不同保存介质对脐带间充质干细胞活性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (14): 2153-2158.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.14.004

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不同保存介质对脐带间充质干细胞活性的影响

周楠¹，陈彦²，雷鑫¹，董艳婷¹，徐文婧¹，牛玉虎¹，牛勃³，程牛亮¹

1山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001；2山西医科大学第二附属医院呼吸科，山西省太原市 030001；3首都儿科研究所生物技术研究室，北京市 100020

收稿日期:2014-01-26 出版日期:2014-04-02 发布日期:2014-04-02
通讯作者: 第一通讯作者：程牛亮，教授，博士生导师，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001 第二通讯作者：牛勃，博士，博士生导师，首都儿科研究所生物技术研究室，北京市 100020
作者简介:周楠，女，1988年生，汉族，重庆市人，山西医科大学在读硕士，主要从事干细胞与生物诊疗的研究。

Effects of different storage solutions on the viability of umbilical cord mesenchymal stem cells

Zhou Nan¹, Chen Yan², Lei Xin¹, Dong Yan-ting¹, Xu Wen-jing¹, Niu Yu-hu¹, Niu Bo³, Cheng Niu-liang¹

1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Respiratory Medicine, Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 3Department of Biotechnology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China

Received:2014-01-26 Online:2014-04-02 Published:2014-04-02
Contact: Corresponding author: Cheng Niu-liang, Professor, Doctoral supervisor, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China Corresponding author: Niu Bo, M.D., Doctoral supervisor, Department of Biotechnology, Capital Institute of Pediatrics, Beijing 100020, China
About author:Zhou Nan, Studying for master’s degree, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：脐带间充质干细胞的临床应用面临移植前保存的问题，而临床保存介质对移植前细胞活性的影响直接关乎移植后疗效，目前却缺乏对临床介质保存效果的系统性研究。
目的：评价临床常用保存介质对脐带间充质干细胞活性的影响。
方法：在4 ℃与室温(25 ℃)条件下，将脐带间充质干细胞在临床常用保存液(0.9%氯化钠注射液，5%葡萄糖注射液和1%人血白蛋白溶液)中保存2，4，6 h，观察上述保存介质对脐带间充质干细胞活性、凋亡/死亡率、多向分化能力及DNA损伤的影响。
结果与结论：无论在4 ℃还是室温条件下，细胞在临床常用保存介质中的活性均在短期内呈时间依赖性下降。此外，不同保存介质引起细胞死亡而非凋亡，且死亡率呈时间依赖性增加；经不同介质保存后，细胞出现DNA损伤，但其增殖与多向分化能力未受明显影响，提示细胞核DNA损伤为细胞活性下降的关键因素。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 间充质干细胞, 脐带间充质干细胞, 细胞移植, 保存介质, 保存温度, 保存时间, 细胞活性, 细胞凋亡, DNA损伤

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord-mesenchymal stem cells (UC-MSCs) have been widely studied in clinics. Notably, UC-MSCs have to be properly preserved before clinical use and the effects of storage solution on viability of cells play critical roles in the effectiveness of cell-transplantation. However, there are few studies concerning this phenomenon.
OBJECTIVE: To evaluate the effects of various clinical common solutions on the activity of UC-MSCs.
METHODS: UC-MSCs were stored at 0.9% sodium chloride injection, 5% glucose injection and 1% human serum albumin respectively at 4 ℃ and room temperature (25 ℃) for 2, 4 or 6 hours. Viabilities, apoptosis/necrosis rate, multi-differentiation ability of preserved UC-MSCs and DNA damage were examined.
RESULTS AND CONCLUSION: The viabilities of UC-MSCs were rapidly decreased time-dependently in all of the storage solutions both at 4 ℃ and room temperature. Besides, the storage solutions resulted in cellular necrosis rather than apoptosis and the necrosis rate was greatly increased time-dependently. DNA damage was observed in cells after preserved in various storage solutions, but cell proliferation and differentiation were not affected, which demonstrated that DNA damage may be a key factor for the reduction of cell viabilities.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, umbilical cord, stem cell transplantation, preservation, biological

中图分类号:

R394.2

周楠，陈彦，雷鑫，董艳婷，徐文婧，牛玉虎，牛勃，程牛亮 . 不同保存介质对脐带间充质干细胞活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(14): 2153-2158.

Zhou Nan, Chen Yan, Lei Xin, Dong Yan-ting, Xu Wen-jing, Niu Yu-hu, Niu Bo, Cheng Niu-liang . Effects of different storage solutions on the viability of umbilical cord mesenchymal stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(14): 2153-2158.

图/表（结果） 5

2.1 人脐带间充质干细胞形态学观察结果倒置显微镜下观察，改良酶消化法分离脐带间充质干细胞培养12 h即见散在的长梭形贴壁细胞。原代脐带间充质干细胞融合率达80%-90%后传代培养，细胞形态趋于一致，呈鱼群样或漩涡状生长，贴壁紧密(图1A)。

2.2 人脐带间充质干细胞表面标记检测结果流式细胞仪免疫表型鉴定结果显示(图2)，分离培养的脐带间充质干细胞第3代细胞高表达基质细胞与干细胞标记CD29、CD 44与CD105，阳性率不低于95%；低表达内皮与造血干细胞标记CD34与CD45，阳性率不高于2%。

2.3 人脐带间充质干细胞多向分化能力第3代脐带间充质干细胞在成骨细胞诱导培养基中培养23 d后，经茜素红S染色，胞浆中可见大量玫瑰红色钙结节形成(图1B)；在成脂细胞诱导培养基中培养16 d后，经油红O染色呈阳性，胞浆内可见红色脂滴形成(图1C)。

2.4 不同保存介质在不同温度及不同时间点对脐带间充质干细胞活性的影响将消化获得的脐带间充质干细胞重悬于完全培养基、生理盐水、5%葡萄糖和生理盐水+1%人血白蛋白，在4 ℃或25 ℃条件下，各组细胞活性均呈时间依赖性下降，较对照组相比，两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。4 ℃条件下保存6 h，除对照组外仅生理盐水组可保持80%的细胞活性；室温组(25 ℃)保存6 h后，各组细胞活性均低于80%，远达不到临床应用的保存效果(图3)。

2.5 不同保存介质对脐带间充质干细胞多向分化能力的影响在4 ℃和25 ℃条件下，第3代脐带间充质干细胞经不同介质保存6 h后，各组仍可贴壁的细胞依旧存在向成骨细胞和成脂细胞方向分化的能力(图4)。

2.6 不同保存介质在不同温度及不同时间点对脐带间充质干细胞凋亡/死亡率的影响在4 ℃与25 ℃条件下保存6 h后，不同保存介质主要引起细胞不同程度的坏死而非凋亡(图5A，B)。各组间死亡率也呈时间依赖性，随时间延长死亡率增加，与对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05，图5C，D)，进一步验证了不同保存介质对脐带间充质干细胞活性的影响。

2.7 不同保存介质在不同温度条件下对脐带间充质干细胞 DNA损伤的影响对照组脐带间充质干细胞在4 ℃和25 ℃条件下保存6 h后细胞核均未出现明显拖尾现象，电泳后核DNA依然停留在核基质中，呈完整的圆形荧光团；其余各组细胞核DNA解旋，电泳时发生迁移，呈现不同程度的拖尾现象(图6)。数据分析结果显示各实验组拖尾细胞比例、彗尾长度及尾矩均高于对照组，且差异有显著性意义(P < 0.05，表1)。

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引言

间充质干细胞是一类具有强大的自我更新能力和典型的多向分化潜能的成体干细胞。间充质干细胞发源于早期中胚层和外胚层，在体内外特定的诱导条件下，可分化为内胚层的肝细胞和胰腺细胞，外胚层的神经细胞以及成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞等多种组织细胞，且间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后多向分化能力仍存在^[1-2]。

间充质干细胞具有低免疫原性和较低的抗原提呈能力，不表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子，Fas配体和共刺激分子B7-1、B7-2，低水平表达主要组织相容性复合体I类分子，能更大限度的耐受HLA配型不符，在免疫调节中具有独特的双向调控作用，使其在急性移植物抗宿病^[3]、自身免疫性疾病、心血管系统疾病^[4]、神经退行性疾病等中具有极大的临床应用前景^[5]。

间充质干细胞广泛分布于人体的各种组织，从骨髓、外周血、脐血、脐带、羊水、肌腱、骨膜、脂肪、胎肺和胎肾等多种组织中均可以培养获得^[6-8]。自1966年Fridenshte?n等^[9]首先从骨髓中发现间充质干细胞以来，骨髓间充质干细胞的研究最为深入广泛，但因其采集过程具有侵入性，感染概率增加，并且随着供者年龄的增长间充质干细胞数量明显减少以及供者个体差异等原因^[10]，局限性越发凸显。

当前，脐带来源的间充质干细胞日益成为间充质干细胞的热点来源。新生儿脐带属医疗废弃物，采集容易，对供者无损伤，不涉及伦理问题。脐带中干细胞含量极其丰富^[11]，具有更低的免疫原性，体外培养时扩增能力更强，因而成为替代骨髓来源间充质干细胞的理想选择。大量的临床前试验和少许临床试验已证明，脐带间充质干细胞在治疗肝脏疾病、心脏疾病、糖尿病及皮肤修复与再生方面展现了良好的治疗效果。

然而在临床移植脐带间充质干细胞时，为达到理想的治疗效果，实验的重点在于移植细胞的数量、移植时机及给入途径等环节，而未重视移植前保存这一基础环节。事实上，脐带间充质干细胞需在严格的GMP实验室处理后才可进入临床移植，并不能实现即时输注，过渡期间不可避免的需采用可被临床输注的介质进行短期保存。当细胞脱离适宜的培养环境进入保存介质，新的环境必然使细胞产生适应性变化，因此保存介质与细胞质量密切相关，而细胞质量直接决定移植后疗效，但目前关于此类保存效果的系统性研究却罕见报道。

针对上述提出的脐带间充质干细胞临床移植前保存问题，实验以临床常用的保存输注液(0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液、1%人血白蛋白溶液^[12-13])作为脐带间充质干细胞移植前的保存介质，观察其对脐带间充质干细胞活性的影响，并初步探究其影响机制，为移植前最大限度的维持细胞活性提供科学基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外对照实验。

时间及地点：实验于2011年11月至2013年5月在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室完成。

材料：脐带均来源于健康足月剖宫产新生儿，由山西医科大学第二医院妇产科提供，标本采集均获得孕妇及其家属知情同意。

不同保存介质对脐带间充质干细胞活性影响实验主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
α-MEM培养基干粉	美国Gibco公司
胎牛血清	美国Hyclone公司
胰蛋白酶干粉、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅲ、透明质酸酶、DNA酶、低熔点琼脂糖凝胶	美国Sigma公司
鼠抗人CD34-ECD、CD45-PC5、CD29-PE、CD44-PE、CD105-PE，同型对照Ig G-ECD、 IgG-PC5、Ig G-PE	美国Beckman Coulter公司
人脐带间充质干细胞成骨、成脂诱导分化培养基	赛业(广州)生物科技有限公司
0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液	Baxter
20%人血白蛋白溶液	四川成都蓉生药业有限公司
Annexin V-FITC试剂盒	美国Biovision公司
IX70荧光倒置显微镜	日本Olympus公司
流式细胞仪	美国Beckman Coulter公司

实验方法：

人脐带间充质干细胞的分离与培养：无菌条件下取健康足月剖宫产新生儿近胎儿段脐带15 cm，于6 h内处理，剔除动静脉，剪碎至约1 mm ×1 mm ×1 mm大小，用PBS充分洗涤，分装入15 mL离心管中。每管加入0.2%Ⅰ型胶原酶、0.2% Ⅲ型胶原酶、0.1%透明质酸酶于37 ℃恒温摇箱震荡孵育3 h后，加入0.1%胰蛋白酶、DNA酶(15 U/mL)37 ℃震荡孵育30 min。加入PBS，滴管反复吹打，充分离散细胞；1 500 r/min，离心10 min，保留较黏稠液体部分；PBS洗涤2次，方法同前；完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、200 mg/L青霉素、 200 mg/L链霉素的α-MEM培养基)重悬收获的细胞沉淀，接种到T-25 cm²细胞培养瓶中，于37 ℃、体积分数5% CO₂细胞培养箱中培养，定期换液。当细胞融合达80%时进行传代接种。

人脐带间充质干细胞表面标志鉴定：取第3代生长状态良好的脐带间充质干细胞，胰酶消化后，制成5×10⁵单细胞悬液，经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD105、CD29、CD44、CD34和CD45的表达情况。

人脐带间充质干细胞多向分化能力测定：第3代脐带间充质干细胞和经不同保存介质在不同温度下保存6 h后的脐带间充质干细胞，以3×10⁴/孔接种于6孔板中，以成骨诱导和成脂诱导培养基培养；成骨诱导经茜素红S染色观察钙结节形成，成脂诱导经油红O染色观察脂滴形成。

人脐带间充质干细胞的分组处理：取第3代脐带间充质干细胞，以0.9%氯化钠注射液(生理盐水组)、5%葡萄糖注射液(葡萄糖组)与1%人血白蛋白溶液(1%人血白蛋白组)为保存介质制备单细胞悬液。在4 ℃和25 ℃条件下各组细胞分别孵育2，4和6 h后，进行相关测定。

细胞活性的的测定(贴壁实验)：使用不同保存介质将消化所得的第3代脐带间充质干细胞重悬，以2×10⁶/组保存于相应温度；保存时间结束后，完全培养基洗涤并重悬细胞，每组以1×10⁴/孔接种于24孔板；37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱内孵育24 h；40 g/L多聚甲醛固定20 min，结晶紫染液100 μL染色15 min，PBS洗涤，倒置显微镜下计数。

细胞贴壁率=已贴壁细胞总数/接种细胞数×100%

细胞凋亡/死亡率测定：经不同保存介质在相应温度相应时间点保存后的细胞1 000 r/min离心5 min，弃上清，每组样品取5×10⁵细胞，向其中加入500 μL binding buffer、5 μL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的Annexin V(Annexin V-FITC)与5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀；4 ℃避光反应5 min；流式细胞仪上机检测，第1象限(Annexin V^-与碘化丙啶^-)：正常细胞；第2象限(Annexin V⁺与碘化丙啶^-)：早期凋亡细胞；第3象限(Annexin V^-与碘化丙啶⁺)，第4象限(Annexin V⁺与碘化丙啶⁺)：晚期凋亡细胞与坏死细胞。

细胞DNA损伤分析：使用不同保存介质将保存6 h后的各组脐带间充质干细胞制成细胞悬液；100 μL 0.8%正常熔点琼脂糖为第1层胶，75 μL细胞悬液与0.8%低熔点琼脂糖凝胶1∶3混合液为第2层胶，0.8%低熔点琼脂糖为第3层胶；将玻片浸入细胞裂解液4 ℃下1 h；取出载玻片，置于水平电泳槽中，浸没于电泳缓冲液，静置20 min； 300 mA，25 V，4 ℃下电泳20 min；电泳完毕后，中和液滴洗；20 mg/L Goldviewnal I型核酸染料避光染色，荧光显微镜下观察，采用CASP彗星图像分析软件测定尾长(TL)和尾矩。

主要观察指标：①人脐带间充质干细胞的细胞形态和表面标记。②人脐带间充质干细胞的多向分化能力。③细胞活性。④细胞凋亡/死亡率。⑤细胞DNA损伤情况。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 17.0软件包进行实验数据的统计分析，数据均以x(_)±s表示。采用独立样本t 检验进行两组均数间的比较，多组均数间比较采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

脐带间充质干细胞具有强大的扩增能力，可合成多种细胞因子^[14]，且取材容易，无伦理争议，因此，逐渐成为间充质干细胞细胞治疗的新兴来源。本研究中所分离培养的脐带间充质干细胞，经形态学观察、表面标志鉴定及多向分化能力测定三方面综合证实，所培养细胞符合国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)标准。

目前，关于间充质干细胞治疗的研究已有大量报道，但采用何种溶液作为间充质干细胞移植治疗前的保存介质却无统一标准。以往研究中，虽采用生理盐水^[15]、PBS^[16]、M199^[17]和1%人血白蛋白溶液等作为间充质干细胞保存输注液^[18]，但均未在细胞保存适用性方面做系统评估，而细胞活性直接影响移植入体内的细胞作用的发挥，这也是间充质干细胞临床治疗效果不同的原因之一。此外，移植等待时常将细胞置于4 ℃条件下以降低代谢，而移植过程则通常在室温条件下进行。因此，本实验同时在4 ℃与25 ℃条件下评价生理盐水、5%葡萄糖与1%人血白蛋白3种保存介质对保存过程中脐带间充质干细胞活性的影响。

反映细胞活性的指标不仅需反映细胞的生理状态更需反映细胞功能，脐带间充质干细胞是一种贴壁细胞，黏附能力下降可直接影响移植后疗效^[19]，已有研究证明贴壁实验是检测细胞活性方法中最为精准的^[20]，因此在本实验中通过观察细胞贴壁率来评价脐带间充质干细胞保存后活性。由于重新接种的细胞在初始24 h内需适应环境而导致生长停滞^[21]，因此实验选择细胞重新接种 24 h作为观察贴壁情况的时间点。结果显示，无论在4 ℃还是室温(25 ℃)条件下，保存于上述介质中的细胞活性均在短时间内显著下降，且呈时间依赖性下降，与报道结果一致^[22-23]；室温条件下相较于4℃保存后细胞贴壁率更低。此外，细胞凋亡/死亡率的测定进一步验证了不同保存介质对细胞活性的影响，由流式结果显示不同保存介质主要引起细胞死亡而非凋亡，且死亡率呈时间依赖性增加，与上述结果一致。Lane等^[24]提出满足临床应用要求的保存后细胞活性至少应达到80%，但在本实验中仅生理盐水组在4 ℃下保存6 h后细胞活性在80%以上，其余各组均未达到要求。生理盐水、5%葡萄糖显著影响细胞活性的原因可能与pH偏低(pH值分别为4.5-7.0，3.2-5.5)、营养成分及必要的生长因子缺乏有关。Pal等^[25]报道骨髓间充质干细胞短期最佳保存溶液为5%葡萄糖，但本实验中5%葡萄糖较生理盐水保存效果差，与报道结果不一致，则可能与其糖浓度远高于培养环境(1 000 mg/L)造成糖毒性有关^[26-28]。经生理盐水稀释含1%人血白蛋白的溶液虽可为细胞提供营养物质，并在一定范围内纠正pH值，但结果发现，脐带间充质干细胞活性在该介质中保存效果更差，可能与人血白蛋白制备过程中的残留物质对脐带间充质干细胞有损伤作用有关^[29]。

脐带间充质干细胞具有典型的多向分化潜能，且多向分化被认为是最有用的鉴定^[30]，本实验结果显示，经不同介质保存脐带间充质干细胞6 h后多向分化能力未受到显著影响，故而，作者对不同保存介质对脐带间充质干细胞活性影响的机制进行初步探索。DNA结构的完整性是细胞具备多种生物学功能的基础。彗星实验(comet assay)是在单细胞水平上检测DNA损伤较为敏感的一种方法^[31]。本实验中，脐带间充质干细胞经不同保存介质在不同温度下保存6 h后，拖尾细胞比例、彗尾长度及彗尾DNA含量较对照组明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示DNA损伤是影响细胞活性的重要因素之一。

综上所述，脐带间充质干细胞保存于临床常用保存介质(生理盐水、5%葡萄糖、1%人血白蛋白)短期内细胞活性呈时间依赖性下降，室温条件下较4℃保存效果更差，达不到临床应用的最低活性要求。尽管增殖能力与多向分化能力仍存在，但细胞核DNA损伤，考虑其为细胞活性下降的关键因素。因此，应继续探寻最适保存介质，并深入研究其影响机制，取得脐带间充质干细胞最大的移植保存效果。

不同保存介质对脐带间充质干细胞活性的影响

Effects of different storage solutions on the viability of umbilical cord mesenchymal stem cells

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