胚胎干细胞源性神经前体细胞移植脑缺血大鼠局部细胞的免疫反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (14): 2191-2199.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.010

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胚胎干细胞源性神经前体细胞移植脑缺血大鼠局部细胞的免疫反应

梅爱农¹，张苏明²

1福建医科大学省立临床医学院干部特诊一科，福建省临床老年病研究所，福建省立医院老年医学研究室，福建省福州市 350001；2华中科技大学同济医院神经内科，湖北省武汉市 430030

收稿日期:2014-02-07 出版日期:2014-04-02 发布日期:2014-04-02
通讯作者: 张苏明，博士，主任医师，教授，博士生导师，华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科，湖北省武汉市 430030
作者简介:梅爱农，男，1971年生，湖北省秭归县人，汉族，2006年华中科技大学同济医学院毕业，博士，副主任医师，主要从事干细胞移植免疫方面的研究。

Transplantation immunity phenomena after embryonic stem cell-derived neural progenitor cells are grafted into ischemic rat brain

Mei Ai-nong¹, Zhang Su-ming²

1Department of Cadre, Provincial Clinical College, Fujian Medical University, Fujian Institute of Clinical Geriatrics, Fujian Provincial Hospital Key Laboratory of Geriatrics, Fuzhou 350001, Fujian Province, China; 2Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Received:2014-02-07 Online:2014-04-02 Published:2014-04-02
Contact: Zhang Su-ming, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
About author:Mei Ai-nong, M.D., Associate chief physician, Department of Cadre, Provincial Clinical College, Fujian Medical University, Fujian Institute of Clinical Geriatrics, Fujian Provincial Hospital Key Laboratory of Geriatrics, Fuzhou 350001, Fujian Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经前体细胞的免疫原性各家研究结果不一，尤其是体内移植后的机体免疫反应模式需要进一步研究。
目的：体外观察神经前体细胞组成型及诱导型主要组织相容性抗原表达情况；体内观察神经前体细胞移植入大鼠脑缺血组织后局部免疫细胞活化情况，探讨神经前体细胞的移植排斥可能性及模式。
方法：自pCX-hrGFP ES-D3胚胎干细胞诱导分化神经前体细胞，流式细胞术体外检测主要组织相容性抗原Ⅰ，Ⅱ类分子表达及γ-干扰素诱导前后表达变化。实验分3组，磷酸盐缓冲液组、神经前体细胞组分别于大脑中动脉缺血大鼠模型造模后经侧脑室给予磷酸盐缓冲液注射及神经前体细胞移植，假手术组不造模。免疫组化法观察纹状区ED1+、CD4+、CD8+细胞浸润情况；淋巴细胞再刺激增殖实验观测神经前体细胞诱导移植大鼠颈部淋巴细胞的增殖指数。
结果与结论：神经前体细胞组成型高表达主要组织相容性抗原Ⅰ类分子，几乎不表达主要组织相容性抗原Ⅱ类分子；经γ-干扰素诱导后，主要组织相容性抗原Ⅰ类分子进一步上调，主要组织相容性抗原Ⅱ类分子亦有轻度上调，提示神经前体细胞有可能引起机体免疫反应。移植实验表明，与假手术组相比，磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组均表现强烈的ED1+、CD4+、CD8+细胞浸润(P < 0.05)，说明脑缺血损伤本身能导致局部免疫细胞活化；神经前体细胞组比磷酸盐缓冲液组有更强的ED1+、CD4+细胞浸润(P < 0.05)，提示神经前体细胞移植可能导致局部免疫更进一步活化，且以CD4+T细胞反应为主。磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组神经前体细胞诱导下的增殖指数值均较假手术组升高(P < 0.01)，但前两组增殖指数值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，提示脑组织局部炎症导致颈部淋巴细胞增殖性增加，而离体神经前体细胞不足以单独刺激致敏淋巴细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 胚胎干细胞, 神经前体细胞, 免疫原性, 脑缺血, 主要组织相容性抗原, 移植免疫

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have showed inconsistent results in the immunogenicity of neural progenitor cells and further studies are required to confirm the model of immune response after transplantation in vivo.
OBJECTIVE: To observe the constitutive and inducible expression of major histocompatibility complex (MHC) molecules on neural progenitor cells in vitro and the local immune cell activation in lesion tissue after neural progenitor cells grafted in ischemic rat brain, so as to explore the possibility and model of graft rejection of neural progenitor cells.
METHODS: Neural progenitor cells were differentiated from pCX-eGFP ES-D3 embryonic stem cells and the constitutive and interferon-γ-induced expression of MHC class I and II molecules on neural progenitor cells was
observed in vitro by flow cytometry. Neural progenitor cells were then injected into the lateral ventricle of model animals after middle cerebral artery occlusion (MCAO) or sham surgery which were subdivided into the three groups as MCAO+neural progenitor cells injection group, MCAO+PBS injection group and sham+PBS injection group. A histological evaluation of ED1, CD8 and CD4 positive cells infiltration in the striatum and a proliferation assay of lymphocytes dissociated from cervical lymphnodes were performed after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: High constitutive expression of class I but no II MHC molecules was found on the surface of neural progenitor cells by flow cytometry. After interferon-γ induction, a further increase in class I molecules and a mild but detectable upregulation of class II molecules were found, suggesting the possibility of immune response initiated by neural progenitor cells because of the constitutive expression of class I and the inducible expression of MHC II molecules on cell surface. Rats in the MCAO+neural progenitor cells injection and MCAO+PBS injection group had a higher ED1+,CD4+ and CD8+ cells infiltration in the striatum compared with those in the sham group (P < 0.05). Rats in the MCAO+neural progenitor cells group showed even higher ED1+, CD4+ cells infiltration compared with those in the MCAO+PBS injection group (P < 0.05), suggesting that ischemic lesion itself was the main cause for the immunoreactions in brain, whereas the higher infiltration of CD4+ and ED1+ cells in the striatum of rats undergoing neural progenitor cell transplantation, indicating there is also a possible graft rejection directed to neural progenitor cells through CD4+-Th1 pathway. Compared with sham animals, rats in MCAO+neural progenitor cells injection group and MCAo+PBS injection group showed significantly higher lymphocytes proliferation (P < 0 .01), but there was no difference in lymphocytes proliferation between MCAO+neural progenitor cells and MCAO+PBS groups (P > 0.05). This suggests that neural progenitor cells in vitro alone cannot trigger a significant proliferation of lymphocytes.

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Key words: stem cells, brain ischemia, major histocompatibility complex, transplantation immunology

中图分类号:

R394.2

梅爱农，张苏明. 胚胎干细胞源性神经前体细胞移植脑缺血大鼠局部细胞的免疫反应[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2191-2199.

Mei Ai-nong, Zhang Su-ming. Transplantation immunity phenomena after embryonic stem cell-derived neural progenitor cells are grafted into ischemic rat brain[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2191-2199.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析纳入18只SD大鼠，随机分为3组，全部进入结果分析，无脱失。2.2 pCX-hrGFP ES-D3 胚胎干细胞向神经前体细胞诱导分化 pCX-GFG转染的ES-D3细胞在滋养层上形成圆形细胞团(图1A)。撤销滋养层后单细胞胚胎干细胞悬浮培养后形成大小不等的拟胚体。拟胚胎在无血清培养基中逐渐分化，小的类圆形细胞逐渐从周边溢出(图1B)，并逐渐分化成类神经前体细胞(图1C)。常规消化后这些细胞在碱性成纤维细胞生长因子条件下保持扩增能力，并倾向于集落生长，Nestin荧光染色显示双标阳性率为74%以上(图1C-E)，表明经pCX-hrGFP 转染的ES-D3能稳定表达绿色荧光蛋白并在传代和诱导分化中保持荧光的稳定性。

2.3 神经前体细胞表面主要组织相容性抗原Ⅰ，Ⅱ表达情况神经前体细胞表面主要组织相容性抗原Ⅰ类分子高表达(74.37±18.23，图2A)，主要组织相容性抗原Ⅱ几乎无表达(0.39±0.02，图2B)。经过γ-干扰素诱导后，神经前体细胞主要组织相容性抗原Ⅰ类分子表达上调(85.09±21.45，图2C)，主要组织相容性抗原Ⅱ表达轻度上调(5.30±0.01，图2D)。

2.4 ED1、CD4、CD8阳性细胞免疫组织化学检测ED1⁺细胞：假手术组大鼠纹状区可见少量散在ED1⁺细胞(7.0±2.6，图3A)，为正常存在的固定小胶质细胞。而磷酸盐缓冲液组(175.5±56.0，图3B)及神经前体细胞组(331.7±86.2，图3C)ED1⁺细胞显著升高(P < 0.01)，提示缺血本身导致ED1⁺细胞的浸润。组间比较提示神经前体细胞组与磷酸盐缓冲液组表达差异亦有显著性意义(P < 0.01)，神经前体细胞组纹状区内ED1⁺细胞表达明显升高，提示神经前体细胞激活局部免疫反应(表1)。

CD4⁺淋巴细胞：假手术组大鼠散在少量CD4⁺淋巴细胞(7.3±3.0，图3D)。而磷酸盐缓冲液组(67.3±21.3，图3E)及神经前体细胞组(218.8±71.5，图3F)均表现强烈的CD4⁺淋巴细胞浸润(P < 0.01)，提示脑缺血损伤可导致CD4⁺淋巴细胞反应。组间比较显示，神经前体细胞组具最高CD4⁺淋巴细胞浸润，说明存在针对神经前体细胞的CD4⁺淋巴细胞反应(P < 0.01，表1)。

CD8⁺淋巴细胞：假手术组大鼠纹状区可见少量CD8⁺淋巴细胞(13.2±4.4，图3G)。而磷酸盐缓冲液组(97.3± 32.1，图3H)及神经前体细胞(104.0±31.3，图3I)则均见显著CD8⁺淋巴细胞浸润(P < 0.01，表1)，但磷酸盐缓冲液组、神经前体细胞组间差异无显著性意义(P > 0.05，表1)。

2.5 离体神经前体细胞对移植大鼠颈部淋巴细胞增殖性的影响离体神经前体细胞与移植神经前体细胞2周后大鼠颈部淋巴细胞共培养，磷酸盐缓冲液组(1.313±0.231) 及神经前体细胞组(1.172±0.071)增殖指数值较假手术组(0.654±0.143)显著升高(P < 0.01)，提示脑损伤后内源性抗原是诱发局部淋巴细胞反应的主要因素。神经前体细胞组虽较磷酸盐缓冲液组有更高的增殖指数值，但二者之间差异无显著性意义(P > 0.05)，提示离体神经前体细胞单独无法诱发预致敏淋巴细胞增殖反应(图4)。

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引言

胚胎源性神经前体细胞及神经干细胞具有分化成神经元、胶质细胞和寡突胶质细胞的潜能，自其发现以来，一直作为神经组织损伤修复的最重要的工程细胞备受关注^[1]。目前，从动物模型到临床前期研究，神经前体细胞移植的修复效应在许多神经疾病中得到验证，这包括帕金森病、Huntington病、缺血再灌注损伤以及自身免疫性疾病如多发性硬化等^[1-2]。

这类以干细胞为材料、以脑内移植为手段的神经组织工程重建，长期以来伴随着有关干细胞移植免疫特性的研究，并逐渐形成两种不同的观点。一种观点认为，相比更成熟的细胞，类似神经前体细胞这种干细胞源性细胞由于主要组织相容性抗原的低表达^[3-4]，事实上拥有某种程度“免疫特权”^[5]，最近更进一步研究表明，几种干细胞，包括胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞，造血前体细胞，也包括神经前体细胞，显示出一种强烈的免疫抑制效应^[6-8]。有研究表明体外神经前体细胞具有抑制淋巴结来源刀豆蛋白A或者少突胶质细胞糖蛋白诱导的T细胞增殖^[9]，另有研究表明体内同系神经前体细胞移植入局灶脊髓损伤模型，能与原位活化巨噬细胞相互作用，降低它们的数量并增加调节性T细胞的比例^[10]，这种特性，使得它们在免疫相关性疾病比如多发性硬化的移植中尤其值得关注^[1-2]。

而另外一些研究则表明，干细胞来源物在正常环境或炎症环境中均能表达主要组织相容性抗原分子，足以引起免疫排斥^[11-13]。人类临床移植试验表明，移植的神经干细胞尽管有相对较长的存活期，但移植物周围伴随数目众多的免疫细胞包括巨噬细胞、T细胞、B细胞的慢性浸润，添加免疫抑制剂如环孢素A则能部分缓解这种慢性炎症^[14]；在大鼠脊髓损伤模型中，神经干细胞移植物在一个延长的生长和成熟期后仍被最终排斥，而且神经干细胞在脑内外的存活期并没有太大差别，比如将神经干细胞移植入肾被膜可以存活28 d，而移植入中枢神经组织也在大致同一时间内被排斥^[4,14]。

因此，目前对干细胞或干细胞源性细胞免疫原性的了解不是很透彻，不同种类干细胞源性细胞的免疫原性研究也不是很充分。文章关注胚胎干细胞源性神经前体细胞，体外研究其主要组织相容性抗原组成型表达及炎症因子如γ-干扰素诱导下的诱导型表达情况，了解神经前体细胞的基本免疫原性；同时，将神经前体细胞移植入大脑中动脉缺血大鼠模型，观察其在局部损伤环境中的免疫反应模式。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学水平，随机对照动物实验。

时间及地点：于2005年1月至2006年3月在华中科技大学附属同济医院神经内科研究室完成。

材料：

实验动物：6-8周龄健康SD大鼠18只，体质量180- 220 g，按随机数字表法分成3组，每组6只，购自华中科技大学动物试验中心(SCXK(鄂)2010-0009)。

实验方法：

pCX-hrGFP ES-D3向神经前体细胞诱导分化：pCX-hrGFP ES-D3用白血病抑制因子条件培养基(1% L-谷氨酰胺、1%β-巯基乙醇、1%青-链霉素溶液、1%非必须氨基酸、DMEM培养液、20 μg/L白血病抑制因子)悬浮，于0.1%明胶包被的无滋养层的塑料培养瓶中，置37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度温箱中培养。待细胞团长满瓶底的80%后，倒掉培养基，trypsin/EDTA消化、离心细胞后将单细胞悬液加入胚胎干细胞完全培养基(白血病抑制因子条件培养基去除白血病抑制因子)重新悬浮，调整细胞浓度至1×10⁸ L^-¹，按照(2.0-2.5)×10⁴/cm²接种到低黏性细菌培养皿，加入完全培养基，置37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度温箱中连续培养4 d，细胞由接种时的单细胞长成悬浮的圆形细胞团，即拟胚体。收集第4天的拟胚体转移到新的25 cm普通培养瓶，添加完全培养基，置37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度温箱中培养24 h，待拟胚体完全贴壁后轻轻倒掉培养基。加入无血清ITSF培养基(5 mg/L insulin，50 μg/L转铁蛋白，30 mmol/L硒酸钠，5 mg/L纤维连接蛋白)，连续培养6 d。trypsin/EDTA消化，离心后加入诱导培养基(1% N2-supplement，1% B27-supplement， Tris-bFGF 50 μL/50 mL DMEM/F12培养基)将细胞重新悬浮，按照(1.5-2.0)×10⁴/cm²接种到新的培养瓶。添加诱导培养基连续培养6 d，隔天换液1次。Nestin荧光染色免疫细胞化学鉴定^[15]。

胚胎干细胞来源神经前体细胞免疫原性实验的主要仪器与试剂：
试剂及仪器	来源
pCX-hrGFP ES-D3胚胎干细胞、SNL细胞系	同济医院神经内科试验室
倒置相差荧光显微镜	日本Olympus CK40
CO₂培养箱	德国Heraeus
SW-CJ标准型超净工作台	苏州安泰空气技术有限公司
流式细胞计数仪	BD Pharmingen
酶标测定仪	BioRad
DMEM 、DMEM/F12培养基、 100×N2-supplement、50×B27 supplement、重组鼠碱性成纤维生长因子	Gibco
纤维连接蛋白、烟酰胺	Sigma
100×ITS培养液	Hyclone
人白血病抑制因子、兔抗Cy3标记Nestin 单克隆抗体	Chemicon
重组鼠白细胞介素2	Peprotech
MTT	Amresco
丝裂霉素C	Kyowa Hakka Kogyo Co.Lid
鼠抗FITC-MHC-I、FITC-MHC-II、CD4、 CD8单克隆抗体	BD Pharmingen
鼠抗大鼠ED1(CD68)	Serotec

免疫细胞化学鉴定(Nestin荧光染色)：细胞经40 g/L的多聚甲醛室温固定，5%Triton室温作用30 min，SP试剂盒B液封闭非特异性抗原。加入5%BSA 1∶1 000稀释的一抗，37 ℃恒温箱中放置1 h。加入1∶100稀释的二抗， 37 ℃恒温箱放置1 h。50%甘油封固，荧光显微镜下观察。

神经前体细胞体外主要组织相容性抗原Ⅰ与主要组织相容性抗原Ⅱ的表达：收集诱导的神经前体细胞，放入诱导培养基中置37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度温箱中培养。待神经前体细胞长满瓶底后trypsin/EDTA消化细胞，加入等量完全培养基中止消化，吸管反复吹打成单细胞悬液，离心后加入磷酸盐缓冲液(-)将细胞重新悬浮，调整细胞浓度至5×10⁹ L^-¹，分别取4个50 μL，加入1∶20灭活正常兔血清，4 ℃封闭30 min。取2管分别加入FITC-anti- MHC-Ⅰ和FITC-anti-MHC-Ⅱ10 μL，另外两管不加抗体作相应对照。4 ℃避光30 min。磷酸盐缓冲液洗2次，流式细胞仪检测。为检测神经前体细胞体外主要组织相容性抗原Ⅰ与主要组织相容性抗原Ⅱ诱导型表达，将诱导细胞放入含30 μg/L γ-干扰素的诱导培养基中置37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度温箱中培养，待三至四天诱导细胞长满瓶底，收集细胞行主要组织相容性抗原Ⅰ和主要组织相容性抗原Ⅱ流式细胞仪检测。

神经前体细胞体内移植实验：①动物分组：18只SD大鼠，随机分成假手术组、磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组。磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组分别在造模基础上给予磷酸盐缓冲液注射及神经前体细胞移植；假手术组给予磷酸盐缓冲液注射。②大脑中动脉缺血模型的制作及神经前体细胞脑内移植：磷酸盐缓冲液组及神经前体细胞组采用线栓法制作大脑中动脉缺血模型^[16]。假手术组仅仅暴露颈部，结扎颈外动脉及颈总动脉的近心端。大脑中动脉缺血模型或假手术组大鼠手术2周后，用6%水合氯醛麻醉，固定在立体定向仪上，按Pellegrino鼠脑定向图谱行侧脑室注射定位(前囟后1.0 mm，旁开1.8 mm，深3.5 mm)。移植前神经前体细胞重悬于磷酸盐缓冲液(-)液体中，调整细胞浓度为2.5×10¹⁰ L^-¹；磷酸盐缓冲液组及假手术组以磷酸盐缓冲液(-)替代细胞悬液，注射2 μL。③免疫组织化学检测：移植2周后(缺血后4周)大鼠麻醉后断头取脑，于移植针孔后1 mm连续冰冻切片，厚度20 μm，隔3取1，分别对应行鼠抗 ED1、CD4、CD8免疫组化检测。切片于体积分数3%过氧化氢中孵育5 min，正常羊血清室温下孵育 20 min，吸干，加一抗抗体(1∶200)4 ℃过夜，按试剂盒说明书加入二抗，DAB染色后常规脱水、透明、封固、镜检并照相。对应每个分子检测，每只大鼠取3张切片，×40物镜下在纹状区随机选取4个视野进行计数，3张切片共12个视野细胞总数计入统计(面积0.72 mm²)。④淋巴细胞再刺激：分离如上动物颈部淋巴细胞，调整浓度为5×10⁸ L^-¹。神经前体细胞按5×10⁴(200 μL)/孔接种96孔板，用诱导培养基在37 ℃、体积分数5%CO₂培养5 d，在淋巴细胞加入之前2 h加入丝裂霉素C(20 mg/L)灭活。每只动物取4份5×10⁴(100 μL)淋巴细胞分别加入3个灭活的神经前体细胞孔样和一个空白孔样，同时加入重组鼠白细胞介素2刺激淋巴细胞增殖，另外预留一个灭活神经前体细胞的孔样，加入100 μL含成纤维细胞生长因子的诱导培养基。每只动物都对应3个“淋巴细胞+神经前体细胞”孔样，计为“LN”；1个“淋巴细胞”孔样，记为“L”；1个“神经前体细胞”孔样，记为“N”。在37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度温箱中孵育68 h。在培养结束前4-6 h培养板各孔加入1 g/L MTT液在37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度温箱中培养6 h后，每孔加入2%SDS过夜培养。用酶标测定仪测570 nm下的吸光度(A_{570 nm})，淋巴细胞增殖指数(PI)用以下公式进行校正：PI=(LNA _{570 nm}-NA _{570 nm})/LA _{570 nm}。

主要观察指标：神经前体细胞主要组织相容性抗原Ⅰ、主要组织相容性抗原Ⅱ类分子表达；神经前体细胞体内移植后局部ED1、CD4、CD8阳性分子表达；移植神经前体细胞后局部致敏淋巴细胞对神经前体细胞的再刺激反应(增殖指数)。

统计学分析：资料用x(_)±s表示，采用SSPS 17.0软件进行统计，多组比较用one-way ANOVN方差分析，两两比较采用LSD法。以α=0.05为检验显著性水准。

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讨论

引起同种(异体)移植排斥的最主要原因是供、受者之间的组织相容性抗原不同，刺激受者的免疫系统产生免疫应答。组织相容性抗原存在机体所有细胞的表面，它有主要和次要之分，能引起强烈排斥反应者为主要组织相容性抗原，引起较弱排斥反应者为次要组织相容性抗原。从本质上分析，供、受者间主要组织相容性抗原型别的差异是产生移植排斥的主要原因^[17]。人类主要组织相容性抗原抗原在人类为人白细胞抗原，编码人白细胞抗原的基因群称为人白细胞抗原复合体。在小鼠，主要组织相容性抗原抗原称为H-2(histocompatibility-2)，由小鼠第17号染色体上的H-2复合体编码，该复合体的K、D区产生H-2 Ⅰ类抗原，Ⅰ区则产生H-2 Ⅱ类抗原。这两类抗原由不同的基因编码，具有不同的结构和功能，在抗原提呈和诱发同种排斥反应中作用不同，比如，Ⅰ类分子几乎表达所有有核细胞表面，它们参与CD8⁺CTL识别抗原；而Ⅱ类分子的表达受严格的控制，组成型表达仅仅限于少量通常与抗原提呈相关的细胞类型，包括B细胞、树突状细胞、胸腺上皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞，它们参与CD4⁺Th细胞识别抗原^[18]。

在传统的器官移植或组织移植中，经典的同种免疫排斥反应有“直接识别”和“间接识别”两种途径。在移植数小时至数天内，移植器官和组织中的“过客白细胞”^[19-21]，其中主要是抗原递呈细胞如树突状细胞，自供体组织中“溢出”并与移植物周围淋巴结中宿主滞留T淋巴细胞接触。这种T淋巴细胞，在生理状态能本来仅保持对自身抗原递呈细胞表面主要组织相容性抗原/内源肽复合体的识别能力并维持“无应答”。但在移植环境下，当“过客白细胞”表面外源主要组织相容性抗原/外源肽复合体具有足够的相似性使得宿主T淋巴细胞发生“误认”，同时又具备足够差异性得以激活宿主T淋巴细胞发生“应答”，这种“分子模拟”机制使得宿主T淋巴细胞将外源主要组织相容性抗原/外源肽复合体误认为内源性主要组织相容性抗原/外源肽复合体，排斥反应就发生了^[21]。这种T细胞反应在移植中是独一无二的，称为“直接识别”，其反应迅速而强烈，据推测占个体1%-5% T细胞将参与其中^[21]。而在移植后数小时、数周到数月，外源性组织，如自移植体释放的供者可溶性主要组织相容性抗原分子或膜脆片，会被宿主专职抗原递呈细胞如树突状细胞或B淋巴细胞吞噬和处理，通过表面主要组织相容性抗原Ⅱ类分子递呈给自身CD4⁺ T淋巴细胞，产生与生理状态下相似的CD4⁺Th1免疫反应，这种途径称为“间接途径”^[21-23]。这种途径产生的特异性T细胞仅对特异性肽段产生应答，由于需要多方面构件匹配，因而对非致敏个体来说，初始型T细胞对任何给定的抗原肽的反应频率仅为直接途径T细胞的100-1 000倍分之一^[21]。现在广泛认同直接识别在急性器官移植排斥中起主要作用^[14]。

然而对干细胞来源组织，除非来源于中胚层分化的干细胞和造血组织，不可能包括致免疫性的成熟的树突状细胞等“过客白细胞”和血管内皮细胞，因而不能够通过传统“直接识别途径”触发同种排斥^[21-23]。事实上，对细胞移植物来说，早期受到的排斥主要是受者CD8⁺CTL细胞以及非特异性杀伤细胞如自然杀伤细胞和巨噬细胞与表达Ⅰ类抗原的移植细胞直接结合导致的^[23]。在移植的较晚期，受者体内的抗原递呈细胞开始抗原的间接提呈，激发CD4⁺Th1介导为主的同种排斥。

本文发现神经前体细胞组成型表达主要组织相容性抗原Ⅰ类分子，但主要组织相容性抗原Ⅱ类分子几乎无表达，提示神经前体细胞具备被免疫排斥的基础。如果给予γ-干扰素，则主要组织相容性抗原Ⅰ/Ⅱ类分子均可上调，不过主要组织相容性抗原Ⅱ类分子上调非常微弱。因此从主要组织相容性抗原分子表达模式来看，神经前体细胞应该可能面临宿主CD8⁺CTL溶细胞毒性反应，但随后Ⅱ类分子上调引起的持续慢性的炎症反应也不能完全忽视，因为据研究，干细胞在分化过程中或局部炎症因子(比如γ-干扰素等)的作用下会显著上调主要组织相容性抗原Ⅱ类分子^[12-13]，而已知所有的脑组织损伤必不可少地伴随有类似的炎症因子发放。从时间梯度上看，主要组织相容性抗原Ⅰ类分子往往导致移植早期冲击性的破坏作用，而由Ⅱ类分子触发CD4⁺Th1迟发型超敏反应则出现较晚而持续，是免疫反应最大化和慢性排斥的关键^[19-20]。

神经前体细胞的这种免疫学特性，与其他几种胚胎干细胞源性前体细胞极具相似性。研究表明鼠胚胎干细胞源性造血前体细胞，低表达主要组织相容性抗原分子，但在γ-干扰素等其他细胞因子的刺激下上调，然而，尽管刺激后主要组织相容性抗原Ⅰ类分子表达上调，它们不表达主要组织相容性抗原Ⅱ类分子，因为它们缺乏关键的Ⅱ类转录因子CIITA的表达^[24]。Wood’s工作组同样证明，当胚胎干细胞分化成造血前体细胞后，其主要组织相容性抗原Ⅰ类分子表达上调，分化的胚胎干细胞能在γ-干扰素的作用下更快的上调主要组织相容性抗原Ⅰ/Ⅱ类分子^[25]。研究表明另外一种常见的干细胞骨髓间充质干细胞表达低主要组织相容性抗原Ⅰ类分子，缺乏主要组织相容性抗原Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86或CD40，而主要组织相容性抗原Ⅰ/Ⅱ类分子表达在γ-干扰素的刺激下能上调，然而，这种上调不足以增强骨髓间充质干细胞的免疫性^[26]。

然而，从目前有关干神经前体细胞的免疫原性的资料看，不同种属、不同分化状态甚至不同培养条件下，干细胞主要组织相容性抗原分子的表达情况并不相同，某些结论甚至是相互矛盾的。比如，有研究表明人类神经干细胞在白血病抑制因子的作用下仅仅表达HLA-DR而无其他主要组织相容性抗原分子^[27]，而γ-干扰素和转化生长因子α则能诱导噬齿类动物和人类的神经干细胞主要组织相容性抗原Ⅱ的上调^[28]。不同分化状态下主要组织相容性抗原表达也可不同，如在体外鼠神经前体细胞在分化过程中主要组织相容性抗原分子表达下调，而大鼠神经干细胞在体外诱导分化后主要组织相容性抗原分子表达上调^[28-29]。因而，神经前体细胞的体外的免疫原性影响因素较多，可能导致各家研究结论不尽相同，除非研究条件一致，将某个别研究结论完全类比于别的研究，值得商榷。

大脑曾被认为是“免疫赦免”器官之一，原因是脑内移植物通常能长时间存活^[30]。但脑内移植存在免疫排斥现象的确不断被观察到，构成排斥反应的脑内局部免疫系统现在认为也是很完备的。比如，脑内存在抗原递呈细胞；脑内的抗原能很迅速地引流至外周淋巴器官；血脑屏障破坏能导致致敏地T细胞在损伤局部地浸润，因而，在一定情况下，脑内移植也能发生与其他器官移植同样强度地排斥反应^[1^，^31]。据研究脑内移植排斥反应很少发生在数小时内(预置抗体攻击整体器官移植的内皮组织)，但移植1周后局部浸润淋巴细胞则对引流入的主要组织相容性抗原抗原致敏^[32-34]，而引起急性排斥，之后演变成慢性而持续的炎症反应，因而脑内移植排斥的特征以细胞免疫反应为主，包括移植区内和脑血管周围T细胞亚型和单核吞噬细胞浸润、局部小胶质细胞激活以及全身炎症因子反应等^[35-36]。为此，本文着重观察了神经前体细胞移植后局部小胶质细胞及T淋巴细胞的反应情况。

本实验首先观察到，相比非缺血组，脑缺血组本身纹状体可见显著的ED1⁺、CD4⁺、CD8⁺细胞浸润，颈部淋巴细胞增殖性也相应升高。ED1是组织巨噬细胞的标志物，在脑内由活化小胶质细胞表达。静止的小胶质细胞相对不成熟，但在一定条件如脑缺血损伤等情况下能成长为巨噬细胞和树突状细胞，从而具有吞噬和抗原提呈的功能。这种细胞在细胞免疫中居中心环节，通过识别主要组织相容性抗原Ⅱ类分子诱发CD4⁺淋巴细胞介导的CD4⁺-Th1免疫反应，通过识别主要组织相容性抗原Ⅰ类分子诱发CD8⁺淋巴细胞介导的CD8⁺-CTL免疫反应。这种结果说明脑损伤本身能引起局部活跃的免疫反应，而已有研究表明这种反应可能由损伤脑组织内源性抗原释放触发^[37-38]。

进一步分析发现，相比无移植的脑缺血大鼠，神经前体细胞移植的缺血大鼠见更强的ED1⁺、CD4⁺细胞浸润，但CD8⁺淋巴细胞浸润两组并未显示差别。因而，神经前体细胞移植可能的确会引起局部免疫反应，而且可能主要以CD4⁺T细胞反应为主。这种CD4⁺T细胞为主的反应模式需要仔细推敲，因为神经前体细胞表面本来组成型表达主要组织相容性抗原Ⅰ类分子，几乎不表达主要组织相容性抗原Ⅱ分子。而根据研究，当细胞克隆移植后，受者的免疫细胞如抗原递呈细胞、CD4⁺T、CD8⁺T细胞能直接识别移植物表面的主要组织相容性抗原类分子而活化，这种识别并不需要生理状态下体内抗原识别所需的严格的主要组织相容性抗原限制性^[17]。CD8⁺T细胞通常识别主要组织相容性抗原Ⅰ类分子，活化后的CD8⁺T细胞克隆增殖CTL细胞，通过溶细胞毒性破坏移植细胞；CD4⁺T细胞主要识别主要组织相容性抗原Ⅱ类分子，主要通过CD4⁺Th1克隆性增殖和细胞因子的作用导致炎症反应。因此，神经前体细胞理论上存在诱导CD8⁺T细胞反应可能，而本文中出现的这种反应模式可能需要从如下几个方面考虑。

首先，有研究表明，移植干细胞主要组织相容性抗原Ⅰ类分子表达模式是时间调控的，在大约移植两至三天后表达减弱，即具有衰减性^[17^，^22]。而由主要组织相容性抗原 Ⅰ类分子引起的早期冲击下破坏作用(实际上包含CD8⁺CTL溶细胞毒和自然杀伤细胞细胞的先天性免疫)本身在移植后数周逐渐衰减^[17^，^21]，这可能解释在本实验设计终点(移植后2周)上，缺血大鼠CD8⁺淋巴细胞浸润已逐渐衰减到对照组水平。

其次，在移植时间点上，CD4⁺T细胞浸润可能代表如下机制：①神经前体细胞在分化状态下会上调包括主要组织相容性抗原Ⅱ类分子，脑组织在损伤炎症情况下本身会释放一些炎症因子比如γ-干扰素和肿瘤坏死因子α^[1]，可能会诱导移植细胞上调主要组织相容性抗原Ⅱ类分子，这些条件下移植细胞免疫原性逐渐增强，足以诱导CD4⁺-T细胞免疫反应^[22,39-40]。②宿主的抗原递呈细胞如小胶质细胞对移植细胞脆片的间接抗原递呈作用，主要地触发CD4⁺T细胞为主的免疫反应，而据认为这种“间接途径”在细胞移植排斥中通常起主要作用^[21-23]。本文中，脑缺血组织本身会诱使局部小胶质细胞活化，活化的小胶质细胞可能吞噬和处理移植细胞的脆片，通过传统抗原递呈过程诱导CD4⁺T细胞反应，是本研究中CD4⁺T细胞反应主要可能原因。③目前对干细胞来源物的免疫反应模式并没有得到统一的结论。因为近期有研究表明，几种干细胞，包括胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或神经干细胞，显示出强烈的免疫抑制效应^[26,40-42]，有研究表明体外神经前体细胞具有抑制淋巴结来源刀豆蛋白A或者少突胶质细胞糖蛋白诱导的T细胞增殖^[9]；另有研究表明体内同系神经前体细胞移植入局灶脊髓损伤模型，能与原位活化巨噬细胞相互作用，降低它们的数量并增加调节性T细胞的比例^[10]。来自骨髓间充质干细胞的研究表明，当骨髓间充质干细胞与树突状细胞工培养，能干扰树突状细胞的成熟，并使产生的细胞因子发生偏离，比如白细胞介素10抑制性细胞因子增多而白细胞介素12等刺激性细胞因子减少，从而间接扩充了调节性T细胞的数量^[26]，后者包括产细胞因子的CD4⁺Tr1细胞以及CD4⁺CD25⁺调节性T细胞，这类细胞表现出与Th1细胞相反的负性免疫调节功能。自本试验中淋巴细胞增殖反应来看，当通过向缺血脑组织移植神经前体细胞使局部淋巴结致敏，再将该致敏感淋巴细胞与神经前体细胞共培养，并未发现比单纯缺血组更高的增殖指数值，说明体外情况下未分化的神经前体细胞不足以引起淋巴细胞增殖，其较假手术组升高的增殖指数值，只不过是脑缺血损伤本身炎症背景反应，后者可能与脑损伤后内源性抗原导致局部淋巴细胞母细胞化转变有关。从本实验中神经前体细胞对假手术组淋巴细胞诱导的增殖指数值反而降低(<1)的情况看，似乎支持神经前体细胞具有体外的免疫调节功能。这种免疫调节功能，在其他常见的干细胞，比如胚胎干细胞、造血前体细胞中也曾得到验证^[43]。因此，本实验中呈现的CD4⁺T细胞浸润，究竟是Th1细胞抑或调节性T细胞，尚待研究。

因此，本实验尚存在部分局限性，需要更加细分观察的时间节点，以动态观察移植后CD4/CD8反应模式；同时需要更进一步确认增高的T淋巴细胞的表型，包括Th1、Tr1及CD4⁺CD25⁺调节性T细胞阳性细胞的比例，以及伴随的各种细胞因子水平变化，这些都待进一步研究。

胚胎干细胞源性神经前体细胞移植脑缺血大鼠局部细胞的免疫反应

Transplantation immunity phenomena after embryonic stem cell-derived neural progenitor cells are grafted into ischemic rat brain

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