人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中自噬相关基因Beclin-1的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (6): 841-846.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.004

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人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中自噬相关基因Beclin-1的表达

杨翼，丁文静，董万利

苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215006

修回日期:2014-01-10 出版日期:2014-02-05 发布日期:2014-02-05
通讯作者: 董万利，博士，教授，主任医师，硕士生导师，苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215006
作者简介:杨翼，女，1987年生，福建省福州市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事干细胞方面的研究。共同第一作者：丁文静，苏州大学在读硕士。
基金资助:
江苏省自然科学基金项目资助(SBK201123617)

Autophagy-related gene Beclin-1 expression in neuron-like differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells

Yang Yi, Ding Wen-jing, Dong Wan-li

The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Revised:2014-01-10 Online:2014-02-05 Published:2014-02-05
Contact: Dong Wan-li, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Yang Yi, Studying for master’s degree, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Ding Wen-jing, Studying for master’s degree, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Yang Yi and Ding Wen-jing contributed equally to this paper.
Supported by:
the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. SBK201123617

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，但是经过长期体外培养后，骨髓间充质干细胞增殖分化能力逐渐丧失，其机制仍不明确。

目的：观察人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化过程中自噬相关基因表达的变化。

方法：利用表皮生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，观察其形态变化及生长情况。免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白表达，采用Western blot检测诱导前后人骨髓间充质干细胞自噬相关基因Beclin-1表达的变化。

结果与结论：经诱导后，人骨髓间充质干细胞呈典型神经元样细胞分化，神经元特异性烯醇化酶阳性率为78.7%，胶质纤维酸性蛋白阳性率为8.1%。诱导0.5 h后处理组细胞中Beclin-1的表达水平有所增加，但1 h后开始逐渐降低。说明体外可以诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，自噬相关基因表达活性在诱导分化早期呈高表达，分化过程中逐渐降低。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 人骨髓间充质干细胞, 神经元样细胞分化, 体外实验, 表皮生长因子, 自噬, Beclin-1, 江苏省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have potential to self-renewal and multi-lineage differentiation. But after a long period of culture in vitro, the proliferation and differentiation capacities of bone marrow mesenchymal stem cells gradually loss, the mechanism underlying which is not clear now.

OBJECTIVE: To observe the expression of autophagy-related gene Beclin-1 in differentiation from human bone marrow mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro.

METHODS: The changes of morphological characteristics of neuron-like cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells induced by epidermal growth factor were observed. The expression of neuron-specific enolase and glial fibrillary acidic protein in treated and untreated human bone marrow mesenchymal stem cells were detected using immunocytochemistry. The Beclin-1 protein expressions were detected by western blot before and after induction.

RESULTS AND CONCLUSION: After being induced, human bone marrow mesenchymal stem cells presented classical neuron-like morphology; the expressions of neuron-specific enolase and glial fibrillary acidic protein were 78.7% and 8.1%, respectively. The expression of Beclin-1 protein was changed correspondingly during the induction, which increased after 30 minutes of induction and decreased gradually after 1 hour of induction. Human bone marrow mesenchymal stem cells could be induced into neuron-like cells in vitro by epidermal growth factor. Autophagy-related gene was highly expressed in the induction of early differentiation and the expression gradually reduced until it remained at a low level during the differentiation.

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Key words: autophagy, cell differentiation, mesenchymal stem cells, glial fibrillary acidic protein, neurons

中图分类号:

R394.2

杨翼，丁文静，董万利. 人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中自噬相关基因Beclin-1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(6): 841-846.

Yang Yi, Ding Wen-jing, Dong Wan-li. Autophagy-related gene Beclin-1 expression in neuron-like differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(6): 841-846.

图/表（结果） 2

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引言

随着对干细胞相关研究的不断深入，人们寄希望于可以诱导干细胞体内或体外分化为神经元样细胞，移植替代已经损伤的神经元。其中的骨髓间充质干细胞是一种较好的干细胞来源，它易于获得，扩增迅速，伦理学争议较小，可自体移植，同时还具有较强的多向分化和自我更新潜能^[1-3]，目前已被证实可以被定向诱导来进行神经元样细胞分化，目前研究主要利用各种细胞因子及与某些特定组织或细胞共培养等方法进行诱导^[4-5]。但是在经长期的体外诱导及传代培养后，骨髓间充质干细胞的增殖分化潜在能力会逐渐消失，其原因还不明确。

自噬是一种细胞自身的应激调控机制。在分化增殖中，细胞可以通过自噬和溶酶体，消除、降解和消化受损、变性、衰老而失去功能细胞器和生物大分子，为细胞的重建和修复提供原料，实现细胞自身的再循环和再利用^[6]。因此相对于凋亡，即程序性细胞死亡而言，自噬更多被认为是程序性细胞存活。和普通细胞相比，自噬对于干细胞尤为重要，与干细胞自我更新及进一步分化密切相关^[7-8]。一定程度的自噬能力不单在一定程度上反映了骨髓间充质干细胞的增殖能力和相关移植的安全性，使其不至于无限增殖，即肿瘤化，同时也是骨髓间充质干细胞维持不断增殖的潜在能力的必要条件^[9-10]。经典自噬过程包括以下5个部分^[11-14]：①自噬诱导阶段。②成核阶段。细胞器的双层膜结构在待降解物质周围包绕形成分隔膜。③延长阶段。分隔膜继续弯曲延长，并完全包绕细胞质，形成完整的双层膜结构的自噬体。④自噬体与胞内体融合形成自噬内涵体，然后再与溶酶体融合，形成自噬溶酶体；或者自噬体直接与溶酶体融合形成自噬溶酶体^[15-16]。⑤自噬溶酶体所包裹的物质及自噬体的内膜降解再利用^[17]。

Beclin-1也称BECN1基因，是目前惟一被证实的哺乳动物“自噬基因”，也是自噬的直接执行者, 主要通过诱导自噬来促进凋亡。1998年Liang等^[18]首先在致死性Sinbis病毒性脑炎大鼠中发现。Aita等^[19]发现编码该蛋白的基因Beclin-1位于人染色17q21，并成功克隆了Beclin-1基因，该基因完整的cDNA序列编码2 098 bp的转录序列，5UTR 120 bp，编码区1 353 bp，3UTR 625 bp，与酵母的自噬基因apg6/vps30有高度的同源性。大量研究表明Beclin-1不仅参与自噬体的形成，还可通过调节自噬活性对肿瘤发生、发展起着重要作用。Beclin-1基因主要通过与Ⅲ型PI3K形成复合体来调节其他的ATG蛋白在自噬前体结构中定位，调节自噬活性^[20-21]。在哺乳动物细胞中刺激Beclin-1的表达能够促使自噬的发生^[18]。有研究认为Beclin-1是与凋亡抑制因子Bcl-2相结合而发生作用的，其与Bcl-2蛋白相结合可以抑制细胞的自噬，并能减少中枢神经系统的凋亡^[22]。Beclin-1仅出现于自噬的有关步骤中，但并不参与自噬泡生成的全程，因此可以认为Beclin-1是一个自噬的调节蛋白而不是必须蛋白^[19,23-24]。大量研究表明Beclin-1不仅参与自噬体的形成，还可通过调节自噬活性对肿瘤发生、发展起着重要作用^[19,25-28]。作者选择较为成熟的表皮生长因子诱导法体外诱导人骨髓间充质干细胞^[29]，观察神经元样细胞定向分化过程中自噬相关基因表达的变化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年3至8月在苏州大学附属第一医院完成。

材料：

细胞：骨髓细胞来自骨穿检测无恶性造血系统疾病的患者，且事先征得患者同意。

方法：

细胞的提取和原代培养：在患者知情条件下抽取骨髓，以肝素抗凝，以Ficoll-Paque密度梯度离心法(无菌通风柜内操作)来获得人单个核细胞，倒置显微镜下进行细胞计数后以1.0×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于6孔板，72 h换液1次并去除未贴壁细胞，直到贴壁细胞的融合率大于80%时传代培养，传代比例为1∶2。

细胞的神经定向诱导分化：传代培养至细胞状态稳定后，胰酶消化后收集生长状态较好的细胞，按1.0×10⁸ L^-¹的浓度接种到预铺多聚赖氨酸的玻片上(6孔板内)。等到细胞融合率大于50%时，开始诱导神经元样分化的进行。采用含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基进行预诱导24 h后，使用含20 μg/L 上皮生长因子的无血清L-DMEM培养基来孵育处理组 24 h。对照组只用含有体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基孵育24 h进行空白对照。全过程观察均使用倒置显微镜。

免疫组织化学检测人骨髓间充质干细胞的神经定向诱导的效果：采用SP法，对诱导后细胞进行免疫组化检测。分别收集2组诱导后4 h的人骨髓间充质干细胞，用40 g/L多聚甲醛固定30 min后再以体积分数3%的过氧化氢封闭，约10 min后，加入山羊血清二次封闭，再过10 min，分别加入1∶200的兔抗人胶质纤维酸性蛋白抗体及兔抗人神经元特异性烯醇化酶抗体后，4 ℃环境下孵育过夜。次日继续加入以生物素标记二抗后于室温下摇床孵育10 min，再加入链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液孵育，DAB显色及苏木精染核，倒置显微镜(×100)下随机取10个非重叠视野，计算神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的比例，取平均值。

Western blot检测诱导细胞中Beclin-1的表达：分别收集2组诱导分化前，诱导后0.5，1，4 h的人骨髓间充质干细胞1.0×10⁶个，加入1U RIPA缓冲液裂解细胞，采用考马斯亮蓝法来进行蛋白定量，之后进行常规电泳，转膜，并使用牛奶封闭后加入Beclin-1抗体(1∶1 000)，在4 ℃环境下孵育过夜，次日使用辣根过氧化物酶标记标记二抗(1∶1 500)，摇床上室温孵育2 h后，漂洗膜1 h，加化学发光剂，暗室胶片曝光显影。以β-actin作为内参。

主要观察指标：细胞培养观察形态变化，免疫组化法观测实验细胞中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶致表达情况，Western blot检测诱导细胞中Beclin-1的表达趋势。

统计学分析：数据分析应用SPSS 13.0软件。计量资料表示采用均数。

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讨论

自噬现象作为一种高度保守的细胞行为，与细胞的生长、增殖、分化、以至肿瘤的发生过程关系密切。其主要参与细胞内大分子物质的循环及再利用、受损细胞器的清除、在维护细胞内环境稳态方面起重要作用。在成人间充质干细胞分化过程中，基础自噬水平下降^[30]。自噬有利于细胞质的快速回收^[31]，同时近期发现了自噬的一种新功能：促进细胞器生物合成^[32]，这与细胞的增殖及分化更加息息相关。血液系统造血干细胞在营养物质匮乏，代谢应激之时，自噬被证明是保护自身的一种机制^[9]。当细胞缺乏营养之时，组织中的干细胞面临着生死选择。或是通过凋亡性细胞死亡自杀，或是通过自噬来保存自身。细胞借助自噬重新利用受损或不必要的蛋白质及细胞器，作为基本成分支持细胞生长。人们将自噬视作是老化中一个重要作用因子。在新鲜分离的年轻造血干细胞中少有或是没有自噬发生，而当细胞在体内外暴露于代谢压力下时，则会快速诱导这一过程^[9]。并且，当在这样的代谢压力过程中抑制自噬时，年轻造血干细胞会通过凋亡快速死亡，表明自噬对于它们存活至关重要^[9^，^33-34]。在大脑、肝脏和心脏等组织中，自噬缺失会导致神经退行性疾病、代谢综合征和心功能不全等多种年龄相关疾病^[35-36]。由此可见，过多过少的自噬都可影响细胞的生存状况，而适度的自噬是骨髓间充质干细胞维持增殖能力的必要条件之一。在人骨髓间充质干细胞神经元样分化过程中，与其退变的机制有关，可反映骨髓间充质干细胞的增殖分化能力和移植的安全性。

研究骨髓间充质干细胞诱导下神经元样分化的过程，进一步提高分化效率，对于干细胞移植走向临床实际应用具有重要意义。表皮生长因子来诱导人骨髓间充质干细胞分化，不仅细胞生长活性好，而且分化时间快且分化率高。传代的细胞2 h后就出现典型神经元样分化，4-6 h达高峰值，分化进行到12 h时，细胞仍然为贴壁生长的状态。免疫组化显示诱导后神经元特异性烯醇化酶的高表达，同样说明表皮生长因子可诱导人骨髓间充质干细胞神经元样分化。Beclin-1被认为是一种抑癌基因，研究发现，在癌症细胞中Beclin-1的表达明显低于正常上皮细胞。通过杂交破坏BECN1基因会导致肿瘤发生，而BECN1的过表达则抑制肿瘤的发生。在乳腺癌和卵巢癌中细胞中，40%-70%出现BECN1缺失^[18]。相似的结果在肝癌、胃癌、结直肠癌、鼻咽癌、淋巴瘤、神经肿瘤中得到证实，说明Beclin-1的表达水平与肿瘤的发生和预后有密切的相关。而通过调节BECN1基因的表达，可以实现对自噬的调控。有实验发现，核因子κB p65和E2F转录因子可以上调BECN1基因的表达，并增加自噬的水平^[37-38]；而用mi-RNA沉默BECN1基因则会引起自噬水平的降低^[39]。

苏冀^[40]通过观察肝癌患者肝癌组织发现Beclin-1是人体内重要的抑癌基因，Beclin1的表达水平与肝癌的发展相关，检测Beclin-1的表达情况结合临床相关因素对肝癌的预后评估有帮助，并且Beclin-1可作为肝癌治疗的靶点之一。刘贵红^[41]观察到膀胱癌组织中Beclin-1 mRNA和蛋白的表达明显低于癌旁正常组织。Beclin-1 在膀胱癌中的表达水平同性别、年龄、肿瘤数量、肿瘤大小和是否有淋巴结转移无明显相关性；而临床分期越高、组织分化程度越低，Beclin-1的表达水平越低。Beclin-1表达越高，膀胱癌患者生存预后越好。也说明Beclin-1是膀胱癌一独立的生存预后因素。Beclin-1可作为膀胱癌诊断和预后判断的潜在生物标志物和治疗靶点。王赞宏^[42]观察到宫颈癌组织中Beclin-1的蛋白表达阳性率低于正常宫颈和宫颈上皮内瘤样病变组织，宫颈癌中常见Beclin-1表达下调和缺失；正常宫颈与宫颈上皮内瘤样病变间Beclin-1的表达差异无显著性意义；Beclin-1表达与宫颈癌的临床分期、病理类型、宫颈浸润深度、宫颈肿瘤大小、肿瘤大体类型均无相关性；在高中分化组中Beclin-1的蛋白表达率高于低分化组，在有淋巴结转移组表达率低于无淋巴结转组。新辅助化疗前后Beclin-1蛋白的表达差异无显著性意义。证实自噬基因Beclin-1与宫颈癌的发生、发展有关，自噬基因Beclin-1可有效调控肿瘤细胞周期，抑制宫颈癌细胞的恶性增殖，提高肿瘤细胞的自噬和凋亡能力，部分逆转其恶性表型，同时提高细胞的自噬和凋亡能力可能成为宫颈癌基因治疗的新靶点。段振玲^[43]发现自噬基因Beclin-1在上皮性卵巢癌组织中的表达下调，对自噬起调控作用的磷酸肌醇3激酶/磷酸化蛋白激酶B信号通路中的成分p110α、Ⅲ类磷酸肌醇3-激酶、磷酸化蛋白激酶B存在表达异常，可能与上皮性卵巢癌的发生、发展及临床预后有关；自噬基因Beelin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可使Ⅲ类磷酸肌醇3激酶表达上调，Ⅰ类磷酸肌醇3激酶及其下游的磷酸化蛋白激酶B表达下调；自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可诱导肿瘤细胞自噬和凋亡的发生，抑制SKOV3在体内、体外的增殖，针对自噬基因Beclin-1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性。

实验采用Western blot分别检验2组诱导分化前0.5 h，诱导0.5，1及4 h后人骨髓间充质干细胞中Beclin-1表达的结果。处理组细胞中Beclin-1的表达在诱导0.5 h后出现明现增加，但诱导1 h后开始降低，诱导至4 h时，已近阴性。对照组细胞中Beclin-1表达水平始终较低。这不但说明表皮生长因子体外可以诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，同时更重要的是表明自噬相关基因活性在诱导分化早期呈高表达，分化过程中逐渐降低直至维持在一个较低的水平上。

该结果一定程度上可以说明在表皮生长因子诱导分化后，人骨髓间充质干细胞的自噬活性早期为高表达状态。这可能是由于细胞诱导分化的早期出现了大量的增殖。但是随着对细胞诱导时间的延长，细胞的自噬活性逐渐减弱，直到诱导4 h后即稳定在较低水平。据推测此时的细胞己经逐渐失去了无限增殖能力。因此，如果针对人骨髓间充质干细胞诱导分化的早期，通过某些特殊方式来企图改变自噬基因表达的强度，从而来增加细胞自我更新和潜在增殖的能力，也许可以为脑卒中等神经系统疾病的治疗来提供足够的后备种子细胞。但是，人骨髓间充质干细胞神经元分化的过程中自噬表达变化的内在机制尚待于进一步研究。

人骨髓间充质干细胞神经元样细胞分化中自噬相关基因Beclin-1的表达

Autophagy-related gene Beclin-1 expression in neuron-like differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells

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