脂多糖干预卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (14): 2219-2225.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.014

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脂多糖干预卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力

刘大勇，王梅蕊，兰玲玲，赵梦明，贾智

天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津市 300070

收稿日期:2014-02-25 出版日期:2014-04-02 发布日期:2014-04-02
通讯作者: 通讯作者：贾智，副教授，天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津市 300070
作者简介:刘大勇，男，1972年生，河北省迁西县人，汉族，2011年首都医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事牙齿干细胞与组织再生研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81371109)：IGFBP5在牙周膜干细胞介导组织再生中的作用及分子机制研究

Lipopolysaccharide effects on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells derived from ovariectomized mice

Liu Da-yong, Wang Mei-rui, Lan Ling-ling, Zhao Meng-ming, Jia Zhi

Department of Endodontics, Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Received:2014-02-25 Online:2014-04-02 Published:2014-04-02
Contact: Jia Zhi, Associate professor, Department of Endodontics, Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
About author:Liu Da-yong, M.D., Attending physician, Department of Endodontics, Hospital of Stomatology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371109

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨平衡被打破造成的绝经后骨质疏松往往是由炎症因子的升高造成的，在牙周组织中，炎症致病菌可产生破坏宿主组织的毒性因子，如脂多糖、菌毛、凝集素等。
目的：通过建立卵巢切除小鼠骨质疏松的模型，观察脂多糖刺激下骨髓间充质干细胞成骨分化能力的改变，初步探讨雌激素缺乏患者易患牙周炎的细胞分子生物学机制，为绝经后妇女牙周炎的防治提供实验基础。
方法：30只雌性昆明小鼠随机均分为卵巢切除组和对照组。取两组小鼠的骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，同时加入不同质量浓度脂多糖(0，10，100 μg/L)刺激，检测碱性磷酸酶染色、茜素红染色以及碱性磷酸酶活性；RT-PCR之后检测成骨相关分子Runx2、Ocn、Alp的表达。
结果与结论：成骨诱导7 d后可表达碱性磷酸酶，21 d后茜素红染色阳性，可形成矿化结节。检测发现成骨相关分子Ocn、Runx2、Alp的mRNA在成骨诱导后均有表达；3种目的基因在100 μg/L脂多糖作用下表达显著下降(P < 0.05)，卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞在脂多糖作用下3种基因表达较对照组下降显著(P < 0.05)。卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力下降；脂多糖使骨髓间充质干细胞的成骨分化能力下降，卵巢切除组小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力在脂多糖作用下明显减弱，这可能是雌激素缺乏导致牙周炎易感性增加的细胞分子学机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨质疏松症, 牙周炎, 骨髓间充质干细胞, 脂多糖, 成骨分化

Abstract:

BACKGROUND: Postmenopausal osteoporosis often results from upregulation of inflammatory factors. Pathogenic bacteria in periodontal tissues can generate some virulence factors destroying host tissues, such as lipopolysaccharide, pilus, and lectin.
OBJECTIVE: To investigate osteogenic differentiation property of bone marrow mesenchymal stem cells under lipopolysaccharide stimulation in ovariectomized mice, and to preliminarily explore the cellular and molecular biological mechanisms underlying estrogen deficiency patients susceptible to periodontitis, which attempting to provide laboratory evidences for periodontitis prevention of postmenopausal women.
METHODS: Thirty female two-month-aged Kunming mice were randomly divided into ovariectomized group and sham group. Two groups of bone marrow mesenchymal stem cells were subject to osteogenic induction and cultured in media containing different concentrations of lipopolysaccharide (0, 10, 100 μg/L). After osteogenic inductions, alkaline phosphatase staining and alizarin red staining were performed, and expression of Runx2, Ocn, Alp were detected using RT-RCR.
RESULTS AND CONCLUSION: After 7 days of osteogenic differentiation, cells expressed alkaline phosphatase; after 21 days, alizarin red staining was positive and mineralized nodules were visible. mRNA expressions of Ocn, Runx2, and Alp in 100 μg/L lipopolysaccharide group were significantly decreased (P < 0.05). Compared with the control group, the expressions of three target genes were significantly declined after intervention with lipopolysaccharide (P < 0.05). These findings indicate that lipopolysaccharide reduces the osteogenic ability of bone marrow mesenchymal stem cells, especially in ovariectomized mice, which may be one of cellular and molecular mechanisms by which estrogen deficiency leads to increased susceptibility of periodontitis.

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Key words: tem cells, mesenchymal stem cells, bone marrow, periodontitis, osteoporosis, lipopolysaccharides

中图分类号:

R394.2

刘大勇，王梅蕊，兰玲玲，赵梦明，贾智. 脂多糖干预卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2219-2225.

Liu Da-yong, Wang Mei-rui, Lan Ling-ling, Zhao Meng-ming, Jia Zhi. Lipopolysaccharide effects on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells derived from ovariectomized mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2219-2225.

图/表（结果） 4

2.1 雌激素对卵巢切除小鼠体质量的影响喂养小鼠的6周期间，每3 d测量其体质量1次，卵巢切除组较对照组体质量增加明显。处死前卵巢切除骨质疏松小鼠的体质量明显大于对照组小鼠，差异有显著性意义(P < 0.05，图1)。
2.2 影像学检查卵巢切除组小鼠股骨的横断面及股骨干骺端的骨小梁变细，数目明显减少，密度降低，结构不完整，骨皮质变薄，骨髓腔相对变大，部分区域小梁消失或断裂。而假手术组股骨干骺端小梁丰富，皮质骨致密，小梁排列以纵向为主，小梁间距较小。

2.3 原代骨髓间充质干细胞镜下影像倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞呈梭形贴壁生长，两端呈尖性突起，旋涡状排列，细胞贴壁后折光性较差(图2)。

2.4 正常小鼠与卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

2.4.1 碱性磷酸酶染色两组小鼠骨髓间充质干细胞加入脂多糖后，成骨诱导1周后进行碱性磷酸酶染色，大体观察培养皿可见对照组着色效果比相对应的卵巢切除组要深，倒置显微镜下显示对照组相对于卵巢切除组的骨髓间充质干细胞胞浆中有更多的蓝色着色区域，且基本一致，随着加入脂多糖质量浓度的增加，细胞染色程度下降(图3，图4)。

2.4.2 碱性磷酸酶活性的测定随着脂多糖质量浓度的增加，不论对照组还是卵巢切除组的骨髓间充质干细胞的碱磷酶活性都是逐渐降低的，且加了100 μg/L脂多糖的卵巢切除组碱磷酶活性下降的非常明显，差异有显著性意义(图5，P < 0.01)。

2.4.3 茜素红染色各组细胞诱导21 d左右大体观察可见培养皿底部有散在的沙粒样乳白色结节，且乳白色结节被染成橘红色。对照组未加脂多糖的培养皿中沙粒样结节最多，着色程度明显高于其他组，而加入100 μg/L脂多糖的卵巢切除组的培养皿中矿化结节较少。

2.5 半定量RT-PCR检测间充质干细胞成骨分化中Runx2、Ocn、碱性磷酸酶的表达两组骨髓间充质干细胞在成骨诱导2周后经RT-PCR琼脂糖凝胶电泳后可观察到Ocn、Runx2、碱性磷酸酶的mRNA在不同的培养条件下均有表达，相对表达量有差异(图6)，差异均有显著性意义(P < 0.01)。

参考文献

引言

牙周炎是发生在牙龈、牙周膜及牙槽骨等牙齿支持组织的一种慢性感染性疾病，其病因比较复杂。众所周知牙周致病菌是牙周炎的始动因子，而宿主的易感性也起到非常重要的作用。宿主对细菌引起的炎症反应受全身因素和环境因素影响，一些全身因素如内分泌、免疫缺陷和自身免疫疾病等均可影响宿主的防御体系，或加重牙周组织的破坏^[1]。根据世界卫生组织的报告，骨质疏松症是21世纪全球排名前十的疾病^[2]。绝经后女性骨质疏松又称Ⅰ型骨质疏松症，主要由绝经后卵巢合成的雌激素减少所致。雌激素通过与广泛存在于全身包括牙周组织内的雌激素受体结合，对包括牙槽骨在内的全身骨质起保护作用，一旦雌激素缺乏，骨质代谢失去平衡，造成全身骨质疏松，在牙周组织有增加牙周炎易感性的可能^[3]。在绝经后的第一个5-10年，生理状态处于骨转换阶段(即吸收率和形成率)，此时破骨细胞的代谢活性远远高于成骨细胞的代谢活性^[4]。有研究显示绝经后骨质疏松女性牙槽骨密度、牙槽骨高度、牙齿数目低于骨密度正常者^[5-7]。

目前骨质疏松症的细胞学研究多集中于研究破骨细胞的表面受体、功能活性、信号传导等^[8]。过往研究发现，原发性骨质疏松中的成骨细胞数量和功能降低可能与骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的能力降低有关。骨髓间充质干细胞因其干细胞突出的优越性成为包括骨组织工程种子细胞在内的理想来源^[9-12]。而牙周组织本身具有自我更新和修复的能力，有研究发现牙周组织发育完成后牙周膜中同样存在间充质细胞，具有干细胞的共性，能形成牙骨质-牙周膜样复合体，将其命名为牙周膜干细胞，它参与牙周组织的更新，如牙槽骨的改建^[13-14]。骨平衡被打破造成的绝经后骨质疏松往往是由炎症因子的升高造成的，在牙周组织中，炎症致病菌可产生破坏宿主组织的毒性因子，如脂多糖、菌毛、凝集素等。脂多糖是一类具有广泛生物学活性和毒性的大分子物质，也能够诱导细胞分泌多种炎症因子，如白细胞介素6、白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2等^[15-16]，从而导致牙周组织的破坏^[17]。

骨质疏松症与牙周病的关系的生物学机制还不清楚。课题组不能对患有骨质疏松症的牙周炎患者进行牙槽骨的活检来了解骨质疏松在牙周炎发病中的作用和机制，然而动物模型是切实可行的办法。在内毒素坏境中，关于间充质干细胞的成骨特性的改变的研究尚不多见。因此实验通过观察炎症状态下骨质疏松中骨髓间充质干细胞成骨能力改变，希望为牙周炎的治疗提供新的理论和思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：于2013年1至4月在中国医学科学院放射医学研究所动物中心完成。

材料：

实验动物及分组：选用健康昆明小鼠20只，雌性，2月龄，25 g左右，购自北京华富康生物科技有限公司， SPF级，动物许可证号：SCXK(京2009-0004)。适应性喂养7 d，实验喂养周期为6周。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

药品及试剂：脂多糖为购于sigma公司成骨诱导液配方为：含体积分数10% FBS的DMEM培养液(sigma)， 10 mmol/Lβ甘油磷酸钠(sigma)，0.05 mmol/L维生素C和100 mmol/L地塞米松(sigma)。

方法：

动物模型的制作：30只小鼠随机摸球法均分为卵巢切除组和对照组。卵巢切除组用5%水合氯醛按0.6 mL/g腹腔注射麻醉，俯卧位，备皮，在无菌条件下行双侧卵巢切除手术。术后肌注40×10⁴ U青霉素预防感染。对照组处理同上，但不切除双侧卵巢，仅切除卵巢周围等体积的脂肪。

小鼠间充质干细胞的体外分离培养与传代：造模后6周断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，无血清培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，扩增培养。标记为P1代，每三四换液1次；传代培养并记为P2代，以此类推。用于实验研究的细胞，通过流式细胞表面抗原及成骨成脂分化鉴定为骨髓间充质干细胞^[18-19]。

小鼠间充质干细胞成骨分化：卵巢切除组和对照组的细胞培养阶段根据脂多糖加入浓度的不同各分为3组，各组的骨髓间充质干细胞(约5×10⁵个)+脂多糖(0，10 ，100 μg/L)+ 成骨诱导液。诱导7 d分别进行碱性磷酸酶染色和碱性磷酸酶活性测定。诱导21 d行茜素红染色以观察钙结节形成情况。

RT-PCR检测成骨相关分子表达：

总RNA的提取：细胞总RNA的提取按TRIZON试剂说明书进行。弃培养皿中培养液，加入1 mL TRIZON试剂，反复吹打使细胞裂解。室温放置5 min，使蛋白核酸复合物完全分离。将以上液体移至1.5 mL Eppendorf 管中，加入氯仿，每使用1 mL TRIZON加入0.2 mL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15 s，室温放置两三分钟(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮匙剥离细胞)。4 ℃，12 000 r/min离心 15 min，此时样品分为3层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相转移到一个新的Eppendorf管中。新EP管中加入等体积的异丙醇，振荡混匀后室温下静置10 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清。加入体积分数75%乙醇(用无RNase的水配置) 1 mL洗涤沉淀，混匀后4 ℃，12 000 r/min离心3 min，小心吸弃上清。室温放置两三分钟，晾干。加入10 μL无RNase的水，充分溶解RNA。

引物设计与合成：根据GeneBank 中 GAPDH、RUNX-2、OCN、ALP的mRNA序列，由上海生工生物工程有限公司设计并合成符合分子生物学试验要求的引物。引物的序列见表1。

RT-PCR体系建立与优化：对多重PCR的各引物浓度、dNTPs及PCR反应的变性、退火至延伸条件以及循环次数等进行优化，确定最佳的反应模式为：反转录42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。PCR反应体系为50 μL，包括：2×PCR MasterMix(含染料)25 μL，Forward Primer、Reverse Primer各2 μL，Template cDNA 1 μL，5×PCR Enhancer 10 μL，RNase-Free Water 50 μL。经优化的PCR程序：预变性95 ℃ 5 min进入95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，再72 ℃延伸5 min，最后于4 ℃结束反应。

在扩增仪上进行扩增，进行琼脂糖(1.5%)凝胶电泳，利用蛋白凝胶分析软件 Quantity One分析灰度值，检测扩增条带的产物含量(条带灰度值=强度×面积)，各指标相对表达含量=(目的条带灰度值/GAPDH灰度值)×100%。

主要观察指标：Micro-CT观察卵巢切除后大鼠骨微结构的改变；观察对照组和卵巢切除组骨髓间充质干细胞在不同的培养条件下，成骨诱导后Ocn、Runx2、Alp的mRNA表达量是否有差异。

统计学分析：对实验结果采用SPSS 16.0软件进行独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脂多糖是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，作为内毒素的主要致病成分，它参与牙周组织的破坏。通过刺激破骨细胞的活化和分化，激活NF-кB信号转导通路导致炎性细胞因子的产生，如白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和前列腺素E2，从而导致骨吸收^[20]。有报道称大肠杆菌的脂多糖与牙龈卟啉单胞菌的脂多糖效应不同，但是这两种细菌的脂多糖对成骨细胞和破骨细胞的分化以及RANKL、骨保护素mRNA表达是没有差别的。所以，在一些实验中只选用大肠杆菌的脂多糖。

细菌产生的脂多糖可以刺激机体释放炎症细胞因子。这些炎症细胞因子是刺激成纤维细胞和上皮细胞的炎症介质，以此释放前列腺素E2和基质金属蛋白酶。前列腺素可以引起牙槽骨吸收，而基质金属蛋白酶(胶原酶)损毁或破坏结缔组织。另外，白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α也参与破坏，它们使破骨细胞的活性增加^[21-22]。

骨质疏松症和牙周炎是普遍影响中年和老年妇女的两大疾病^[23-24]。这两种疾病影响骨量并拥有同样的危险因素。1960年这种观点才被提及。这种相关性表现在颌骨与长骨同时出现骨吸收，牙齿脱落和非创伤性的骨折。全身性骨丧失可以同一时间增加骨质疏松性骨折的危险性和影响颌骨，增加了牙周炎的危险性，继而出现牙齿脱落。骨质疏松症和牙周炎的关系是复杂的，因为两者都是多因素疾病，并且都有着共同的机制。

另一方面，牙周炎和绝经后骨质疏松之间的一个可能的相互作用还建议在发病水平上。对骨密度的减少，骨质疏松症相关的骨小梁的改变的特征可能会导致颌骨更快速的重吸收引起的牙周炎，造成细菌侵袭牙周。反过来，入侵的细菌，可能会改变骨组织的正常的内环境稳定，增加破骨细胞的活性，并通过释放的毒素和/或炎症递质的释放来减少局部和全身的骨密度。因此，骨质疏松症和牙周炎之间的关系可能是存在的，但需要进一步的前瞻性的研究，以提供确切的证据。

骨髓间充质干细胞成为近年来研究的热点，尤其关注未来在临床治疗的使用，特别是骨骼发育的细胞疗法^[25]。骨形成是一个复杂的过程，涉及到骨前体细胞的增殖，这些细胞在骨表面迁移，并分化为成骨细胞，导致大量的骨基质蛋白的分泌，伴随着矿化过程^[26]。

骨髓间充质干细胞是常见的成骨细胞和脂肪细胞的前体。在适当的调控因子的作用下激活特异性转录调控因子，然后骨髓间充质干细胞向成骨细胞或脂肪细胞系分化。在骨质疏松症中，两个分化途径的平衡被改变，造成骨髓中脂肪的增加而成骨形成受到抑制，这表明在该条件下骨髓间充质干细胞的活性和它们的微环境可能会受到干扰^[27]。

间充质干细胞分化为成骨细胞系是由特定的关键转录因子控制^[28]。Runx2在发育早期间就表达，在骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞系的控制中起着至关重要的作用^[29]。Runx2基因敲除小鼠在出生时就死亡了，因为缺乏成熟的成骨细胞。成骨细胞分化的另一个关键的调节者就是Osterix(Osx)。事实上，Runx2通常在不表达Osx的小鼠中表达而Osx在不表达Runx2的小鼠中也不表达，表明基因Osx在Runx2的下游^[30]。Osx控制成骨细胞前体分化成成熟的成骨细胞时会表达高水平的骨钙素。类似的在Runx2不表达的小鼠，基因敲除Osx的小鼠由于缺乏骨骼骨化作用以及缺乏成熟的成骨细胞，在出生时就死亡了^[31]。骨钙素其主要生理功能是维持骨正常的矿化速率，抑制异常羟基磷灰石结晶的形成，抑制软骨的矿化速率^[32-33]。碱性磷酸酶是参与骨等矿化组织代谢和再生的重要物质，其表达的增加与降低是决定骨矿化程度是否良好的关键条件^[34]。

小鼠去卵巢后体质量明显增加可能是由于雌激素缺乏，小鼠活动减少，能量消耗下降及进食增多所致。在Micro-CT中可以观察到卵巢切除组骨微结构的改变。而牙周炎是局部牙齿牙周龈下菌斑细菌感染引起的炎症性疾病，脂多糖作为内毒素的主要致病成分，可以促进牙槽骨的吸收。实验中给予脂多糖刺激，模拟了牙周炎局部炎症的微环境，在骨质疏松症动物模型中，来比较骨髓间充质干细胞成骨分化能力的改变。结果显示骨质疏松的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力与卵巢切除小鼠相比是下降的，并且成骨相关基因的表达是减小了，从而验证了成骨细胞活性较弱，破骨细胞活性增强的说法，提示在牙周炎中，局部微环境炎症越严重骨丧失可能越多。那么可以认为雌激素的减少引起的骨质疏松可以提高了牙周炎的易感性，加重牙周炎的进展。

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