: stem cells, hematopoietic stem cell transplantation, hematologic neoplasms, graft vs host disease, HLA antigens

中图分类号:

R394.2

郑静静，谢新生，万鼎铭，孙慧，孙玲. HLA单倍体相合与全相合外周血造血干细胞移植后的急性移植物抗宿主病[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2226-2231.

Zheng Jing-jing, Xie Xin-sheng, Wan Ding-ming, Sun Hui, Sun Ling. Acute graft-versus-host disease after compatriots HLA sibling-matched versus haploidentical allogeneic peripheral blood stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2226-2231.

图/表（结果） 2

2.1 参与者数量分析纳入患者52例，全部进入结果分析。2.2 基本资料分析 ①单倍体组和全相合组患者在年龄、性别、疾病类型间差异均无显著性意义(P > 0.05，见表1)。②发生急性移植物抗宿主病患者25例，无急性移植物抗宿主病患者27例，两组回输的单个核细胞数[5.48(2.13- 16.98)×10⁸/kg，5.41(2.62-7.77)×10⁸/kg]、CD34⁺细胞数[6.01(3.45-12.1)×10⁶/kg，7.453(2.62-7.8)×10⁶/kg]比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 造血重建情况 52例患者均获得完全持久干细胞植入，同胞全相合组完成造血重建中性粒细胞>0.5×10⁹ L^-¹中位时间为14 d(8-26 d)，单倍体相合组完成造血重建中性粒细胞>0.5×10⁹ L^-¹中位时间为15 d(11-22 d)。同胞全相合

组脱离血小板输注3 d，维持血小板>20×10⁹ L^-¹的中位时间为14 d(8-28 d)，单倍体相合组脱离血小板输注3 d，维持血小板>20×10⁹ L^-¹的中位时间为17 d(11-37 d)。经监测性别染色体、血型转换，52例患者均获得完全植入。发现两组间粒系、巨核系造血重建时间差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 急性移植物抗宿主病的发生情况

2.4.1 全相合组和单倍体组急性移植物抗宿主病的发生情况 52例患者中，急性移植物抗宿主病发病率为48%，Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病发病率为23%。全相合组31例中12例发生急性移植物抗宿主病，累积发病率为39%；其中Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病3例，累积发病率为10%。单倍体组21例中13例发生急性移植物抗宿主病，累积发病率为62%；其中Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病9例，累积发病率为43%；两组急性移植物抗宿主病的总发病率比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病发生率单倍体组高于全相合组(P < 0.05)，见表2。

2.4.2 全相合组和单倍体组不同时间发生不同类型急性移植物抗宿主病的情况 25例急性移植物抗宿主病患者中有13例患者发生2次急性移植物抗宿主病，1例患者发生3次急性移植物抗宿主病，发生共计40次急性移植物抗宿主病中13次为单纯皮肤型急性移植物抗宿主病(32%)，7次为单纯肠道型急性移植物抗宿主病(18%)，11次为单纯肝脏型急性移植物抗宿主病(28%)，9次为广泛型急性移植物抗宿主病(22%)。发生在移植后+30 d内的有23次(48%)，发生在+31 d-+60 d的有12次(30%)，发生在+61 d-+100 d的有5次(12%)(表3)。发生于移植后+30 d、+31 d-+60 d、+61 d-+100 d的急性移植物抗宿主病类型分布差异无显著性意义(P > 0.05)。发生在移植后+30 d内的急性移植物抗宿主病发生率高于发生于+31 d- +60 d、+61 d- +100 d的急性移植物抗宿主病发生率。

2.5 长期生存情况

2.5.1 发生急性移植物抗宿主病组与无急性移植物抗宿主病组的生存情况随访至2013年7月30日，中位随访时间22个月(7-32个月)。发生急性移植物抗宿主病组共25例，无病存活16例(64%)，死亡9例，其中复发2例(8%)，均治疗无效死亡；4例为Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病相关死亡，均发生于+30 d内，1例为Ⅰ-Ⅱ度急性移植物抗宿主病相关死亡，发生在+24 d，1例死于肝脏慢性移植物抗宿主病，1例在+26 d死于重症肺炎相关的多脏器功能衰竭。无急性移植物抗宿主病组共27例，无病存活22例(81%)，复发5例(占19%)均治疗无效死亡。经统计学分析两组复发率、2年无病生存率差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.5.2 全相合组和单倍体组的长期生存情况相同随访时间内，全相合组31例中无病存活26例(84%)，死亡5例，其中复发4例(13%)，均治疗无效死亡，1例为4个月半时出现重症肺部感染，死于呼吸衰竭。单倍体组21例中，无病存活12例(57%)，死亡9例，6例为100 d内移植相关死亡，复发3例(14%)，均治疗无效死亡。经Log-rank检验，两组间复发率无显著性意义(P > 0.05)，全相合组2年总生存率高于单倍体组(P < 0.05)。

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引言

材料方法

设计：回顾性病例分析。

时间及地点：于2009年8月至2013年1月在郑州大学第一附属医院造血干细胞移植中心完成。

对象：行异基因外周血造血干细胞移植的患者52例，根据HLA配型结果不同，分为亲缘全相合组和单倍体组。单倍体组21例，男15例，女6例；年龄5-42岁，中位年龄21岁；急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)3例，急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)9例，T淋巴母细胞淋巴瘤1例，慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)慢性期4例，慢性粒细胞白血病加速期3例，慢性粒细胞白血病急变期1例。亲缘全相合组31例，男15例，女16例；年龄5-46岁，中位年龄23岁；急性髓系白血病12例(其中1例为骨髓增生异常综合征转化的急性髓系白血病)，急性淋巴细胞白血病9例(其中合并BCR/ABL融合基因阳性者1例)，慢性粒细胞白血病慢性期8例，慢性粒细胞白血病急变期2例。

纳入标准：①患者符合血液病诊断标准^[1]。②预处理方案^[2-5]：单倍体组采用“改良马利兰/环磷酰胺(BU/CY)+兔抗人胸腺T细胞免疫球蛋白(ATG)”方案，全相合组采用“改良马利兰/环磷酰胺(BU/CY)”方案。③患者与家属在充分知情的情况下同意并签字。④移植方案经医院伦理委员会批准。

排除标准：①合并严重基础疾病或脏器功能不全者。②患者或家属要求用其他方法治疗。

异基因外周血造血干细胞移植治疗血液病所用药物及仪器：
药物及仪器	来源
马利兰	英国葛兰素史克有限公司
环磷酰胺	江苏恒瑞医药股份有限公司
阿糖胞苷	砝码西亚普强(中国)有限公司
兔抗人胸腺T细胞免疫球蛋白	Genzyme Polyclonais S.A.S
吗替麦考酚酯	上海罗氏制药公司
甲氨蝶呤	山西普德药业有限公司
环孢素A	Novartis Pharma Schweiz AG, 华北制药股份有限公司
重组人粒细胞集落刺激因子	哈药集团生物工程有限公司、华北制药金坦生物技术股份有限公司
前列腺素E	北京泰德制药有限公司
血细胞分离机COBE Spectra^TM	Gambro BCT,Inc.
流式细胞仪	Beckman Coulter Inc.

方法：

预处理方案：全相合组采用“改良马利兰/环磷酰胺(BU/CY)”方案：羟基脲40 mg/kg，每12 h 1次，口服 (-10 d)；阿糖胞苷1.0-1.5 g/(m²•d)，静脉滴注(-9 d)；马利兰1 mg/kg，每6 h 1次，口服(-8 d至-6 d)；环磷酰胺1.8 g/(m²•d)，静脉滴注(-5 d至-4 d)；卡莫司汀 250 mg/(m²•d)，静脉滴注(-3 d)。单倍体组采用“改良马利兰/环磷酰胺(BU/CY)+兔抗人胸腺T细胞免疫球蛋白(ATG)”方案，即-5 d至2 d应用兔抗人胸腺T细胞免疫球蛋白(ATG) 2.5 mg/(kg•d)，阿糖胞苷加量至4 g/(m²•d)，静脉滴注(-10至-9 d)，环磷酰胺、马利兰、卡莫司汀用法同上。

造血干细胞动员及采集：供者接受重组人粒细胞集落刺激因子5-10 μg/(kg•d)，每12 h皮下注射1次，连续5 d(自-5 d晚7点起至0 d早7点，共注射10次)。第10次皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子动员造血干细胞后，应用血细胞分离机采集外周血造血干细胞，采集完立即回输，回输过程中给予患者心电监护，注意回输过程中患者生命体征变化。同时应用流式细胞仪对造血干细胞进行分析，若输入单个核细胞数小于2.0×10⁸/kg，CD34⁺细胞数小于2.0×10⁶/kg，于当天或者次日补充采集外周血造血干细胞。

干细胞免疫表型检测：应用流式细胞仪对采集的干细胞进行免疫表型分析，采用双色直标法，单克隆抗体：CD34、CD38。具体步骤：①设对照组和实验组两支试管，在实验组中加用CD34、CD38单克隆抗体各20 μL。②分别在两支试管中加用20 μL外周血干细胞，然后混匀，遮光保存20 min。③分别在两支试管中加用0.5 mL红细胞裂解液，混匀后遮光保存10 min。④将两支试管置于离心机中，调至1 000 r/min，持续5 min，弃上清液。⑤在两支试管中分别加入1.5 mL生理盐水，混匀后置于离心机中，调至1 000 r/min，持续5 min，弃上清液。⑥在两支试管中分别加入0.5 mL生理盐水，混匀后置于流式细胞仪进行分析。

移植物抗宿主病的预防和治疗：HLA全相合组采用甲氨蝶呤+环孢素A+吗替麦考酚酯的预防方案：甲氨蝶呤 15 mg/m²静脉注射(+1 d)，10 mg/m²静脉注射(+3 d、+6 d)；环孢素A自-1 d开始3 mg/(kg•d)，持续24 h静脉注射，根据所测血药浓度调整剂量，浓度维持在200-400 μg/L，消化道功能改善后改为口服，+50 d开始减量，+180 d减停；吗替麦考酚酯1 g/d，-1 d-+50 d。HLA单倍体组，环孢素A及吗替麦考酚酯提前至-9 d应用。当急性移植物抗宿主病发生时，治疗首选糖皮质激素：甲强龙2 mg/kg；疗效不佳时加用CD25单抗，他克莫司等。

感染的预防：移植前清除潜在的感染灶，包括口腔、牙齿、肛周等隐蔽部位；所有患者均入住层流病房，施行全环境保护、无菌饮食；粒缺期间常规应用广谱抗生素，一旦出现发热，开始经验性治疗，感染明确后进行针对性治疗；并于+3 d给予重组人粒细胞集落刺激因子；巨细胞病毒(CMV)感染的预防方案：更昔洛韦针5 mg/kg间隔12 h静脉注射(-9 d至-2 d)。

肝静脉阻塞病的预防：前列腺素E1 0.5 μg/(kg•d)，静脉推注(-5 d- +28 d)。每日监测体质量、腹围变化、24 h出入水量，每3-7 d复查肝功。

出血性膀胱炎的预防：移植过程中水化、碱化药物应用及美司钠针应用。

植活监测：以中性粒细胞绝对数≥0.5×10⁹ L^-¹连续3 d及血小板≥20×10⁹ L^-¹连续3 d不输注血小板为植入标准；把红细胞表面抗原转化、染色体(包括性染色体的转化、费城染色体消失)作为监测指标^[6]。

主要观察指标：①造血重建时间。②急性移植物抗宿主病的发生情况(具体标准见参考文献[7])。③急性移植物抗宿主病组与无急性移植物抗宿主病组移植后无病生存情况、复发情况。④单倍体组和全相合组移植后无病生存情况、复发情况。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。两样本均数比较采用t 检验，率的比较采用χ²检验。采用Kaplan-Meier生存分析法进行生存分析，用Log-rank检验比较两组生存差异，取检验水准α=0.05。

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讨论

近年来，随着移植水平的不断进步，异基因外周血造血干细胞移植作为治愈恶性血液病的主要方法越来越多的应用于临床。移植物抗宿主病是造血干细胞移植后的一个影响患者长期生存的重要因素^[8-9]，有效预防和控制急性移植物抗宿主病可以提高异基因外周血造血干细胞移植的成功率，改善患者长期生存质量。

既往研究报道，异基因外周血造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的发生率为30%-60%^[10-12]。在未去T细胞单倍体相合骨髓造血干细胞移植、外周血造血干细胞移植时，重组人粒细胞集落刺激因子用于干细胞动员及连续免疫抑制剂的应用明显降低急性重度移植物抗宿主病发生率^[13-15]。急性移植物抗宿主病的发生与患者的年龄、原发疾病类型(包括HBsAg是否阳性)、预处理方案(含或不含TBI全身照射)、移植物抗宿主病的预防方案、供受者性别异同、供受者血型异同、回输的单个核细胞数、CD34⁺细胞数、HLA配型相合程度、供者自身情况(孕产次数、输血次数等)、移植物来源(骨髓干细胞、外周血干细胞、骨髓干细胞+外周血干细胞)等相关，HLA配型相合程度是急性移植物抗宿主病发生的主要影响因素^[16-17]。体外去除移植物中T细胞可显著降低急性移植物抗宿主病发生率，目前应用兔抗人胸腺T细胞免疫球蛋白进行体内去除T细胞的策略被广泛采纳，其通过补体依赖性溶解和(或)由单核细胞及吞噬细胞作用形成Fc-依赖性调理素机制诱导T细胞凋亡，成为体外去除T细胞的主要替代方法^[18-20]。

本文52例患者中，粒系、巨核系重建基本顺利，急性移植物抗宿主病发病率为48.08%，由统计结果可以看出总发生率不高于其他移植中心，且全相合组与单倍体组急性移植物抗宿主病累积发病率相比无显著性差异，但Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病的发生率前者低于后者(P=0.047)，导致单倍体组100 d内相关死亡明显高于全相合组。与其他移植中心相比，本院使用的多联预防药物，所有患者严格按照剂量、预计用药时间给药，由统计结果可看出减少了单倍体组急性移植物抗宿主病的累积发病率，原因可能与单倍体组预处理方案中加用兔抗人胸腺T细胞免疫球蛋白相关。

目前，移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤效应尚不能分离，后者对造血干细胞移植的作用可能被Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病抵消，造血干细胞移植后长期生存与患者移植前疾病状态、年龄、HLA配型相合程度相关^[17]。本文中发生急性移植物抗宿主病组和无急性移植物抗宿主病组、全相合组与单倍体组2年预期生存率均无明显差异，与国内报道相似^[21]。提示异基因外周血造血干细胞移植后，免疫重建快，可降低疾病复发率和重症感染发生率。另外，本文中全相合组与单倍体组复发率相似，即单倍体相合异基因外周血造血干细胞移植安全性和疗效接近前者，为无同胞全相合供者采用单倍体异基因外周血造血干细胞移植提供了依据。可能由于本文中研究例数较少，得出的结论相对局限，仍有待于观察更多病例资料，进行统计分析。

目前，如何早诊断早发现急性移植物抗宿主病，降低急性移植物抗宿主病的发生率仍是研究热点。有研究表明，对于原发病是急性髓系白血病的患者，可通过检测蛋白NALP2作为急性移植物抗宿主病发生的标志，以早发现、早采取措施，达到减轻急性移植物抗宿主病的目的。黄科等^[22]在一项动物实验研究中，发现输注间充质干细胞可促进受者骨髓间充质干细胞及造血干细胞恢复，缩短骨髓抑制期，降低移植物抗宿主病的发生率。最新研究显示硼替佐米(bortezomib)是一种蛋白酶体抑制剂^[23-25]，动物实验证实硼替佐米能降低移植物抗宿主病的发生率且不影响移植物抗肿瘤效应。

本研究结果提示发生于移植后+30 d、 +31 d- +60 d、+61 d- +100 d的急性移植物抗宿主病类型分布无显著性差异(P=0.974)。发生在移植后+30 d内的急性移植物抗宿主病发生率高于后两组。急性移植物抗宿主病组的累积死亡率36.00%，且Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病的相关死亡率高于Ⅰ-Ⅱ度急性移植物抗宿主病(P=0.025)；单倍体组Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病累积发病率高于全相合组(P=0.047)，多发生与+30 d内。Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病相关死亡率为33.33%(4/12)，与文献报道的急性移植物抗宿主病患者的死亡率(15%-40%)基本一致^[26]。且单倍体组Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病相关死亡率高于全相合组，如何早诊断早发现急性移植物抗宿主病，降低重度急性移植物抗宿主病相关死亡率，针对不同时间、不同类型急性移植物抗宿主病制订个体化治疗方案有待于进一步研究。降低+100 d内重度急性移植物抗宿主病发生率，对单倍体外周血造血干细胞移植广泛应用于临床意义重大，随着移植方法、移植物抗宿主病预防方案、预处理方案等的不断改进及移植物抗宿主病治疗方法的不断进步，单倍体造血干细胞移植疗效会更好，可广泛应用于临床，是目前治疗血液病切实有效的选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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