脂肪干细胞体外分离培养鉴定及免疫学性质

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (14): 2167-2172.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.006

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脂肪干细胞体外分离培养鉴定及免疫学性质

依里牙尔•依里哈木，王云海，王理，高华，许新才，张文斌

新疆医科大学第一附属医院胃肠外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2014-02-24 出版日期:2014-04-02 发布日期:2014-04-02
通讯作者: 张文斌，博士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院胃肠外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:依里牙尔?依里哈木，男，1983年生，新疆维吾尔自治区人，硕士，医师，主要从事胃肠肿瘤方向的研究。
基金资助:
新疆医科大学第一附属医院组织工程专项项目(201022GC02)

Human adipose-derived stem cells: in vitro isolation, culture, identification and immunological properties

Eliyar Elham, Wang Yun-hai, Wang Li, Gao Hua, Xu Xin-cai, Zhang Wen-bin

Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2014-02-24 Online:2014-04-02 Published:2014-04-02
Contact: Zhang Wen-bin, M.D., Associate chief physician, Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Eliyar Elham, Master, Physician, Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Special Project of Tissue Engineering in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 201022GC02

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞由于具备易于获取等特点，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更加广阔的应用前景，并因此成为当今的研究热点之一。
目的：观察脂肪干细胞的生长规律，鉴定其干细胞特性和免疫学性质。
方法：自整形外科行抽脂的3名健康志愿者身上获取皮下脂肪组织及外周血，志愿者年龄20-30岁，均为女性。用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织获得脂肪干细胞，在体外原代培养及传代培养，观察其体外增殖能力等生物学特性；通过流式细胞术检测人脂肪干细胞分化群表面抗原和主要组织相容性抗原的表达。并将异体脂肪干细胞和淋巴细胞共培养，观察脂肪干细胞是否可以刺激后者增殖。
结果与结论：所获脂肪干细胞具有很强的体外增殖能力，其生长曲线呈“S”形；第3代脂肪干细胞表面CD29、CD44、CD90以及主要组织相容性抗原Ⅰ呈阳性表达，CD31、CD45、CD34及主要组织相容性抗原Ⅱ呈阴性表达；未发现异体脂肪干细胞刺激淋巴细胞增殖。提示所获细胞确为脂肪干细胞，且具有较弱的排斥反应，有可能成为细胞治疗或组织工程的同种异体细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 体外, 分化抗原, 细胞培养, 免疫学

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells have more broad application prospects than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering because of the characteristics such as easy to obtain, and thus become one of the research hotspots today.
OBJECTIVE: To observe the growth characteristics of human adipose derived stem cells and to test their stem cell features and immunology characters.
METHODS: The subcutaneous fat tissue were extracted from three healthy volunteers through liposuction, and then digested with collagenase type I followed by in vitro primary culture and passage culture. Then, the biological characteristics of passaged cells were observed. Surface antigens and human leukocyte antigens were detected by flow cytometry. And then, peripheral blood lymphocytes were cultured with allogeneic adipose-derived stem cells to observe whether adipose-derived stem cells can accelerate the proliferation of lymphocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: The harvested adipose-derived stem cells had a strong expansion in vitro with “S” shape growth curve. The third generation cells were positive for CD29, CD44, CD90 and human leukocyte antigen I, and negative for CD34, CD45, CD31 and human leukocyte antigen II. Besides, the lymphocytes had no response induced by allogeneic adipose-derived stem cells. The differentiation potential of adipose-derived stem
cells used in experiments was confirmed, and they had a weak rejection to the host, which indicates that the adipose-derived stem cells may be a candidate for cell treatment and tissue engineering.

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Key words: stem cells, lipectomy, subcutaneous fat, antigens, surface, histocompatibility antigens

中图分类号:

R394.2

依里牙尔•依里哈木，王云海，王理，高华，许新才，张文斌. 脂肪干细胞体外分离培养鉴定及免疫学性质[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2167-2172.

Eliyar Elham, Wang Yun-hai, Wang Li, Gao Hua, Xu Xin-cai, Zhang Wen-bin. Human adipose-derived stem cells: in vitro isolation, culture, identification and immunological properties[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2167-2172.

图/表（结果） 1

2.1 人脂肪干细胞的形态学观察将原代培养的脂肪干细胞在倒置显微镜下观察，接种后24 h可见50%细胞基本贴壁，形状为圆形或菱形，原代培养48 h，细胞开始克隆样增生，呈多角形或梭形，此时在培养皿中可见大量红细胞飘浮，用培养基每日清洗换液，到9 d可见细胞形态均一，细胞增殖能力活跃，细胞呈成簇分布，方向性好(图1A)。当细胞融合到85%-90%时，行细胞传代，传代后的脂肪干细胞生长良好，所培养的第3代人脂肪干细胞生长在含10%胎牛血清，含青、链霉素的DMEM-L培养基中，置于含体积分数5% CO₂的37 ℃培养箱中培养，细胞生长良好(图1B)。

2.2 人脂肪干细胞的生长曲线生长曲线呈典型的“S”形，前2 d的A值略有降低，可能与部分细胞死亡有关。从第3天开始，进入对数生长期，第7天达高峰；随后逐渐降低(图1C)。

2.3 人脂肪干细胞分化群表面抗原的表达应用流式细胞术检测脂肪干细胞分化群表面抗原表达的结果显示，本实验所用的第3代脂肪干细胞呈呈CD29、CD44、CD90阳性表达；同时呈CD31、CD45、CD34阴性表达，间接排除了造血系统和内皮细胞的污染(表1，图2A-F)。

2.4 人脂肪干细胞的组织相容性抗原表达人脂肪干细胞表面主要组织相容性抗原Ⅰ图2G，H：本实验所分离的脂肪干细胞表面主要组织相容性抗原Ⅰ分子表达呈阳性，而主要组织相容性抗原Ⅱ分子表达呈阴性。和主要组织相容性抗原Ⅱ分子进行检测的结果见

2.5 异体脂肪干细胞与淋巴细胞共培养培养6 d时，实验组和对照组的CPM值差异无显著性意义(表2)。说明异体脂肪干细胞与淋巴细胞共培养时，不刺激淋巴细胞增殖，再次证实了脂肪干细胞较弱的异体移植排斥反应。

参考文献

[1] Yagi H,Kitagawa Y. The role of mesenchymal stem cells in cancer development. Front Genet. 2013;4: 261.
[2] Sun S,Chen G,Xu M,et al. Differentiation and Migration of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted through the Spleen in Rats with Portal Hypertension. PLoS One. 2013; 8(12): e83523.
[3] Yang YM,Li H,Zhang L,et al. [A new method for isolating and culturing mouse bone marrow mesenchymal stem cells]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2013;21(6): 1563-1567.
[4] Zuk P A,Zhu M,Mizuno H,et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001;7(2): 211-228.
[5] Ong WK,Sugii S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 2013;45(6): 1083-1086.
[6] Zhou Z,Zhang M,Lu MJ.Application of adipose-derived stem cells in lower urinary tract reconstruction. Zhonghua Nan Ke Xue. 2013;19(4): 365-369.
[7] Ogawa R,Mizuno H,Watanabe A,et al. Osteogenic and chondrogenic differentiation by adipose-derived stem cells harvested from GFP transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 2004;313(4): 871-877.
[8] Yang P,Yin S,Cui L,et al. [Experiment of adipose derived stem cells induced into smooth muscle cells]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2008;22(4): 481-486.
[9] Choi YS,Matsuda K,Dusting GJ,et al. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 2010;31(8): 2236-2242.
[10] Fujimura J,Ogawa R,Mizuno H,et al. Neural differentiation of adipose-derived stem cells isolated from GFP transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 2005;333(1): 116-121.
[11] Liu H,Cheng B,Fu X. [Related issues in clinical translational application of adipose-derived stem cells]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2012;26(10): 1242-1246.
[12] Lakkis FG,Billiar TR. Molecular analysis of transplant rejection: marching onward. J Exp Med. 2013;210(11): 2147-2149.
[13] Ali JM,Bolton EM,Bradley JA,et al. Allorecognition pathways in transplant rejection and tolerance. Transplantation. 2013;96(8): 681-688.
[14] Ong WK,Tan CS,Chan KL,et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2014;2(2): 171-179.
[15] Nae S,Bordeianu I,Stancioiu AT,et al. Human adipose-derived stem cells: definition, isolation, tissue-engineering applications. Rom J Morphol Embryol. 2013;54(4): 919-924.
[16] 崔磊,尹烁,杨平,等. 脂肪干细胞HLA分子表达与体外抑制淋巴细胞增殖的实验研究[J]. 中华医学杂志,2005, 85(27): 1890-1894.
[17] Leatherman J. Stem cells supporting other stem cells. Front Genet. 2013;4: 257.
[18] Kraushaar DC,Zhao K. The Epigenomics of Embryonic Stem Cell Differentiation. Int J Biol Sci. 2013;9(10): 1134-1144.
[19] Biteau B,Hochmuth CE,Jasper H. Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity. Cell Stem Cell. 2011;9(5): 402-411.
[20] Mayani H. A glance into somatic stem cell biology: basic principles, new concepts, and clinical relevance. Arch Med Res. 2003;34(1): 3-15.
[21] Zanetti AS,Sabliov C,Gimble JM,et al. Human adipose-derived stem cells and three-dimensional scaffold constructs: a review of the biomaterials and models currently used for bone regeneration. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013;101(1): 187-199.
[22] Kaewsuwan S,Song SY,Kim JH,et al. Mimicking the functional niche of adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Expert Opin Biol Ther. 2012;12(12): 1575-1588.
[23] Mizuno H,Tobita M,Uysal AC. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 2012;30(5): 804-810.
[24] Markarian CF,Frey GZ,Silveira MD,et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnol Lett. 2013. [Epub ahead of print]
[25] Arana M,Mazo M,Aranda P,et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and characterization. Methods Mol Biol. 2013;1036: 47-61.
[26] Dubey A,Malik HN,Singhal DK,et al. 198 isolation, characterization, and in vitro differentiation of goat adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells into pancreatic islets-like cells. Reprod Fertil Dev. 2013;26(1): 213.
[27] Mischen BT,Follmar KE,Moyer KE,et al. Metabolic and functional characterization of human adipose-derived stem cells in tissue engineering. Plast Reconstr Surg. 2008; 122(3): 725-738.
[28] Roemeling-Van RM,Mensah FK,Korevaar SS,et al. Effects of Hypoxia on the Immunomodulatory Properties of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem cells. Front Immunol. 2013;4: 203.
[29] Lee RH,Kim B,Choi I,et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 2004; 14(4-6): 311-324.
[30] Dubey A,Malik HN,Singhal DK,et al. 198 isolation, characterization, and in vitro differentiation of goat adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells into pancreatic islets-like cells. Reprod Fertil Dev. 2013;26(1): 213.
[31] Malik HN,Dubey A,Singhal DK,et al. 204 isolation, characterization, and differentiation of adipose tissue derived mesenchymal stem cells: an autologous transplantation to patients. Reprod Fertil Dev. 2013;26(1): 216.
[32] Vieira NM,Brandalise V,Zucconi E,et al. Isolation, characterization, and differentiation potential of canine adipose-derived stem cells. Cell Transplant. 2010;19(3): 279-289.
[33] Caviggioli F,Vinci V,Salval A,et al. Human adipose-derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery. ANZ J Surg. 2009;79(11): 856.
[34] Huang SJ,Fu RH,Shyu WC,et al. Adipose-derived stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cell Transplant. 2013;22(4): 701-709.
[35] Lee MW,Choi J,Yang MS,et al. Mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cord blood. Biochem Biophys Res Commun. 2004;320(1): 273-278.
[36] Liundup AV,Medvedev I,Balasanova KV,et al. [Methods of tissue engineering of bone tissue in maxillofacial surgery]. Vestn Ross Akad Med Nauk. 2013;(5): 10-15.
[37] Zhang Q,Cheng B. Tendon-derived stem cells as a new cell source for tendon tissue engineering. Front Biosci (Landmark Ed). 2013;18: 756-764.
[38] Beeson W,Woods E,Agha R. Tissue engineering, regenerative medicine, and rejuvenation in 2010: the role of adipose-derived stem cells. Facial Plast Surg. 2011;27(4): 378-387.
[39] Sterodimas A,de Faria J,Nicaretta B,et al. Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs): current and future applications. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2010; 63(11): 1886-1892.
[40] Campbell P. Clinical relevance of human leukocyte antigen antibodies in liver, heart, lung and intestine transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 2013;18(4): 463-469.

引言

到目前为止，最具有成人干细胞多向潜能特征的是间充质干细胞^[1]。间充质干细胞是一种大多数成人器官中发现的具有骨形成能力和造血功能的细胞群体，可以从骨髓、脐血、脂肪中提取，在特定的培养条件下，间充质干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等^[2-3]。间充质干细胞是目前组织工程的主要种子细胞。经历了多年的研究后，虽然组织工程已经获得了很大进展，然而，由于间充质干细胞不易获取、体外扩增困难等限制，使其在临床的应用受到限制。因此，寻找一种易于获得、免疫原性低、易于体外扩增的种子细胞是目前组织工程迫切需要解决的问题之一。

2001年Zuk等^[4]从脂肪组织分离出一类具有多向分化潜能的干细胞，并在体外培养中成功地分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等，命名为脂肪来源的间充质细胞，即本文所说的脂肪干细胞。脂肪干细胞是同骨髓间充质干细胞一样起源于中胚层的成体干细胞，存在于脂肪组织基质中，同样具有增殖能力强、多向分化潜能^[5-6]。近年来大量的研究报道也证实脂肪干细胞可以向成骨细胞和软骨细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和神经细胞等分化^[7-10]。脂肪干细胞与间充质干细胞不但具有非常近似的生物学性质，而且在细胞表面标志谱的表达方面也十分接近，尽管脂肪干细胞发现的较晚，但是它的很多优点吸引了广泛的研究者的注意力。相比较而言，脂肪干细胞来源丰富，取材方便，细胞获取量大，具有多向分化的潜能，可成为组织工程理想的种子细胞来源之一^[11]。

然而，要想成为理想的组织工程种子细胞，仅仅具备上述优点还不够，还必须跨越移植排斥反应这一道门槛。移植排斥反应是指在同种异体组织、器官移植时，受者的免疫系统常对移植物产生排异反应(transplant rejection)，包括宿主抗移植物反应和移植物抗宿主反应^[12]。移植排斥反应是一个非常复杂的免疫学现象，具体机制涉及细胞和抗体介导的多种免疫损伤机制，都是针对同种异体组织中的主要组织相容性抗原的反应^[13]。供者与受者人类主要组织相容抗原的差异程度决定了排异反应的轻或重。因此，理想的组织工程种子细胞不仅仅要易于获取、来源丰富，还要具有较低的免疫原性，这样才能增加在临床应用中的成活率。

尽管近年来人们已经对脂肪干细胞的分离培养方法进行了研究，并初步探讨了其免疫学性质，但具体走进临床还有一定的差距。文章拟通过体外培养的办法筛选出脂肪干细胞，进一步研究脂肪干细胞的体外分离培养方法，并进行表面抗原的鉴定；在此基础上，进一步探讨其免疫学特性，为运用脂肪干细胞进行细胞治疗提供基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2012年6月至2013年2月在新疆医科大学第一附属医院胃肠外科完成。

材料：

脂肪组织及外周血来源：选取于新疆医科大学第一附属医院整形外科行抽脂的健康志愿者3名，年龄20-30岁，女性，取其脂肪组织及外周血。所有患者对治疗及试验方案知情同意并得到医院伦理学委员会批准。

脂肪干细胞体外分离培养鉴定及其免疫学性质实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
体积分数5%CO₂培养箱	美国NAPCO公司
吸光光度仪	Bio-Rad公司
流式细胞仪	美国Beckman Coulter公司
β液闪仪	300SL自动TDCR液闪计数仪，芬兰
体积分数10%等体积的胎牛血清、 LG-DMEM培养液、RPMI 1640基础培养液	Gibco，USA
鼠抗人CD29(FITC标)	BioSource Europe，Nivelles，Belgium
鼠抗人CD34(FITC标)	DAKO，Glostrup，Denmark
鼠抗人CD31(FITC标)、鼠抗人CD44(FITC标)、鼠抗人CD45(PE标)	Sigma Aldrich
鼠抗人CD90(FITC标)	Serotec，Oxford，UK
鼠抗人主要组织相容性抗原Ⅰ(PE标)、鼠抗人主要组织相容性抗原Ⅱ(FITC标)	Santa Cruz，USA
³H-胸腺嘧啶核苷	中国科学院上海核技术开发公司
Ⅰ型胶原酶	Sigma，美国

方法：

人脂肪干细胞的原代培养：方法参照文献[14-15]，并稍做改动。选取抽脂的健康志愿者3名，分别取其脂肪组织约30 g，放入无菌离心管，然后倒入无菌培养皿里，剔除筋膜及血管，无菌PBS冲洗3遍，眼科剪将组织剪成1.0- 2.0 mm³组织块，并将其剪成碎成糊状，以0.1%的Ⅰ型胶原酶37 ℃振荡(120 r/min)条件下消化60 min。以含体积分数10%体积胎牛血清的LG-DMEM培养液终止消化， 1 200×g离心10 min，获得高浓度间质组织细胞团，并以红细胞裂解液处理5 min，除去掺杂的红细胞，过直径100 μm的筛网除去未完全消化的组织。将获得细胞用生长培养液(LG-DMEM，体积分数10%胎牛血清，100 g/L链霉素，100 U/mL青霉素)重悬，以4×10⁴/cm²浓度接种于直径 100 mm的细胞培养皿中，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱里常规培养，隔日换液。当细胞生长至80%-90%融合时以1∶2的比例运用机械吹打法传代培养。本实验选用第3代脂肪干细胞进行检测和研究。

细胞生长动力学MTT比色法检测：取第3代处于对数生长期的细胞，消化, 制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×10⁷L^-¹。取96孔板，每板设5个复孔，1个对照孔，每孔100 μL；对照仅加培养基。然后，置恒温37 ℃、饱和湿度、体积分数5%的CO₂培养箱中培养，每72 h换液1次。每天同一时间取出96孔板，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，4 h后吸出孔内液体，加入三联液(体积分数为5%的异丁醇、0.012 mol/L盐酸、100 g/L十二烷基硫酸钠)10 μL，12 h后用570 nm，630 nm双波长测定各孔吸光度(A)值。

流式细胞术检测人脂肪干细胞分化群表面抗原和主要组织相容性抗原的表达：方法参照文献[14-15]，并稍做改动。以0.5%BSA-PBS溶液洗涤脂肪干细胞，1 000 r/min离心，每次5 min，共2次，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。分别加入荧光标记的鼠抗人CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、主要组织相容性抗原Ⅰ、主要组织相容性抗原Ⅱ单克隆抗体，一管加入荧光标记的非特异IgG作为同型对照，37 ℃孵育30 min。PBS洗3遍，40 g/L多聚甲醛固定，送流式细胞仪检测。

异体脂肪干细胞与淋巴细胞共培养：方法参照文献[16]，并稍做改动。取志愿者外周血10 mL，离心分离单个核细胞，然后加入细胞培养液：RPMI1640基础培养液，体积分数10%胎牛血清，25 mmol/L的HEPES，100 mg/L链霉素， 0 U/mL青霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺。计数后，以1×10³ L^-¹的细胞浓度接种96孔板，每个样本平行做3个复孔。然后，对照组每孔加入1×10⁵的自身脂肪干细胞，实验组每孔加入等量的异体脂肪干细胞，置恒温37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO₂培养箱中培养，共培养6 d。收获前16 h加入³H-胸腺嘧啶核苷，收集样本后，置于玻璃纤维滤纸上，烤干，然后用β液闪仪计数。以体外培养第2代真皮成纤维细胞为阴性对照，观察记录每分钟计数(CPM)值，以此表示增殖度。

主要观察指标：观察人脂肪干细胞体外增殖能力等生物学特性，通过流式细胞术检测人脂肪干细胞分化群表面抗原和主要组织相容性抗原的表达，并用异体脂肪干细胞和淋巴细胞共培养，观察其是否可以刺激后者增殖。

统计学分析：由本文作者运用SPSS 17.0软件进行数据分析。所有数据均以x(_)±s表示，2组数据间的比较用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

干细胞的分类有很多分法，常用的方法有两种，第一是根据干细胞的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞(somatic stem cell)^[17]。其中胚胎干细胞的发育等级较高，也叫作全能干细胞，具有增殖分化向全部组织和器官的能力，但其数量非常有限，且不易于获取^[18]。成体干细胞的发育等级较低，为多潜能或单能干细胞，具有特异性，可以在某些情况下迁移到受损的组织，经过细胞分裂产生子细胞，继续分化从而代替死去的细胞，修复受损组织^[19]。成体干细胞由于具备易于获取等优点而越来越受到人们的关注。目前能大量提取和扩增的成体干细胞主要在骨髓、脐带血、脂肪^[20]，其中脂肪干细胞又具有很多优点：①具有自我更新及多向分化的潜能。②来源充足。③对供区的创伤较小。④获得率及体外扩增速率高。脂肪干细胞是目前应用于组织工程领域中理想的种子细胞^[21-23]。

针对于脂肪干细胞的分离和孵育，不仅取决于良好的分离和孵育技术，还与脂肪干细胞的黏附与增殖能力有关，不同年龄人体的脂肪干细胞的分化数量与潜能均不相同^[24-26]。本实验选择健康青少年的脂肪细胞培养，保证了脂肪干细胞具有较强的增殖和分化能力。此外，为保持细胞活性和多向分化的潜能，对细胞的培养环境也有较高要求，有学者研究认为选择低糖型DMEM更能有利于维持脂肪干细胞的多分化潜能^[27]，而且在低氧环境下更能保证脂肪干细胞的免疫抑制作用^[28]。有研究发现低浓度种植更有利于脂肪干细胞的培养，因为可以避免细胞克隆间的相互作用^[29]。在本实验中首先用0.1%的Ⅰ型胶原酶在37 ℃摇床里消化60 min，细胞增殖分化能力良好。另外，本实验中通过换液的方法代替红细胞裂解液，用以去除培养皿上漂浮的红细胞，避免了红细胞裂解液对原代细胞的损伤作用。此外，在传代过程中，作者选择机械吹打法，其效果优于酶消化法，因为脂肪干细胞较为脆弱，酶消化法对细胞损伤较大。对于成功原代培养的细胞继续选用低糖型DMEM培养基，并将细胞维持在含有体积分数5%CO₂的37 ℃培育箱中，细胞状态生长良好。本实验还发现，脂肪干细胞的生长曲线呈“S”形，从培养的第3天开始进入指数生长期，第7天达峰，随后逐渐降低。脂肪干细胞的成功分离培养为其后续研究和在临床的应用提供了坚实的基础。

目前脂肪干细胞主要通过形态学、细胞表面标记、功能等几种方法进行鉴定，传至第3代的脂肪干细胞多呈长梭行，按一定方向排列^[30-31]，本实验结果从外观上符合脂肪干细胞。随着分子生物学技术的发展，对细胞表面标记的认识越发详尽，但是各文献对其表型的描述仍缺乏统一性^[32-33]。但对于脂肪干细胞与上皮细胞、内皮细胞、肌细胞有共同的表面标记，而不表达典型的造血干/祖细胞标志，即CD45、CD34及CD14这一观点上取得了一致^[32-33]。常用的标记物为CD13、CD29、CD34、CD44、CD54、CD166、CDT1、SH2、SH3、STRO-1^[34]。本实验选择CD29、CD34、CD45、CD44、CD90进行鉴定。实验将成功分离并孵育的第3代脂肪干细胞进行流式细胞术检测，结果显示脂肪干细胞的CD29、CD44、CD90阳性表达，同时，实验所用脂肪干细胞的CD34、CD45与CD31阴性表达，排除了造血系和内皮细胞的污染，这与此前研究的结果相同^[35]。因此可以判断作者这次实验提取的细胞为脂肪干细胞。

在进行细胞治疗和组织工程研究时，一个需要克服的难关是排斥反应^[36-37]。这是限制细胞治疗和组织工程发展最大的屏障。因此，寻求具有治疗价值而排斥反应又低的组织工程材料是迫切需要解决的问题。在以往的研究中，虽然胚胎干细胞、间充质干细胞等具有巨大的潜在治疗价值，但排斥反应的存在限制了在临床的广泛应用。脂肪干细胞的发现使人们看到了异体移植的新希望^[38-39]。主要组织相容性抗原分子是提呈抗原的主要分子，其中主要组织相容性抗原Ⅰ主要负责提呈内源性抗原，而主要组织相容性抗原Ⅱ主要负责提呈外源性抗原^[40]。这使得主要组织相容性抗原Ⅱ成为介导异体移植排斥反应的主要分子之一。本实验发现，脂肪干细胞表面主要组织相容性抗原Ⅰ表达呈阳性，而主要组织相容性抗原Ⅱ表达呈阴性，提示脂肪干细胞具有较弱的脂肪干细胞异体移植排斥反应。进一步研究发现，异体脂肪干细胞与淋巴细胞共培养时，不刺激淋巴细胞增殖，再次证实了脂肪干细胞较弱的异体移植排斥反应。这些研究表明，相对于其他类型的干细胞，脂肪干细胞可能是更为理想的细胞治疗和组织工程材料。

脂肪干细胞体外分离培养鉴定及免疫学性质

Human adipose-derived stem cells: in vitro isolation, culture, identification and immunological properties

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.